ACT1-CUP1 Testi, bir mutasyonun haberci öncesi RNA eklemeyi etkileyip etkilemediğini belirleyebilir ve hangi ekleme adımının en çok etkilendiğine dair bir gösterge verebilir. ACT1-CUP1 Testi, ekleme faktörü mutasyonunu karmaşık ekleme süreci üzerindeki etkisine bağlar. Büyüme fenotipinin basit okumasını kullanır ve geniş bir duyarlılık aralığına sahiptir.
ACT1-CUP1 Testi yapılırken zamanın verimli kullanılması önemlidir. Strese bağlı büyüme sapmalarını en aza indirmek için beş ila 10 suşluk bir tahlille başlayın. Süreci gösterecek olan ben ve laboratuvarımdan bir lisans araştırmacısı olan Isabelle Marasigan olacak.
Başlamak için, her şişeye 790 miligram agar ve bir karıştırma çubuğu ekleyin. Büyük bir beherde, dökülecek tüm bakır plakalar için lösin bırakma büyüme ortamını hazırlayın. Bu, dökülecek her plaka için 265 miligram maya azot bazı, 64 miligram damlama karışımı, eksi lösin ve 34 mililitre deiyonize su içerir.
Çözünmesi için karıştırın Ardından, hazırlanan her 100 mililitrelik şişeye 34 mililitre lösin damlama büyüme ortamı çözeltisi ekleyin ve alüminyum folyo ile kapatın. Daha sonra, otoklav için önerilen sıvı döngüsünü kullanarak agar'ı sterilize etmek ve çözmek için otoklav. Otoklavlamadan sonra mümkün olan en kısa sürede, her şişeye dört mililitre% 20 glikoz ekleyin.
Ardından, her biri amaçlanan şişeye iki mililitre bakır sülfat seyreltisini eklemek için tüp etiketini şişe etiketiyle eşleştirin. Bir karıştırma plakası kullanarak, yaklaşık 30 saniye boyunca karıştırın ve kabarcıkları önleyerek etiketli plakaya 35 mililitre dökün veya pipet dökün. Maya suşu başına, steril, 50 mililitrelik konik bir tüpe dokuz mililitre lösin bırakma büyüme ortamı ve bir mililitre% 20 glikoz ekleyin.
Steril bir çubuk veya pipet ucu kullanarak küçük bir maya örneği toplayın ve ortamı aşılayın. Ardından, tüm gece kültürlerini 180 RPM ve 30 santigrat derecede sallayın. Daha sonra, suş başına 900 mikrolitre su içeren bir küvete 100 mikrolitre kültür ekleyin.
Daha sonra, optik yoğunluğu bir spektrofotometre ile ölçün ve iki mililitrelik son hacimde 0,5 optik yoğunlukta olması gereken seyreltmeyi hesaplayın. Daha sonra, her bir suşu %10 gliserol içinde 0,5 optik yoğunluğa seyreltin ve hücre yoğunluğunun istenen aralıkta olduğunu doğrulamak için optik yoğunluğu yeniden ölçün. Steril bir çalışma yeri kurduktan sonra, bir Bunsen brülörü aydınlatın.
48 pimli bir Çoğaltıcı için, her seyreltilmiş suşun 200 mikrolitresini 96 delikli bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna pipetleyin ve altıya sekiz ızgaradaki boş alanları 200 mikrolitre% 10 gliserol ile doldurun. Daha sonra, sterilize etmek için çoğaltıcıyı% 95 etanol ve alevden oluşan sığ bir kaba batırın. Isı hücrelerinin şoke olmasını önlemek için alev söndükten sonra en az iki dakika soğumaya bırakın.
Brülörün yanına dört plaka yerleştirin ve kapakları çıkarın. Çoğaltıcıyı 96 delikli plakaya batırın ve tek bir hızlı hareketle yukarı kaldırın. Ardından, yavaşça plakanın üzerine yerleştirin ve iyi bir aktarımı kolaylaştırmak için hafifçe ileri geri sallayın.
Tek bir hızlı hareketle yukarı kaldırın ve 96 delikli plakaya tam olarak aynı yönde yerleştirin. Bir plaka kaplandıktan sonra, yana doğru yumuşak bir hareketle hareket edin, ancak yine de alevin sterilizasyon şemsiyesi içinde hareket edin. Kapakları yerleştirmeden önce plakaları tamamen kurumaya bırakın, genellikle üç ila beş dakika.
Ardından, plakaları üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Plakaları inkübatörden çıkardıktan sonra, görsel olarak inceleyin. Büyüme testi, bakır konsantrasyonu arttıkça, daha düşük eklemeli suşların, bakır konsantrasyonunun ölümcül hale geldiği noktaya kadar azalmış akıcılık gösterdiğini göstermiştir.
Maya arka planı, bozulmuş bir ADE2 geni içerir ve kolonilerin değişen kırmızı tonları olmasına neden olur. Ve olgun koloniler koyu kırmızı renkteydi. Kaplama sırasında, çoğaltıcı sola veya sağa hareket ederken yukarı kaldırılırsa, bir açıyla getirilirse veya plakanın üzerinde çalkalanırsa, oval şekilli koloniler veya küçük hücre çözeltisi damlacıklarından mikro koloniler oluşturmak mümkündür.
A3c muhabiri ile maya, 0.15 milimolar bakıra kadar hayatta kalırken, vahşi tip muhabir hücreleri, test edilen bakır konsantrasyonları aralığının sonuna kadar canlılığını korudu. Tahlil sonuçları, U6 snRNA pozisyonu 57'deki farklı bazların, 5 asal veya dal bölgesi mutasyonu ile kombinasyon halinde splisozom üzerinde benzersiz etkilere sahip olduğunu göstermiştir. U57c, A3c ve şube bölgesi G muhabirleri ile kombinasyon halinde bakır toleransını azaltan bir katkı mutasyonu iken.
Buna karşılık, U57a bakır toleransını arttırır çünkü ikinci adıma ilerlemeyi teşvik eder. Ekleme pertürbasyonu ACT1-CUP1 ile tanımlandıktan sonra, araştırmalar primer uzantısı ve EMSA'lar ve enzimatik problama yoluyla bozulmuş moleküler etkileşimin tanımlanması gibi daha nicel yöntemlere geçebilir. ACT1-CUP1, maya eklisozomunun sağlamlığı ve seçiciliği hakkındaki anlayışımızı geliştiren temel bir tahlil olmuştur.
Ve spliceosomal fonksiyon anlayışımızı genişletmeye devam ediyor.
