This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

Dikkat: Deneyler radyoaktif izotop 32 P kullanımını içerir ve tüm uygun güvenlik koşulları sağlanana kadar hiçbir çalışma yapılmalıdır. Genellikle personel güvenlik kursuna katılmak ve önceki radyoaktif reaktifler kullanılarak deneylere denetimli uygulama geçmesi gerekmektedir. reaksiyonu yaparken kişisel koruyucu donanımları giyiniz (termolüminesans dozimetre, koruyucu gözlük, eldiven, radyasyon odası laboratuvar mont, tam uzunlukta pantolon, ayakkabı-ayak kapalı). Deney 1. Malzemenin Hazırlanması <ol><li> Transkripsiyon deneyi için proteinler Gerekli elde edin. <ol><li> Burada anlatılan deney için, aşırı üretim ve E. arındırmak E. coli rnap laboratuvarda ticari bir kaynaktan (Malzeme Listesi) den 11 anlatıldığı ya da elde olarak. Not: Her ikisi de benzer sonuçlar vermektedir. Doğal veya afinite etiketli rnap saflaştırılması için diğer metotlar da 12,13 kullanılabilir. Sigma / nusa faktörleri D olarak elde edilebilirBir önceki çalışmalarında 14,15 olarak escribed. </li></ol></li><li> Dietilpirokarbonat hazırlanması (DEPC) ile muamele su Not: Alternatif olarak, RNaz içermeyen su ticari kaynaklardan (Malzeme listesi) elde edilebilir. <ol><li> saf su, 1 L 1 ml dietil pirokarbonat (DEPC) ekleyin (0.1% h / h) ve gece boyunca karıştırın. </li><li> İki kez otoklav DEPC su ve ipuçları. </li></ol></li><li> DNA şablonu hazırlama <ol><li> Bir plazmid arındırma kiti, üretici talimatlarına uygun olarak (Malzeme listesi) kullanılarak plazmid pSG1154 16 ve / veya pIA226 17 saflaştınlır. </li><li> Çoğaltma transkripsiyonu deneyleri için şablon yükseltmek için (p ​​ksil promotör bölgesini kapsayan bir 360 bp&#39;lik bir fragmanı), 25 ul 2x PCR karışımı (Malzeme listesi), dahil olmak üzere, buz üzerinde bir PCR reaksiyonu monte 2 ul primerlerin her biri (5 uM) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(ileri doğru) ve 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (ters), 1 ul pSG1154 plazmid PRAyırma (250 uM) ve 20 ul arıtılmış, su). <ol><li> Veya alternatif olarak, tek bir yuvarlak transkripsiyon analizleri için, pIA226 17&#39;den λ P R promotör bölgesini kapsayan bir 447 bp fragman amplifiye. 25 ul 2x PCR karışımı, 2 ul primerlerin her biri (5 uM) ile buz üzerinde bir PCR reaksiyonu başlatacak: 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(ileri doğru) ve 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (ters), 1 ul pIA226 17 plazmid preparat (250 uM) ve 20 ul arıtılmış, su). Not: Bu şablon kopyalama başlangıç ​​sitesinden 26 inci nükleotid 26 nt pozisyonuna kadar sitozin yoksundur. Bu nedenle, transkripsiyon inisiyasyon, promotör açıklığını sağlayacak bu şablonu kullanarak ve sadece ATP, UTP ve GTP reaksiyonunda mevcut olduğunda istikrarlı transkripsiyon uzama kompleksi (EC) oluşturmak için nt +26 at durdurduklarını. </li></ol></li><li> aşağıdaki koşullar ile bir PCR reaksiyonu kurmak: 95 °; 30 dakika boyunca tekrar 30 sn, 30 saniye için 30 saniye için 50 ° C, 72 ° C, ısıtılmıştır. </li><li> imalatçının talimatlarına bir PCR temizleme kiti (Malzeme listesi) olarak kullanarak ürünü saflaştırmak ve transkripsiyon tahlilinde 100 ul transkripsiyon tamponu içinde elüte. </li><li> Bir fluorospectrometer (Malzeme Listesi) kullanarak şablon DNA konsantrasyonu belirleyin. </li></ol></li><li> NTP Hazırlık Not: NTP&#39;ler farklı ticari kaynaklardan (Malzeme Listesi) elde edilebilir. <ol><li> -20 ° C&#39;de 1.5 ml tüpler (her bir tüp içinde 50 ul) ve deposuna 1 M stok, kısım solüsyonun 1 mi olmak için DEPC ile muamele edilmiş su içinde (≥99% saf) NTP&#39;leri çözülür. </li><li> Sipariş 32P UTP (3,000 Ci / mmol) deney öncesinde. Α- 32P 14.29 gün gibi kısa bir yarı ömre sahiptir. Not: a ile etiketlenmiş UTP kullanarak, farklı uzunlukta bantlarının yoğunluğunu karşılaştırarak önler. </li></ol></li><li> RNA merdiveni hazırlanması <ol><li> takip birleştirinOda sıcaklığında ing Reaksiyon: 0.5 ug RNA şablonu karışımı (Malzeme listesi), 80 mM HEPES tamponu pH 7.5, 12 mM MgCl2, 10 mM NaCI, 10 mM DTT, 2 mM ATP / TO / GTP, 0.5 mM UTP, 2 ul 32 P UTP, 0.5 ul T7 rnap (Malzeme listesi), a- 20 ul su DEPC ile tedavi. </li><li> Reaksiyon, 1 saat boyunca 37 ° C &#39;de devam etmesine izin. hemen kullanın ya da -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> RNA sıralaması Gel 2. Hazırlık <ol><li> Jel hazırlanması <ol><li> Bir sıralama jel aparat iki kez% 70 etanol ve saf su ile (Malzeme Listesi) tabak temizleyin ve bir tarak ve iki ayırıcılar ile hücre birleştirin. Not: bir plaka Aşama 4.2 jel çıkarılmasını kolaylaştırmak için bir silikonlaştırma reaktifi (Malzeme listesi) ile kaplanabilir. </li><li> 22 ml su içinde 33.6 g ürenin çözülmesini ve 5x Tris / borat / EDTA (TBE) tamponu (54 g tris (hidroksimetil) aminometan 16.4 mi, 27.5 g borik asit, 1 M etilendiamintetraasetik asit (10 miManyetik bir karıştırıcı ile EDTA), 1 L su içinde pH 7.4). </li><li> (19: 1)% 40 akrilamid / bis-akrilamid çözeltisi 16 ml ekleyin üre solüsyonuna ve 0.45 um&#39;lik bir filtreden filtre. </li><li> 514 ul% 10 ekleme (a / h), süzüldü çözeltiye 51,4 ​​ul N, N, N &#39;, N&#39; tetrametiletilendiamin (TEMED) takip su içinde taze hazırlanmış amonyum persülfat. </li><li> Yavaşça aşırı havalandırma önlemek ve alt enjeksiyon deliğinden yatay konumlandırılmış önceden paketlenmiş sıralama hücreye hemen ve sorunsuz enjekte jel çözümü ters çevirin. Enjeksiyon sırasında kabarcıkları yapmaktan kaçınmaya özen gösterin. </li><li> Jel tamamen transkripsiyon tayininde kullanılmadan önce ayarlanmış kadar 1-1.5 saat izin verin. dizi hücre üzerine suda ıslak doku ile sarılan jeli, iki ya da üç gün boyunca oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol></li></ol> 3. transkripsiyon reaksiyonu <ol><li> Transkripsiyon Uzama duraklatma Deneyi <ol><li> bir transkripsiyon uzatma kompleksinin oluşması <ol><li> 1.5 ml tüp rnap çekirdek enzim (transkripsiyon tamponu içinde 1 uM stok) 1 ul ekle. </li><li> Rnap ve rnap holoenzyme oluşturmak için 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe (transkripsiyon tamponu içinde 3 uM stok σ 70) saflaştırılmış sigma 70 faktör 1 ul ekle. </li><li> Rnap holoenzyme transkripsiyon tamponu içinde 3 ul 500 mM saflaştınldı hedef DNA (pIA226 PCR ürününden λ P R promoteri) ekleyin ve açık kompleks oluşturmak için 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Işlenmiş DEPC 400 mM Tris-HCI, 1.6 M KCI, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT,% 50 gliserol, pH 7.9: 10x transkripsiyon tamponu 5 ul (Malzeme listesi ile başka bir 1.5 ml tüp içinde, reaksiyon bileşenlerinin bir karışımını hazırlamak su), 250 uM her bir GTP ve UTP, 1 mM ATP, 1 ul 2 ul ve α- 32P UTP (3,000 Ci / mmol), 1 ul. 41 ul DEPC arıtılmış su ekleyin. Yok hayırte: RNaz inhibitörü (Malzeme Listesi) RNaz kontaminasyonu en aza indirmek için kullanılabilir. </li><li> Açık kompleksi içeren tüp kanşım çözeltisini transkripsiyon uzatma kompleksi nt +26 durdu oluşturmak için 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> oda sıcaklığında (~ 21 ° C) reaksiyon getirin ve 50 ug / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar 2.5 mg / ml rifampicin 1 ul ekle. </li><li> Reaksiyon karışımına nusa saflaştırılarak 0.1 mM 1 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> 50 ul nihai hacim yapmak ve bir zamanlayıcı, tepkime zamanı ölçmek için, reaksiyon karışımına 250 uM CTP 2 ul ekle. </li><li> Aktarım 5 30 RNA, jel yükleme tampon maddesi (% 95 formamid,% 0.05 bromofenol mavisi ve% 0.05 ksilen siyanol) eklenir ve 2 ul halinde, reaksiyon çözeltisi ul, 60, 120, 240, 480 ve 1200 sn, reaksiyonun sönmesi için. </li><li> Bir radyoaktif atık cont 32 P UTP ipuçları ve tüpler bertaraf edinAiner. </li></ol></li></ol></li><li> Transkripsiyon Başlatma Deneyi <ol><li> Açık Kompleksi Oluşumu <ol><li> 0.5 uM 70 σ saflaştırılmış sulandırmak. </li><li> Adımları tekrarlayın 3.1.1.1 0.5 mcM (yerine 3 mcM) 70 σ saflaştırılmış ve DNA şablonu (pSG1154 PCR ürününden P ksil promotör bölge) kullanılarak 3.1.1.3 için. </li></ol></li><li> transkripsiyon başlatma tahlili <ol><li> Önleyicisi holoenzyme oluşumunu bozar mümkün olup olmadığını incelemek için Adımlar 3.1.1.2 ve 3.1.1.3 ardından (basamak 3.1.1.1 sonra) a 70 ilavesinden önce rnap çekirdekli enzime rnap holoenzyme oluşumunu önlemek için tasarlanmış inhibitörü ekleyin. </li><li> Seçenek olarak ise, Aşama 3.1.1.2 sonra, rekabetçi rnap bağlanma 70 σ engelleyebildiği olup olmadığını incelemek için önleyici. </li><li> Bunun yerine önleyicisi s, DMSO, inhibitörün aynı miktarda solvent kullanarakKontrol tepkimelerinde tak. </li></ol></li><li> Reaksiyonun tamamlanması <ol><li> -20 ° C&#39;de 1 mg / ml stok, bir stok konsantrasyona su içinde heparin eritin. Not: Heparin açık kompleksi oluşmuş değil rnap tecrit DNA&#39;nın bir rakip. Açık kompleks oluşturulduktan sonra, heparin rnap DNA bağlama sitesi girerek önceden oluşturulmuş, açık kompleksinden transkripsiyonunu inhibe edilemez. Bu nedenle heparin yalnızca tek tur deneyler için gerekli olan; Çoklu boyunca deneyleri için gerekli değildir. </li><li> 5 ul 10x transkripsiyon tamponu (Malzeme listesi), 1 mg / ml heparin solüsyonu 1 uL, 10 mM, her ATP, GTP, CTP, 2.5 mM UTP 1 ul, ve a-32 1 ul tepkime karışım hazırlayın P UTP (3,000 Ci / mmol) eklenir. 45 ul DEPC arıtılmış su ekleyin. </li><li> Transkripsiyon açık kompleksi, darbe dönüş reaksiyon karışımı karıştırın ve 20 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> bu nedenle reaksiyon 10 ul transferRNA, jel yükleme tampon maddesi (% 95 formamid,% 0.05 bromofenol mavisi ve% 0.05 ksilen siyanol) eklenir ve 5 ul içine dökülmesinden, reaksiyonun sönmesi için. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. RNA Jel Koşu ve Kalkınma <ol><li> Denatüre edici poliakrilamid jeli yürütülerek <ol><li> jel sıcaklığı kadar yaklaşık 1.5 saat 1x TBE tamponu içinde 50 ºC &#39;de jel ve 50 W çalıştırın ve tampon 50 ºC de stabildir. </li><li> 30 saniye için 90 ° C&#39;de Isı örnekleri ve jel üzerine buz yüklemeden önce üzerine taşıyın. </li><li> (: 100 dilüsyon 1) 2 ul RNA merdiveni ihtiva eden tek bir şerit ile birlikte jel üstünde kuyu içine yükleyin örnekleri. </li><li> Bromophenol Mavi boya jel aşağı ~ 2/3 ulaşana kadar 1x TBE tamponu 50 W ve 50 ° C&#39;de jel çalıştırın. </li></ol></li><li> jel Tedavisi <ol><li> Açık yavaş ve dikkatli sıralama hücresinden üst plaka ayırın. jel bozulmaması için büyük özen gösteriyoruz. </li><li> kesme kromatografisi yoluhy kağıdı (Malzeme Listesi) bromofenol mavi boya üstten jel boyutuna uyacak şekilde. radyoaktif işaretli RNA transkript yaklaşık konumunu teyit etmek için bir Geiger sayacı kullanın. </li><li> Jel filtre kağıdına yapışır kadar dikkatle sıkıca filtre kağıdı ile jel ve basın kapsar. kesiniz ve adi NTP&#39;ler çok sıcak olabilir jel altına koşmak gibi radyoaktif atıklarla jel alt atın. </li><li> Bir vakumlu kurutma makinesinin kurutma yatakta filtre kağıdı aynı büyüklükte bir parça yerleştirin ve dikkatle jel tarafı yukarı gelecek şekilde bunun üzerine jel kaplı kağıt yatıyordu. </li><li> 1.5 saat boyunca 60 ° C&#39;de bir plastik sargı ve kuru ile jel örtün. </li><li> 1 saat arasında değişebilir uygun pozlama süresi ile, plastik örtü ile kaplı jel filtre kağıdı diğer tarafını sarın ve görüntüleme durumda bir ışığa duyarlı fosfor plaka üzerinde yer gecede reaksiyon verimliliğine bağlı olarak. </li><li> kullanarak fosfor plaka görüntüüreticinin talimatlarına göre bir görüntüleme tarayıcısı. yazılım kılavuzuna göre ImageJ yazılımı kullanarak göreceli bant yoğunluğunu belirlemek. </li><li> , Çalışma alanında radyoaktif kirlenme kontrol doku ve temizlik maddesi ile şüpheli öğeleri ve bölgeyi silin ve bertaraf konteynerine dokuyu imha etmek bir Geiger sayacı kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+by+RNA+polymerase:+recognition+of+regulatory+signals+during+RNA+chain+elongation.">Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation.</a> J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).</li><li>Burgess, R. R., Anthony, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sigma+docks+to+RNA+polymerase+and+what+sigma+does.">How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).</li><li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intrinsic+transcription+termination+by+N+and+NusA:+the+basic+mechanisms.">Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms.</a> Cell. 107 (4), 437-449 (2001).</li><li>Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NusA+N-terminal+domain+is+necessary+and+sufficient+for+enhancement+of+transcriptional+pausing+via+interaction+with+the+RNA+exit+channel+of+RNA+polymerase.">The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase.</a> J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).</li><li>Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+RNA+polymerase+and+the+elongation+factor+NusA.">The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA.</a> RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).</li><li>Artsimovitch, I., Henkin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+to+analysis+of+transcription+termination.">In vitro approaches to analysis of transcription termination.</a> Methods. 47 (1), 37-43 (2009).</li><li>Decker, K. B., Hinton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+at+the+core:+Similarities+among+bacterial,+archaeal,+and+eukaryotic+RNA+polymerases.">Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases.</a> Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).</li><li>Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+easy+to+stop+RNA+polymerase?.">Is it easy to stop RNA polymerase?.</a> Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).</li><li>Murakami, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural biology of bacterial RNA polymerase.</a> Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).</li><li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transcription+as+a+target+for+antibacterial+drug+development.">Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).</li><li>Yang, X., Ma, C., Lewis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector+system+that+allows+simple+generation+of+mutant+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase.</a> Plasmid. 75, 37-41 (2014).</li><li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+large+scale+purification+of+Escherichia+coli+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase.">A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase.</a> J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).</li><li>Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-overexpression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+subunits+allows+isolation+and+analysis+of+mutant+enzymes+lacking+lineage-specific+sequence+insertions.">Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).</li><li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transcription+inhibitor+of+RNA+polymerase+holoenzyme+formation+by+structure-based+drug+design:+From+in+silico+screening+to+validation.">Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation.</a> ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).</li><li>Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase-induced+remodelling+of+NusA+produces+a+pause+enhancement+complex.">RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex.</a> Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).</li><li>Lewis, P. J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+vectors+for+controlled+expression+and+dual+labelling+of+protein+fusions+in+Bacillus+subtilis.">GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis.</a> Gene. 227 (1), 101-110 (1999).</li><li>Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pausing+by+bacterial+RNA+polymerase+is+mediated+by+mechanistically+distinct+classes+of+signals.">Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).</li><li>Vassylyev, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+bacterial+RNA+polymerase+holoenzyme+at+2.6+&#197;+resolution.">Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 &#197; resolution.</a> Nature. 417, 712-719 (2002).</li><li>Artsimovitch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+transcription+regulation+by+alarmone+ppGpp.">Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp.</a> Cell. 117 (3), 299-310 (2004).</li><li>Bordier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+rifampicin-resistant+RNA+synthesis+by+rifampicin-RNA+polymerase+complexes.">Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes.</a> FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).</li><li>Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+assay+to+measure+the+real-time+kinetics+of+nucleotide+incorporation+during+transcription+elongation.">Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation.</a> J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bütün organizmalarda, transkripsiyon bir sıkı regüle süreçtir. Transkripsiyon analizleri transkripsiyon faktörleri, küçük moleküller ve transkripsiyon inhibitörlerinin etkilerini test etmek için bir platform sağlamak için geliştirilmiştir in vitro. Bu yöntem, bir kağıt, genel bakteriyel transkripsiyon için bir tahlil tanımlanmıştır. Onlar bir zaman çizgisi boyunca tüm transkripsiyon ürünlerinin görselleştirme izin olarak transkript dizi jel elektroforezi ile kombine transkripsiyon analizleri mekanik çalışmalar için çok önemlidir. Bunun bir sonucu olarak, bu yöntem, reaksiyon koşulları, küçük değişiklikler etkisini belirlemek ve bir etki makul bir mekanizmanın ortaya yeteneğine sahiptir. Bundan başka, bu etki bilinmeyen mekanizmalarla transkripsiyon faktörlerinin işlevine ilişkin özel transkripsiyon tahlilleri tasarımı mümkün hale gelir. Bu yazıda da rnap holoen inhibitörünün etki mekanizması teyit etmek için bir yöntem tarifzyme oluşumu. Burada tarif edilen yöntem, zaman içinde her RNA transkriptinin bir değişim gösterebilir ve uygun modifikasyon ile uygun bir şekilde transkripsiyonu, her adımda karşı antibakteriyel maddelerin test etkinleştirebilir. Tek yuvarlak tahlil gibi rekabetçi / rekabetçi olmayan özellikleri gibi inhibitörlerinin mekanizmasını incelemek için kullanılabilir iken çoklu yuvarlak deneyi, yeni transkripsiyon hedefleyen inhibitörleri tanımlamak için göreceli basit tarama yöntemi olarak kullanılabilir. küçük moleküler toplama rekabetçi olmayan ilaç keşfi sürecinde inhibitörleri ve isabet-potansiyel müşteri değerlendirme için kapsamlı bir yaklaşım sağlayabilir tek yuvarlak mekanik çalışma olarak yanlış pozitif hit neden olabileceğini unutmayın. Bunun bir sonucu olarak, bu kontrol edilen transkripsiyonun işlemi tam olarak bir inhibitör rasyonel de novo ilaç tasarımı yardımcı olabilir transkripsiyonunu nasıl etkilediğini ortaya yeteneğine sahiptir. Birlikte X-ışını kristalografik Stu göre önleyici bağlama sitelerinde yüksek çözünürlüklü bilgileriyapı-tabanlı akılcı ilaç tasarımı ilaç keşfi hedefleyen transkripsiyon uygulama için son derece müsait olacak, ölür. Yüksek verimli sonuçlar, in vitro kopyalama tahlillerinde elde edilemez olsa da, bunlar transkripsiyon kontrolü ile ilişkili hassas mekanizmaların kesme son derece yararlıdır. komponentler ve tahlil koşulları hali hazırda bireysel ihtiyaçları için modifiye edilebilir. Çeşitli faktörler (örneğin, nusa) 4, 15, küçük moleküller (örneğin, ppGpp) çıkar 20 transkripsiyon düzenlenmesi işlevlerini test etmek için ilave edilebilir 19 ve / veya transkripsiyon inhibitörleri (örneğin, rifampisin). DNA örneğinin tek tek güçlü promotörler, duraklatma sırası ve sonlandırıcılar dikkatli seçimi ile dizayn edilmesi gerekmektedir. tahlilinde, yüksek tekrarlanabilirliği elde etmek için, protein yüksek saflaştırılması gerekir ve artık RNaz etkinliğinin ari ve transkripsiyon tamponu DNA şablonu veDEPC yapılmalıdır NTP substratların stok çözeltisi su ile muamele edilmiş. Radyoaktif NTP&#39;lere kullanımı bu yazıda anlatılan ancak floresan nükleotidler de 21 istihdam edilebilir. DNA şablonu Kalitesi transkripsiyon deneyi başarısı için kritik öneme sahiptir. yükseltici / duraklatma / terminatör arasında yeterli boşluk çeşitli transkripsiyon ürünleri düzgün ayrılmış ve incelenmesi gereken izin dahil edilmelidir. dizileme jeli düzgün dökülmüş olması ve nispeten taze TBE tamponu RNA transkriptlerinin mümkün olan en yüksek çözünürlük elde etmek için elektroforez için kullanılmalıdır. transkripsiyon ürünün bozulması fark edilmesi halinde, yüksek kaliteli RNaz inhibitör transkripsiyon reaksiyon karışımı içinde dahil olmalıdır. Tüpler ve pipet uçları çift otoklava olmalıdır ve tahlil yaparken eldiven RNaz giriş en aza indirmek için, her zaman giyilmelidir.

Transkripsiyon, RNA, belirli bir DNA şablonu sentez edildiği bir süreçtir. Ökaryotik hücrelerde üç farklı RNAPs vardır: rnap I rRNA öncüllerini transkripsiyonun rnap II mRNA ve bazı küçük nükleer RNA sentezi için sorumludur ve 5S rRNA ve tRNA sentezi rnap III ile gerçekleştirilir. bakteri, RNA, tüm sınıfları transkripsiyon sorumlu tek bir rnap vardır. başlatma, uzama ve sonlanma: transkripsiyon üç aşaması vardır. Transkripsiyon hücrede en çok düzenlenen süreçlerden biridir. Transkripsiyon döngüsünde Her aşamada gen ifadesinin 1 düzenlenmesi için bir kontrol noktasını temsil eder. Başlatılması için, rnap açık hızlandırıcı kompleks oluşturmak için yükselticiler 2 olarak adlandırılan belirli sitelere enzimi doğrudan gerekli olan, holoenzyme oluşturmak üzere bir sigma faktörü ile bağlanması gerekir. Daha sonra, transkripsiyon faktörleri büyük bir paketi düzenleme o sorumluduruzama ve sonlanma aşamalarında f rnap faaliyetleri. Burada incelenen transkripsiyon faktörü, nusa iyi muhafaza edilen ve temel bir proteindir. Bu rRNA sentezi 3-5 esnasında transkripsiyon duraklatma ve sonlandırma, ve anti-sonlandırma düzenlenmesinde rol oynar. In vitro transkripsiyon deneyleri transkripsiyon 6 sırasında karmaşık düzenleyici adımlar incelemek için güçlü araçlar olarak geliştirilmiştir. Genel olarak, bir uyarıcı bölge içeren DNA doğrusal fragmanı transkripsiyonu için, şablon olarak gereklidir. DNA şablonu, genellikle PCR ile ya da bir plasmid doğrusallaştırılmış tarafından oluşturulur. Arıtılmış proteinler ve (algılama amaçlı bir radyoetiketlenmiş NTP dahil) NTP&#39;ler eklenmiş ve ürün inkübasyon gerekli dönemini takip eden analiz edilmektedir. uygun şablonları ve reaksiyon koşullan kullanılarak, transkripsiyon tüm aşamaları TRANSCR ayrıntılı moleküler karakterizasyonu sağladı, bu yaklaşım kullanılarak incelenmiştirSon yarım yüzyıl 7 üzerinde iption. Rnap 3-boyutlu yapısı ile ilgili bilgi ile birlikte de antibiyotik ve antibiyotik potansiyel transkripsiyon inhibisyonu moleküler mekanizması prob, ve yeni, iyileştirilmiş ilaç 8-10 geliştirilmesinde bu bilgileri kullanmak mümkün olmuştur. Bu çalışmada, transkripsiyon deneyleri transkripsiyon uzama / sonlandırma faktörü Nusa ve nasıl yeni bir transkripsiyon başlatma inhibitörü kurşun etki mekanizması tespit edilebilir tarafından düzenlenmesi mekanizmasını belirlemek için nasıl kullanılabileceği örnekler sunmak.

<table><tbody><tr><td>Obtain the proteins required for transcription assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>Preparation of DEPC-treated water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA template preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&amp;nbsp;Plus&amp;nbsp;SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>High Purity rNTPs</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P UTP&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>Radioactive compound</td></tr><tr><td>RNA ladder preparation&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&amp;ndash;1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Gel preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>urea&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethane&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>boric acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Transcription Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>formamide&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;3MM Chr Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive decontaminant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Gel Treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio+ imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro transcription assays and their application in drug discovery

In vitro transkripsiyon analizleri geliştirilmiştir ve yaygın transkripsiyon rol oynayan moleküler mekanizmaları incelemek için yıllardır kullanılmaktadır. Bu işlem, çok-alt-birim DNA-bağımlı RNA polimeraz (rnap) ve gen ekspresyonu ne rnap aktivitesini modüle için harekete transkripsiyon faktörlerinin bir dizi gereklidir. radyoaktif işaretli transkript dizileme jel elektroforezi hangi parametreler bunu nasıl etkilediğini transkripsiyon ilerler ve ayrıntılı mekanistik bilgi vermek için kullanılır. Bu yazıda, esas uzama faktörü nusa transkripsiyonel duraklatma olarak rnap holoenzyme oluşumunun inhibisyonu yoluyla transkripsiyon inisiyasyon hedefleme bir antibakteriyel ajanı tanımlamak için bir yöntem düzenler nasıl çalışma protokol açıklar. Bu yöntemler de tam olarak bilinmemektedir transkripsiyon faktörlerinin etki mekanizması, aynı zamanda, yeni antibakteriyel agen keşfetmek için ilave yaklaşımlar geliştirilmesi için platform olarak kullanılabilirts antibiyotik araştırma ve geliştirme bir atıl ilaç hedefi olan transkripsiyonu hedefleyen.

Transkripsiyon verimi, farklı zaman noktalarında bantlarında radyasyon seviyesini ölçmek suretiyle belirlenebilir. Duraklatma tahlil duraklama, fesih görselleştirme etkin Nusa faktörü işlevi sınamak ve run-off ürünler (Şekil 1A) için. (Nusa NTD, amino asit kalıntıları 1-137) nusa N-terminal alanının varlığında, RNA ürünlerinin görünümünü önemli ölçüde nusa yoksun olan kontrol deneyi ile karşılaştırıldığında gecikmiştir. amino asitler bir dizi alanine nusa fragmanı ya da değiştirilmesi amino asit artıkları 104-137 (helezon 3) delesyonu (artıklar K36, K37, R104, S108, K111, S112, Q116, ve R119) Tam sonuçlandı Nusa duraklama aktivitesinin kaybı. Helix 3 tortuları R104 ve K111 NUSA NTD duraklama aktivitesi için ve R104A ve nusa NTD yoktu kontrol (Şekil 1B) &#39;e benzer bir duraklama yan-ömür değerlerine veren K111A konstruktları ile önemli olduğu gösterildi. Bu should bu iki amino asit kalıntısının bu Helix 3 silinmesini ya da değişiklik not rnap 15 bağlanma nusa üzerinde hiçbir etkiye sahip olması. Sonuç R104 ve K111 NUSA duraklama etkinliğinin düzenlenmesi için gerekli kilit amino asit olduğunu ileri sürmektedir. Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, benzer şekilde, doz-yanıt eğrisi yeni tespit bakteriyel transkripsiyon inhibitörü C5 14 farklı konsantrasyonu kullanılarak in vitro transkripsiyon (çoklu tur) önlenmesini göstermiştir. C5 akılcı rnap günü diğer majör bağlanma yeri ile σ 70 etkileşimini hedef projeden siliko ekranında bir takip tanımlandı Kelepçe-Helix bölgesini 18 çağırdı. Transkripsiyon reaksiyonu içine C5 eklenmesiyle, bu bileşik, bu şekilde inhibe transkripsiyon rnap bağlanma için σ 70 rekabet ve benzeri. Mekanik olarak, C5 eklenmesi σ ardından rnap için &lt;sup&gt; Reaksiyon karışımına 70 faktörü rnap holoenzyme oluşumu (Şekil 2B) sonra, C5 kullanılarak deney daha transkripsiyon engellenmesi için önemli ölçüde daha etkili olmuştur. Bu sonuçlar 70 C5 rnap bağlı veya yerinden olamazdı σ o C5 verimli tek yönlü analizde rnap bağlı σ 70 yerinden olamayacağını gösterdi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54256/54256fig1.jpg" /> Şekil 1:. K36, K37 artıklarında alanin ikamesine sahip sarmal 3 silindi (Δ Helix), ve Nusa NTD ile Nusa NTD (+ Nusa), Nusa NTD kullanmadan Nusa olmadan transkripsiyon Mutant Nusa NTD Etkileri (A) Transkripsiyon duraklama deneyleri, , R104, S108, K111, S112, Q116, ve R119 (Tüm Ala). P, duraklama sitesi; T, fesih sitesi; RO, koşmak-off. jel üzerinde takozlar örneklendirilen zaman noktalannın (0.5, 1, 1.5, 2, 5 ve 10 dakika göstermektedir) 15; Doğal tipte proteine ​​göre mutant nusa NTD nisbetle yarı ömürleri (B) Durdurma aktivitesi. SD 3 deneyin ortalaması. Bu rakam Nükleik Asitler Res modifiye edilmiştir. 43 (5), 2829-2840 (2015). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54256/54256fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54256/54256fig2.jpg" /> Şekil 2:. E. bileşiği C5 Transkripsiyon inhibisyon (A) inhibisyon eğrisi Çok yuvarlak deneyinde 14 bileşik C5 coli rnap transkripsiyon. transkripsiyon yüzde inhibisyonu reaksiyonda kullanılan C5 konsantrasyonuna karşı bir kontrol (Resim C5 Mevcut) RNA ürünü nisbetle ile belirlenmiştir. (B) Tek yönlü tr bileşik C5 Yüzde inhibitör etkinliğive sonra (holoenzyme + C5; siyah) holoenzyme oluşumu (gri kompleksi + σ 70) önce C5 ilavesi ile anscription deneyleri. Bu rakam ACS Infect modifiye edilmiştir. Dis. 2, 39-46 (2016). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54256/54256fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery at JoVE.com

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

in-vitro-transcription-assays-and-their-application-in-drug-discovery

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

15.1K Görüntüleme.  University of Newcastle. In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Video: In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Biyokimya

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Kanser Araştırmaları

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Tıp

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA polymerase, e.g. T7. Due to the high cost of IVT reagents,&#160; IVT is a critical step in the mRNA drug substance production process and has been the focus of intense optimization in the field. To decrease the cost of mRNA production, reagents must be utilized optimally. Effective optimization necessitates a comprehensive understanding of the impact of individual reagents on reaction kinetics, i.e., the consumption of nucleoside triphosphates (NTPs) and the production of mRNA. Traditionally, low-throughput, end-point analytical techniques have been used for the analysis of mRNA. Though such methods give valuable information on mRNA content, at-line, near real-time analytics is needed to fully understand IVT reaction. We demonstrate how a liquid chromatography analytical method that separates NTPs, as well as pDNA and mRNA, can be used in near real-time to study IVT reaction kinetics. With the knowledge of the influence of different IVT components on kinetics and yield, rapid chromatographic analysis can be used to convert batch IVT reaction into a fed-batch mode that further increases productivity and reduces the overall cost of the reaction.

Optimizing in vitro transcription (IVT) is critical for cost-effective mRNA production. This protocol details an analytical chromatographic method for at-line analysis of IVT reaction, monitoring NTP depletion and mRNA production in batch or fed-batch modes, applicable to various RNA modalities, enhancing productivity and reducing costs.

Kromatografik Hat İçi İzleme Kullanılarak mRNA Üretimi için İn vitro Transkripsiyon Reaksiyonunun Optimizasyonu

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To dissect the role of 5&#39;-poly(A) leader in mRNA translation during poxvirus infection we developed an in vitro transcribed RNA-based luciferase reporter assay. This reporter assay comprises of four core steps: (1) PCR to amplify the DNA template for in vitro transcription; (2) in vitro transcription to generate mRNA using T7 RNA polymerase; (3) Transfection to introduce in vitro transcribed mRNA into cells; (4) Detection of luciferase activity as the indicator of translation. The RNA-based luciferase reporter assay described here circumvents issues of plasmid replication in poxvirus-infected cells and cryptic transcription from the plasmid. This protocol can be used to determine translation regulation by cis-elements in an mRNA including 5&#39;-UTR and 3&#39;-UTR in systems other than poxvirus-infected cells. Moreover, different modes of translation initiation like cap-dependent, cap-independent, re-initiation, and internal initiation can be investigated using this method.

We present a protocol to study mRNA translation regulation in poxvirus-infected cells using in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter assay. The assay can be used for studying translation regulation by cis-elements of an mRNA, including 5&#8217;-untranslated region (UTR) and 3&#8217;-UTR. Different translation initiation modes can also be examined using this method.

In vitro transkripsiyonu RNA tabanlı luciferase Reporter assay Poxvirus-virüslü hücrelerde çeviri Yönetmeliği çalışma

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Biyomühendislik

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

Gen İfadesi DNA etkileşimleri, Discover Transkripsiyonlu Regülatörleri ve Roman Anti-tümör Ajanlar tanımlayın: Protein Eğitim için Kantitatif Testi

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Biyoloji

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...