Neste trabalho, descrevemos um protocolo que utiliza o software SciGlass para segmentar dados de tomografia crioeletrônica. O SciGlass é um software baseado em realidade virtual que fornece uma interface imersiva e intuitiva para segmentar telegramas crio-ET, demonstramos que a RV é uma ferramenta viável que pode ser integrada em pipelines de segmentação crio-ET. O Cryo-ET está avançando rapidamente com, você sabe, inovações e foco.
Para amostras mais finas e métodos de coleta de dados mais rápidos, e usando algoritmos de aprendizado de máquina para melhorar a coleta de partículas segmentadas, você sabe, todos esses avanços culminam em uma melhor crio-ET e na adoção de insights biológicos realmente excelentes. O Cryo-ET enfrenta desafios como o cryo de baixo rendimento. Para amostras mais espessas que, como, 500 nanômetros e dificuldade de direcionar regiões de interesse devido ao baixo número de cópias.
Além disso, o processamento de dados continua sendo um gargalo, exigindo extensa anotação manual para coleta e segmentação de partículas, juntamente com conhecimento especializado, você sabe, você precisa em crio-ET, então tudo isso retarda o fluxo de trabalho geral. Descobrimos que a realidade virtual melhora a eficiência da segmentação em comparação com os métodos tradicionais. Seu ambiente imersivo complementa as abordagens automatizadas, preenchendo lacunas e reduzindo falsos positivos.
Além disso, esta plataforma de RV é altamente eficaz para treinamento e educação, tornando-a uma ferramenta versátil na análise de dados crio-ET. Nosso protocolo aborda a ineficiência da segmentação tradicional, que inclui processos manuais e lentos e difíceis, portanto, ao aproveitar, você sabe, a natureza imersiva e intuitiva da realidade virtual, pretendemos agilizar a segmentação, tornando o processo mais rápido e mais fácil de usar. Para começar, converta tomogramas crio-ET brutos em um formato de dados compatível com SciGlass, como pilhas TIFF.
Defina o sinal usando ImageJ para garantir que as partículas sejam brancas sobre pretas. Navegue até Processar, seguido de Melhorar contraste e marque Equalizar histograma"e Processar todas as fatias. Inicie o software de realidade virtual no computador.
Navegue até o menu "Arquivo" e selecione Criar projeto. Clique em Criar novo projeto e, em seguida, em Adicionar arquivos"no software. Navegue até o local dos arquivos TIFF e importe-os para o projeto.
Quando solicitado, confirme se os arquivos não fazem parte de uma série temporal depois de clicar em Não.Em seguida, atribua um nome ao projeto e clique em Salvar"para criar o projeto na lista de projetos. Clique duas vezes no projeto para abrir o tomograma e carregá-lo no ambiente interativo de realidade virtual. Para configurar a realidade virtual ou VR, conecte o fone de ouvido VR e os controladores manuais ao computador.
Siga as instruções na tela para calibrar o ambiente de RV. Ajuste o sistema para garantir que a área desejada para segmentação esteja no campo de visão do ambiente de RV e clique no botão de visualização na interface do software. Ajuste as opções de visualização, como contraste, janelas, brilho e controles deslizantes de limite para aprimorar o sinal e minimizar o ruído.
Use os controladores manuais para puxar o tomograma para mais perto ou afastá-lo para um melhor exame. Ative a ferramenta de corte usando o controlador esquerdo. Inspecione visualmente diferentes fatias dentro do tomograma.
Navegue pelo tomograma até a fatia desejada onde a segmentação começará. Ative a opção de região de interesse, ou ROI, no menu de anotação usando os controladores manuais. Uma caixa verde aparecerá no tomograma.
Ajuste o tamanho e a posição da caixa verde para a área a ser segmentada. Agora, bloqueie o ROI usando o controlador esquerdo. A ferramenta mudará para o modo de pintura para segmentação.
Aumente ou diminua o zoom do tomógrafo para uma segmentação precisa. Ajuste o tamanho do pincel com rotações no sentido horário ou anti-horário para um controle ideal. Segmente cuidadosamente a região de interesse, como as membranas mitocondriais, dentro da área tridimensional.
Ajuste o raio da esfera adequadamente ao executar a segmentação. Ative o modo de apagamento usando o gatilho do controlador secundário para corrigir erros de segmentação e use o mesmo movimento da segmentação para apagar. Repita o processo de segmentação para todas as regiões até que o tomograma esteja totalmente segmentado.
Após concluir a segmentação, clique no projeto concluído para destacá-lo. Clique na guia Projetos e selecione ROIs. Escolha exportar todo o volume ou uma região específica de interesse e especifique o local de exportação para os dados segmentados.
Agora, carregue e analise os dados segmentados exportados do SciGlass no software desejado de sua escolha para análise adicional dos dados segmentados. Depois de preparar os dados crio-ET, clique com o botão direito do mouse no projeto e clique em Adicionar dados de máscara, navegue até onde a segmentação inicial é salva e importe-a no mesmo projeto. Ative a anotação de ROI para fazer edições na segmentação inicial.
Por fim, adicione ou apague a segmentação para limpar a segmentação inicial. A retroprojeção ponderada de tomogramas reconstruídos a 16 angstroms por pixel revelou estruturas mitocondriais e membranosas após a redução do ruído e a falta de correção da cunha. A visualização em um ambiente imersivo de realidade virtual permitiu a inspeção 3D detalhada das membranas depois que a equalização do histograma aumentou o contraste.
A segmentação manual delineou estruturas mitocondriais e organelas com alta precisão usando ferramentas de RV, incluindo o mapeamento preciso de limites de membrana e ROIs. As renderizações 3D finais revelaram características mitocondriais detalhadas, como membranas externas e internas. E depósitos de fosfato de cálcio com malhas alisadas.
