Zebra balığı, RPE de dahil olmak üzere birçok farklı doku tipini yenilemek için içsel yeteneği bakımından benzersizdir. Bu protokol, RPE rejenerasyonunu ve RPE hastalığı ile ilgili mekanizmaları yönlendiren moleküler yolları tanımlamak için kullanılabilir. Çok yönlülük, bu metodolojinin birincil avantajıdır.
RPE rejenerasyonunu incelemeye ek olarak, bu protokol RPE dejeneratif süreçlerini ve RPE hasarının gözdeki bitişik dokular üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. İnsanlar da dahil olmak üzere memeliler, travma veya dejeneratif hastalıktan kaynaklanan büyük RPE yaralanmalarını onaramazlar. Zebra balığının RPE pro-rejeneratif faktörlerini keşfetmek için bir araç olarak kullanılması, memeli RPE rejenerasyonunu teşvik etmek için önemli bir adımdır.
Taze bir 10 milimolar MTZ çözeltisi hazırlamak için, gübrelemeden beş gün sonra, PTU olmadan sistem suyuna MTZ tozu ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalayarak iyice karıştırın. 10 milimolar MTZ çözeltisini bir masa üstü rotatör veya çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat soğutun. Zebra balığı larvalarını rpe65a: nsfB-eGFP transgeninden taramak için, transgenik eGFP pozitif larvalarını, 488 nanometre uyarma lazerine sahip bir floresan stereo mikroskop kullanarak transgenik olmayan eGFP negatif larvalardan ayırın.
Uyanın, larvaları trikainsiz taze 1.5X PTU ile doğrudan bir Petri kabına pipetleyerek hemen taradı. Taramanın tamamlanmasının ardından, eGFP pozitif larvaları iki Petri kabı grubuna, MTZ tedavisi almak için bir gruba ve bir grup da unblated kontrol olmak üzere ayırın. Daha sonra, ablatlanmış tedavi kaplarından 1.5X PTU'yu çıkararak retinal pigment epitelini ablate edin ve taze yapılmış 10 milimolar MTZ çözeltisini ekleyin.
Ayrıca unblated kontrol kaplarından 1,5X PTU'yu çıkarın ve PTU olmadan tatlı sistem suyu ekleyin. 10 milimolar MTZ çözeltisini tam olarak 24 saat sonra çıkarın ve PTU olmadan tatlı sistem suyu ekleyin. MTZ negatif tabaklarda PTU olmadan tatlı sistem suyunu değiştirin.
Döllenmeden sonraki dört günde eGFP pozitif larvaları tarayın. eGFP, döllenmeden dört gün sonra görülebilir, ancak beşinci günde sinyal yoğunluğundan daha sönük görünür. Farmakolojik tedavi için eGFP pozitif larvaları, Petri yemekleri yerine kuyu başına en fazla 10 larva yoğunluğunda altı kuyucuklu plakalara yerleştirin.
Ablatlanmış ve ablatlanmış larvalar için ayrı altı kuyucuklu plakalar belirleyin. Gerekli 15 mikromolar IWR-1 veya hacim uyumlu DMSO araç kontrol ön işlemlerinin hacmini ve buna göre konik tüplere aliquot 1.5X PTU'nun hacmini belirleyin. 15 mikromolar IWR-1'in son konsantrasyonu için 1,5X PTU'ya IWR-1 stoğu ekleyin.
1,5X PTU'ya eşleşen bir DMSO stok hacmi ekleyin. Vorteksleme ile iyice karıştırın ve bileşiklerin çözünmesini görsel olarak onaylayın. Altı delikli plakalarda eGFP pozitif larvalarından 1.5X PTU'yu çıkarın ve taze yapılmış% 0.06 DMSO veya 15 mikromolar IWR-1 tedavilerinin kuyusu başına beş mililitre ekleyin.
Ertesi gün RPE'yi abartın. Döllenmeden sonraki beş günde, hem ablatlanmış hem de ablatlanmış altı kuyucuklu plakalar için gerekli farmakolojik ve araç kontrol işlemlerinin hacmini belirleyin ve PTU'suz tatlı sistem suyunun veya konik tüplere 10 milimolar MTZ çözeltisinin uygun hacimlerini belirleyin. Daha önce yapıldığı gibi ilgili konik tüplere IWR-1 ve DMSO stok çözümleri ekleyin.
Vorteksleme ile iyice karıştırın ve bileşiklerin çözünmesini görsel olarak onaylayın. 1.5X PTU'da% 0.06 DMSO ve 15 mikromolar IWR-1 ön işlemlerini, belirlenmiş unblated ve ablated altı kuyucuklu plakalardan çıkarın. PTU ve MTZ çözelti arıtmaları olmadan uygun tatlı sistem suyuyla doldurun.
Tam 24 saat sonra 10 milimolar MTZ çözeltisinde% 0.06 DMSO ve 15 mikromolar IWR-1 işlemlerini çıkarın ve PTU'suz tatlı sistem suyunda arıtmalarla doldurun. %0,06 DMSO ve 15 mikromolar IWR-1 işlemlerini, yarım delikli plaka üzerinde PTU olmadan tatlı sistem suyunda doldurun. Genetik ablasyon sonrası larva bakımı için stereo mikroskopta iletilen ışık aydınlatmasını kullanarak in vivo ablasyonun başarısını ve kapsamını izleyin.
Fiji'yi kullanarak ilgilenilen RPE bölgesini veya yatırım getirisini oluşturmak için sekiz bitlik bir TIFF görüntüsü açın, görüntüyü yatay olarak dönüştürmeyi ve çevirmeyi seçerek sırt tarafı yukarı ve distal kalacak şekilde yeniden yönlendirin. Son komut için, söz konusu görüntü için gereken yönselliğe en uygun seçeneği belirleyin. Analiz, araçlar, YG yöneticisini seçerek YG yöneticisini başlatın.
Görüntüyü kullanın, yakınlaştırın ve DAPI ile Brightfield kanalları arasında geçiş yapın. Verimlilik için klavye kısayollarını kullanın. RPE'nin apikal tarafının dış sınırlayıcı membranın ucundan bitişik olduğu noktayı tanımlayın ve bu anatomik dönüm noktasını ROI başlangıç noktası olarak kullanın.
Apikal ve bazal RPE sınırlarını tanımlamak için hem DAPI hem de Brightfield görüntü kanallarını ve görüntü yakınlaştırma işlevini kullanarak Fiji araç çubuğundaki çokgen seçimleri aracıyla RPE yatırım getirisini oluşturun. ROI'nin dorsal ve ventral uçlarını köreltmek veya yuvarlamak yerine keskin bir noktaya getirin. YG yöneticisinde ekle'ye tıklayarak YG'yi ekleyin.
Daha fazlasını seçerek YG dosyasını kaydedin ve YG yöneticisine kaydedin. Rpegen'e çift tıklayın. m dosyası düzenleyici bölmesinde açılır.
Rpegen'in kullanıcı tanımlı değişken bölümünün altında. m dosyasında, ROI dosyalarını, tiff görüntü dosyalarını ve çıktı dosyalarının kaydedilmesi gereken yerleri içeren klasörler için dizin konumlarını girin. Dışa aktarılacak mat dosyasının grup adını ve TIFF görüntü yığınındaki Brightfield kanalının konumunu girin.
MATLAB'ın üst kısmındaki düzenleyici menüsündeki çalıştır düğmesine tıklayarak komut dosyasını çalıştırın. MAT dosyasını kaydettikten sonra, üç panelli bir şekil görünecek ve ayrıca her görüntü çalıştırması için çıktı dizinine PDF olarak kaydedilecektir. Bu kalite kontrol PDF'leri çıktı klasörüne kaydedilene ve son rakam kaybolana kadar bekleyin.
Tek tek PDF'leri açın ve tüm YG'lerin Brightfield görüntüleriyle eşleştiğini doğrulayın. rpegen_permplot çift tıklayın. m dosyası yeni bir düzenleyici sekmesinde açılır.
Tek kullanıcı tanımlı değişkenler bölümünün altında, rpegen'i çalıştırırken MAT dosyalarını içeren çıktı klasörünün dizin konumunu girin. m betiği. Yüklenecek her MAT dosya adını girin.
Düzenleyici menüsündeki bölüm çalıştır düğmesine tıklayarak komut dosyasının bu bölümünü çalıştırın. İkinci bölümde, veri A ve veri B değişkenlerinde istatistiksel bir karşılaştırma için iki grubun adlarını girin ve reps değişkenindeki permütasyon simülasyonu tekrarlarının sayısını belirtin. İşlem süresini azaltmak için bu demo için yalnızca 2.000 temsilci kullanıldı.
Düzenleyici menüsündeki bölüm çalıştır düğmesine tıklayarak komut dosyasının bu bölümünü çalıştırın. Isı haritası figürünü çalıştırın ve sonuçları ve P değeri bölümlerini çalıştır düğmesini kullanarak bağımsız olarak çalıştırın. Döllenme sonrası beş günlük larvaların tüm montaj hasarı, genetik ablasyon taraması sırasında RPE'de parlak transgen ekspresyonu gösterdi.
Döllenme sonrası altı günlük larvaların transvers kriyoskopisi, transgen ekspresyonunun, RPE'nin merkezi 2 / 3'ü ile sınırlı olan en parlak ekspresyon ile olgun RPE hücreleri ile sınırlı olduğunu gösterdi. Ok uçları apikal mikrovillusları gösterir. Yaralanma sonrası bir günlük ablatlanmış larvaların transvers kriyoseksiyonu, eGFP pozitif hücre morfolojisinin bozulmasını ortaya çıkardı.
Oklar piknotik çekirdekleri gösterir. Döllenme sonrası yedi günlük larvaların tüm binek hasarları göz boyunca RPE pigmentasyonu gösterdi ve ablatlanmış iki günlük yaralanma sonrası larvalar, merkezi RPE'de pigment bulunmayan bir ablasyon bölgesi gösterdi. RpEGEN kullanılarak oluşturulan bir grafik, RPE'nin uzunluğu boyunca döllenmeden dokuz günlük döllenme sonrası DMSO ve IWR-1 grupları arasında benzerlik gösterdi.
Grafik, ablatlanmış dört günlük yaralanma sonrası DMSO ve IWR-1 gruplarında genel olarak daha hafif piksel yoğunluğu gösterdi ve bu, diğer herhangi bir tedavi grubuna kıyasla ablatlanmış IWR-1'de en hafif görünüyordu. Santral RPE pigmentasyonundaki farklılıklar, ablatlanmış IWR-1 ile tedavi edilen larvaları ablated DMSO ile tedavi edilen kontroller karşılaştırırken anlamlıydı. Bu zebra balığı ablasyon paradigmasını kullanarak, burada gösterdiğimiz rüzgar sinyalizasyonu gibi, RPE rejenerasyonunun kritik düzenleyicileri olan çeşitli moleküler sinyal yollarını tanımlayabildik.
