ゼブラフィッシュは、RPEを含む多くの異なる組織タイプを再生するその固有の能力においてユニークです。このプロトコルは、RPE再生およびRPE疾患関連メカニズムを駆動する分子経路を同定するために使用することができる。汎用性は、この方法論の主な利点です。
RPE再生の研究に加えて、このプロトコルは、RPE変性プロセスおよび眼内の隣接組織に対するRPE損傷の影響を調べるために利用することができる。ヒトを含む哺乳類は、外傷または変性疾患に起因する大きなRPE傷害を修復することができない。RPE促進再生因子を発見するためのツールとしてゼブラフィッシュを使用することは、哺乳類のRPE再生を促進するための重要なステップです。
新鮮な10ミリモルのMTZ溶液を調製するために、受精後5日間、PTUを含まない系水にMTZ粉末を加え、摂氏37度で1時間激しく振とうすることによって十分に混合する。10ミリモルのMTZ溶液を卓上回転子またはシェーカー上で室温で1時間冷却する。rpe65a:nsfB-eGFP導入遺伝子からゼブラフィッシュ幼虫をスクリーニングするために、488ナノメートル励起レーザーを用いた蛍光実体顕微鏡を用いて、トランスジェニックeGFP陽性幼虫を非トランスジェニックeGFP陰性幼虫から分離した。
スクリーニングされた幼虫を、トリカインを含まない新鮮な1.5倍PTUのペトリ皿に直接ピペッティングすることによって直ちに起こす。スクリーニングの完了時に、eGFP陽性幼虫をさらに2群のペトリ皿に分離し、1群はMTZ処理を受け、1群はアブレーションなし対照とする。次に、アブレーション処理皿から1.5倍のPTUを除去して網膜色素上皮をアブレーションし、新しく作られた10ミリモルのMTZ溶液を加える。
また、アブレーションされていないコントロールディッシュから1.5倍のPTUを取り除き、PTUなしで新鮮なシステム水を追加します。正確に24時間後に10ミリモルのMTZ溶液を除去し、PTUなしで新鮮なシステム水を加える。MTZネガティブディッシュのPTUなしで新鮮なシステム水を交換してください。
受精後4日目にeGFP陽性幼虫をスクリーニングする。eGFPは受精後4日目に見えるが、5日目にはシグナル強度よりも薄暗く見える。薬理学的治療のために、eGFP陽性幼虫をペトリ皿の代わりに6ウェルプレートに1ウェルあたり10匹以下の幼虫の密度で配置する。
アブレーションされた幼虫とアブレーションされていない幼虫のために別々の6ウェルプレートを指定する。15マイクロモルIWR-1の体積または必要なDMSOビヒクル制御前処理と一致する体積を決定し、それに応じて1.5倍のPTUを円錐形チューブにアリコートします。IWR-1ストックを1.5X PTUに加え、最終濃度15マイクロモルのIWR-1とする。
DMSO ストックの一致したボリュームを 1.5 倍の PTU に追加します。ボルテックス処理によりよく混合し、化合物の溶解を目視で確認する。6ウェルプレート中のeGFP陽性幼虫から1.5倍のPTUを除去し、新しく作られた0.06%DMSOまたは15マイクロモルIWR-1処理のウェルあたり5ミリリットルを加える。
翌日、RPEをアブレーションする。受精後5日目に、アブレーションされていない6ウェルプレートとアブレーションされた6ウェルプレートの両方に必要な薬理学的およびビヒクルコントロール治療の量を決定し、PTUなしの淡水または10ミリモルMTZ溶液のいずれかの適切な容量を円錐形のチューブにアリコートします。IWR-1およびDMSOストック溶液を、以前に行ったようにそれぞれの円錐管に加える。
ボルテックス処理によりよく混合し、化合物の溶解を目視で確認する。1.5X PTU中の0.06%DMSOおよび15マイクロモルIWR-1前処理を、指定された非アブレーションおよびアブレーションされた6ウェルプレートから除去する。PTUおよびMTZ溶液処理なしで適切な淡水で補充する。
正確に24時間後に10ミリモルMTZ溶液中の0.06%DMSOおよび15マイクロモルIWR-1処理を除去し、PTUを含まない淡系水で処理を補充する。0.06%DMSOおよび15マイクロモルのIWR-1処理を、アブレーションされていない6ウェルプレート上のPTUを含まない淡水に補充する。遺伝子アブレーション後の幼虫維持のために、実体顕微鏡上の透過光照明を使用して、インビボでのアブレーションの成功および程度を監視する。
フィジーを使用してRPE関心領域またはROIを生成するには、8ビットTIFF画像を開き、画像、変換、および水平反転を選択して、背側が上向きで遠位が残るように画像の向きを変えます。最後のコマンドでは、その画像に必要な方向性に最も適したオプションを選択します。分析、ツール、ROI マネージャーを選択して、ROI マネージャーを開始します。
画像、ズーム、DAPI チャンネルとブライトフィールドチャンネルの切り替えを使用します。効率を上げるためにキーボードショートカットを使用してください。RPEの頂端側が外側制限膜の先端から隣接する点を特定し、この解剖学的ランドマークをROIの出発点として使用します。
フィジーツールバーのポリゴン選択ツールを使用してRPE ROIを作成し、DAPIとブライトフィールドの両方の画像チャンネルと画像ズーム機能を使用して、頂端と基底RPEの境界を識別します。ROIの背側端と腹側端を鈍くしたり丸めたりするのではなく、鋭い点に持って行きます。ROI マネージャーの [追加] をクリックして、ROI を追加します。
[詳細] を選択して ROI ファイルを保存し、ROI マネージャー内で保存します。rpegenをダブルクリックします。エディタペインで開くmファイル。
rpegen のユーザー定義変数セクションの下。m ファイルで、roi ファイル、tiff イメージ ファイル、および出力ファイルの保存場所を含むフォルダーのディレクトリの場所を入力します。書き出すマットファイルのグループ名と、TIFF 画像スタック内のブライトフィールドチャンネルの位置を入力します。
MATLABの上部にあるエディタメニューの実行ボタンをクリックしてスクリプトを実行します。MATファイルを保存した後、3つのパネル図が表示され、各画像実行の出力ディレクトリにPDFとして保存されます。これらの品質管理PDFが出力フォルダに保存され、最後の図が消えるまで待ちます。
個々の PDF を開き、すべての ROI が明視野画像と一致することを確認します。rpegen_permplotをダブルクリックします。新しいエディタタブで開くmファイル。
セクション 1 ユーザー定義変数で、rpegen の実行時の MAT ファイルを含む出力フォルダーのディレクトリー・ロケーションを入力します。m スクリプト。ロードする各 MAT ファイル名を入力します。
スクリプトのこのセクションを実行するには、エディタメニューの[セクションの実行]ボタンをクリックします。セクション2で、統計比較の2つのグループの名前をデータA変数とデータB変数に入力し、reps変数の順列シミュレーションの繰り返し回数を指定します。このデモでは、処理時間を短縮するために 2,000 人の営業担当のみが使用されました。
スクリプトのこのセクションを実行するには、エディタメニューの[セクションの実行]ボタンをクリックします。ヒートマップ図を実行し、セクション実行ボタンを使用して結果とP値セクションを個別にグループ化します。受精後5日間の幼虫の全マウント損傷は、遺伝子切除のスクリーニング時にRPEにおいて明るい導入遺伝子発現を示した。
無切除受精後6日間の幼虫の横凍結切除は、導入遺伝子発現がRPEの中央2/3に限定された最も明るい発現を有する成熟RPE細胞に制限されたことを示した。矢印は頂端微絨毛を示す。切除された傷害後1日幼虫の横凍結切除は、eGFP陽性細胞形態の破壊を明らかにした。
矢印はピクノティック核を示す。アブレーションされていない受精後7日間の幼虫の全山損傷は、眼全体にRPE色素沈着を示し、アブレーションされた傷害後2日間の幼虫は、中央RPEに色素が存在しないアブレーションゾーンを示した。RpEGENを用いて生成されたプロットは、RPEの長さにわたって、無添加の受精後9日間のDMSO群とIWR-1群との間の類似性を示した。
プロットは、アブレーションされた傷害後4日間のDMSOおよびIWR-1群において全体的に明るいピクセル強度を示し、これは他の任意の治療群と比較してアブレーションされたIWR-1において最も軽く見えた。中枢RPE色素沈着の差は、アブレーションされたIWR-1処理幼虫をアブレーションされたDMSO処理対照と比較すると有意であった。このゼブラフィッシュアブレーションパラダイムを使用して、RPE再生の重要な調節因子である、ここで示した風のシグナル伝達など、いくつかの分子シグナル伝達経路を同定することができました。
