Anne Dodson teşekkür ediyoruz ve Stephanie Heinrich smFISH Protokolü en iyi duruma getirme konusunda tavsiye için Xavier Darzacq için analiz platformunda, Haiyan Huang öneriler istatistiksel analizi için yardım edin. Bu eser Mart Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable güvenir (00027344), Damon Runyon'un Kanser Araştırma Vakfı (35-15) ve Glenn Vakfı'na EÜ ve bir NSF yüksek lisans araştırma bursu Grant No fon tarafından desteklenmiştir DGE-1106400 Dizayn Merkezi için.

Not: Tüm tamponları ve bu protokol için kullanılan ortamı Tablo 1' de listelenmiştir. Satıcı bilgileri reaktifleri için Malzemeler tablolistelenir.
Gün 1/1-2 gün:
Not: bitkisel kültür için 0.4-0.6 tercih edilen bir ortamda, bir OD600 hücrelerin büyümesine. Segregasyonun kültür için hücreleri (genellikle bir OD600 itibaren 1.85 içinde kültür) tercih edilen bir yöntemle mayoz geçmesi için ikna etmek.
1. örnek fiksasyon ve sindirim
<ol><li>~3.5 OD%600 3 formaldehit hücrelerinin toplam düzeltmek.<ol>
<li>Bitkisel kültür için 480 µL % 37 formaldehit 15 mL konik tüpler kültürünün 5.52 mL ekleyin.</li>
		<li>Segregasyonun kültür için 160 µL % 37 formaldehit 2 mL microcentrifuge tüpler 1840 µL kültürünün ekleyin. ~ 5 kat için ters çevir'i karıştırın. Uyarı: Toksik formaldehit. İdare ve kurumsal düzenlemelere göre atmayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüpler bir silindir davul oda sıcaklığında 20 dakika yerleştirin. Segregasyonun örnekleri,-20 dk, oda sıcaklığında sabitleme sonra gecede 4 ˚C sabitleme devam etmek için döner. Not: Gece fiksasyon tekrarlanabilirlik ve segregasyonun örnekleri için elde edilen smFISH verilerin kalitesini artırır. Fiksasyon zaman optimize edilmelidir.</li>
	<li>Örnekler tespit ederken, 200 mM Vanadyl Ribonucleoside kompleksleri (VRC), en az 10 dk 65 ˚C çözülme.</li>
	<li>Sindirim ana karışımda 15 mL Tüp hazırlayın: 1 örnek için arabellek b 425 µL 200 mM (65 ˚C ısındı); VRC 40 µL ile karıştırın. 5 örnekleri için 2125 µL arabellek b 200 µL 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC ile karıştırın. Açık kahverengi yeşil VRC eklenmesinden sonra görünür ana karışıma eklemeden önce VRC tam olarak resuspend için girdap ~ 5 s. Not: VRC eklenmesi sırasında sindirim smFISH sonuçları, tutarlılığını potansiyel olarak ham özü saf zymolyase karışımı tarafından tanıtıldı nükleaz kirletici engelleyerek iyileştirir. Bu adımda gerekli VRC miktarı optimize edilmelidir.</li>
	<li>Bitkisel örnekleri için ~ 1057 x g 3 dk de tüpler santrifüj kapasitesi. Segregasyonun örnekleri (sonra gece fiksasyon) için 1,5 dk. Decant 21.000 x g, santrifüj kapasitesi veya süpernatant formaldehit atık için Aspire edin. Not: Oda sıcaklığında tüm Santrifüjü adımlar gerçekleştirilir.</li>
	<li>1.5 mL soğuk arabellek b hücreleri yukarı ve aşağı pipetting veya tüplerin ters çevirme ve karıştırmak için flicking resuspend. Bitkisel örnekleri 2 mL tüpler için resuspension sonra aktarın.</li>
	<li>1.5 dakika süreyle santrifüj 21.000 x g de kaldırmak sıvı dökme vakum aspirasyon veya pipetting, ~ 100 µL bırakarak.</li>
	<li>1.5 mL soğuk arabellek b hücreleri resuspend</li>
	<li>1.5 dakika süreyle santrifüj 21.000 x g de kaldırmak sıvı dökme vakum aspirasyon veya pipetting, ~ 100 µL bırakarak.</li>
	<li>Hücreleri 21.000 x g de 1,5 dk. aspiratı soğuk arabellek B. santrifüj 1,5 ml sıvı vakum tamamen veya pipetting resuspend.</li>
	<li>Sindirim ana mix ve kısaca resuspend girdap 425 µL hücrelerde resuspend. 100T 10 mg/mL zymolyase 5 µL her tüp için ekleyin. Not: Girdap önce tüpler için ekleme her zaman zymolyase. Zymolyase ana karışıma eklemek yerine her tüp için ayrı ayrı ekleyin. Her iki adım zymolyase hızlı bir şekilde precipitates çünkü tüpleri arasında sindirim tutarlılığı korumaya yardımcı olmak.</li>
	<li>Girdap 2-3 s karıştırmak için. Tüpler silindir davulunun üstündeki yerleştirin ve 15-30 dk 30 ˚C, sindirmek. Bitkisel hücreleri ve erken segregasyonun aşamaları, genellikle ~ 15 dk sürer ve segregasyonun profaz ve segregasyonun bölümler için genellikle ~ 30 dakika sürer. Not: mikroskobunun her 5 dk 15 dk sonra denetleyin ve saydam olmayan ve Refraktif ~ %80 hücre görünür sindirim durdurur. Şu andan itibaren çok kırılgan hücrelerdir. Hücreleri nazikçe işlemek ve vakum aspirasyon ya da vortexing kullanmayın.
</li>
	<li>Tüpler ~ 376 x g 3 dk. Kaldır, sıvı tamamen pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Yavaşça yukarı ve aşağı 1 - 2 kez için pipetting tarafından arabellek b 1 mL içeren hücreleri resuspend karıştırın.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır Tampon B sıvı, tüpler santrifüj kapasitesi pipetting tarafından. Yavaşça 1 mL % 70 etanol (RNase free su ile seyreltilmiş) hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 3,5-4 saat için kuluçkaya.</li>
</ol>2. hibridizasyon
<ol><li>Formamide oda sıcaklığına getirmek (50 mL aliquot için ~ 30 dk su banyosunda alır). Not: formamide şişe şişe formamide oksidasyonunu önlemek için oda sıcaklığına ulaşıncaya kadar açmayın. Dikkat: Formamide zehirlidir. İdare ve kurumsal düzenlemelere göre atmayın.</li>
	<li>% 10 formamide yıkama arabellekte bir 15 mL konik Tüp hazırlayın.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. kaldırmak 500 µL % 70 etanol için de tüpler santrifüj kapasitesi pipetting tarafından. Yavaşça yukarı ve aşağı kalan hücreleri resuspend ve sonra hücreleri düşük yapışma tüpler için aktarmak için damlalıklı. Not: yüksek yapışma borular kullanarak büyük ölçüde hücre kaybı sırasında sonraki yıkar azaltır.</li>
	<li>Tüpler ~ 376 x g 3 dk. çıkarmak için de tekrar pipetting tarafından tüm etanol santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>1 mL % 10 formamide yıkama arabellek ve yavaşça damlalıklı aşağı yukarı 2 - 3 kez eklemek hücreleri resuspend.</li>
	<li>Hücreleri hibridizasyon çözüm hazırlarken ~ 20 min için oda sıcaklığında oturmak izin. 1 örnek için 50 µL hibridizasyon arabelleği (Oda sıcaklığı), 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC 5 µL ve her sonda (200 nM final) 1 µL karıştırın. 5 örnekleri için 250 µL hibridizasyon arabelleği (Oda sıcaklığı), 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC 25 µL ve her sonda (200 nM final) 5 µL karıştırın.<ol>
<li>Hibridizasyon (-20 ˚C dondurulmuş) arabellek formamide oksidasyonu önlemek için tüp açmadan önce oda sıcaklığına çözülme.</li>
		<li>200 mM VRC, sondalar, eklemeden önce 5-10 s için girdap ekledikten sonra hangi tasarlanmış ve ticari satın ve üreticinin yönergelerine göre yeniden düzenlendi.</li>
		<li>İki problar Co inkübe varsa, 1:10 1 µL ekleyin seyreltme prob #1 stok, hem de 1:10 1 µL seyreltme, son seyreltme yapmak için prob #2 stokunun ~ 1:500 her iki soruşturma için. Olmak en iyi sinyal-gürültü oranı ihtiyaçları için gerekli konsantrasyonu (Ayrıntılar için bkz: tartışma) en iyi duruma getirilmiş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tehlikeli atık pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hibridizasyon çözümünün en az 50 µL her tüp için ekleyin. Karıştırmak için tüpler fiske.</li>
	<li>Bir rulo davul üzerinde 30 ˚C, en az 16 saat karanlıkta kuluçkaya.</li>
</ol>Gün 2/gün 3
3. yıkama ve görüntüleme
<ol><li>Formamide oda sıcaklığına getirmek.</li>
	<li>% 10 formamide yıkama arabellek (FWB) 15 mL konik Tüp hazırlayın.</li>
	<li>Tüpler rulo davul kaldır ve ışıktan korumak için bir folyo kaplı kutusuna koyun.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tehlikeli atık pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 1 mL % 10 FWB resuspend 2 - 3 kez.</li>
	<li>30 dk folyo kaplı kutusunda (değil döner) için 30 ˚C, kuluçkaya.</li>
	<li>3 dk. için çıkarmak süpernatant tehlikeli atık için pipetting tarafından ~ 376 x g de örnekler santrifüj kapasitesi ve ~ 50 µL bırakın.</li>
	<li>Bu arada, DAPI/FWB 15 mL konik tüp içinde hazırlamak: 1 örnek için 1000 µL % 10 formamide yıkama arabelleği 5 mg/mL DAPI 1 µL ile karıştırın. 10 örnekleri için 10 mL % 10 formamide yıkama arabellek 5 mg/mL DAPI 10 µL ile karıştırın. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 1 mL DAPI/FWB resuspend 2 - 3 kez.</li>
	<li>30 dk folyo kaplı kutusunda (değil döner) için 30 ˚C, kuluçkaya.</li>
	<li>Anti-çamaşır suyu reaktifler buz çözme.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tamamen pipetting tarafından santrifüj kapasitesi. Gerekirse, tüm süpernatant kaldırmak için tekrar santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hemen görüntüsü değil örnekleri, Pelet GLOX arabellek olmadan enzimler 50 µL içinde resuspend. Damlalıklı aşağı yukarı 3 - 4 kez karıştırmak için.<ol>
<li>Unimaged örnekleri folyo kaplı kutuda 4 ˚C görüntüye kadar hazır tutun. Görüntü hazır olduğunuzda ~ 376 x g 2 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve süpernatant tamamen kaldırmak pipetting göre. Aşağıdaki gibi enzimler ile GLOX içinde resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemen yansıma örnekleri için 15-20 µL GLOX arabelleği enzimler ile ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için damlalıklı. Not: eklendi birim hücre Pelet boyutuna bağlı olarak değişebilir. Biz 15 µL GLOX arabelleği enzimler ile Pelet resuspending tavsiye ve mikroskop hücre yoğunluğu kontrol edin. Hücreleri (çok yoğun hücreleri birbiri topaklanma) varsa, enzimler ile ilave GLOX tampon ekleyin. Hücreleri çok seyrek ise örnek santrifüj kapasitesi ve ~ 5 µL arabelleği kaldırın.</li>
	<li>Damlalıklı 5 µL üzerine bir coverslip (18 mm x 18 mm, No. 1) ve koymak bir slayt üzerinde coverslip.</li>
	<li>Coverslip yerleştirildiği bir laboratuvar silin slayt üzerine koy. Yavaşça laboratuvar silme slayt (sıvı tüm dört coverslip kenarlarından çıkıyor görmelisiniz) ayarlamak için tuşuna basın.</li>
	<li>Slayt alüminyum folyo ile kaplı bir kutu içinde mikroskop Oda aktarın.</li>
	<li>Yüksek büyütme (60-100 X) ve yüksek sayısal diyafram ile geniş alanlı floresan mikroskop kullanarak görüntü. Not: önemli ölçüde tahsil edilecek ışık miktarını sınırlamak gibi smFISH sondalar tarafından yayılan fotonlar maksimum sayıda toplamak için confocal mikroskoplar, tavsiye edilmez. Burada, veri toplanmıştır üzerinde bir 100 X, 1.4 NA amacı ile donatılmış bir mikroskop kullanarak filtre CY5 (EX632/22, EM679/34) görüntüsü 1.3 s, %100 T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, %100 T; ve DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, %32 - %50 T. Bir parlak alan başvuru yansıması da elde edilebilir. Adım boyu ile 15-25 dilim 0,1-0,2 elde µm, üzerinden tamamen aşağıda görüş alanı tamamen yukarıda, odak tüm sağlamak için RNA noktalar sayılı mı.</li>
</ol>4. görüntü analizi
<ol><li>Balık-quant17 ve StarSearch2gibi yayımlanmış smFISH analiz araçları ile veya deneme tam ihtiyaçlarına bağlı olarak özel programları ile smFISH veri analiz. Not: Bir iyi analiz boru hattı doğru RNA noktalar ayrı arka plan ve X, Y ve Z (isteğe bağlı) koordinatları ve her yerinde, her hücrede noktaların sayısını yoğunluğu gibi istatistikleri çıkış için bir eşik belirlemek kullanıcılara izin vermelidir ve muhtemelen yanlış algılamaların filtre uygulamak için bir yol olarak parametreleri uygun.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Burada sunulan Protokolü diğer yayımlanmış smFISH iletişim kuralları2,3,21,22,23türetilmiştir ve özellikle Maya zorlanma arka SK1 için optimize edilmiştir. En iyi duruma getirilmiş parametreler cep telefonu numarasını, fiksasyon süresi, Santrifüjü hız ve süresi, sindirim süresi, sindirim arabellek, sonda konsantrasyon ve hibridizasyon arabellek dahil. Hibridizasyon sıcaklığı ve süresi gibi diğer parametreler optimize edilmemiş. Bu bölümde, bu protokol için herhangi bir Maya zorlanma arka plan ve faiz büyüme koşullarına uyum yardımcı olacak bir kaç not paylaşıyoruz.
Mayası hücre duvarına hücre duvarı sonda penetrasyon engelleyeceğinden mayası yüksek kaliteli smFISH görüntüleri alma karşı büyük bir sorun olduğunu. Hücre duvarı zymolyase tarafından eksik hazım sonda ve sinyal yüksek hücre hücre değişkenlik verimsiz hibridizasyon yol açar. Ancak, aşırı sindirim hücreleri çok kırılgan yapmak, önemli yol kaybı çamaşır adımları sırasında hücre ve görüntüleme için slayt hazırlık sırasında patlama hücre. Böylece, sindirim süresi optimize etmek çok önemlidir. Aynı örnek zaman farklı miktarda sindirerek tarafından pilot smFISH deney tavsiye ediyoruz. ~ %80 hücre refraktif sigara olunca sindirim durdu eğer bizim durumumuzda biz en iyi smFISH veri aldı. Genellikle, aynı büyüme koşulu için farklı genetik mutant suşları ile benzer zamanlama sindirmek. Ancak, sindirim süresi farklı büyüme koşulları ve mayoz mayası içinde farklı aşamalarında arasında karşılaştırıldığında farklıdır. Zamanlama belirlendikten sonra smFISH tekrarlanabilir kalitesidir. Not Ayrıca hafif kusurlu hücre duvarı sentezi ve/veya kompozisyon mutant suşları için sindirimi daha az 15 dk. zymolyase farklı gruplar halinde kullanımı tamamlanabilir sindirim zamanlama değişebilir.
En iyi sonda konsantrasyonu yüksek sinyal gürültü oranı elde etmek için gereklidir. Tasarlanmış ve bizim smFISH sondalar ticari olarak satın aldı. İyi problar (genellikle 20-mers) % %35 45, 2 baz çifti sonda ve düşük olan arasında en az bir boşluk arasında değişen GC yüzdesi olmalıdır. Biz bir web tabanlı sonda tasarımcı üretici probları listesi oluşturmak için kullanılan ve seçim için yeterli probları olsaydı, patlama algoritması Saccharomyces genom veritabanında sondalar fazla 17 baz çifti ile örtüşen ortadan kaldırmak için kullanacağımızı genomik diğer bölgeleriyle. Bu kümedeki tüm yukarıdaki ölçüt (20 probları) memnun probları sayısı daha düşük olduğu için NDC80luti (CF 590) benzersiz bölgesine anneals sonda küme için daha fazla photostable floresan boyalar (CAL Fluor 590) seçtik (~ 25 probları) üretici tarafından önerilen en az sayıda. Üreticinin yönergelerini izleyerek sonda çözüm başlamaktan sonra yaptığımız bir 1:10 seyreltme hisse senedi çözüm oluşturur ve seyreltik çözüm-20 ˚C adlı 5-µL aliquots. Her aliquot yalnızca bir kez kullanıldı. Optimizasyonu için bir seri yapmak gerekir dilutions 1:10 seyreltilmiş çözüm ve test hangi toplama en iyi sinyal-gürültü oranı verir. 1:250, 1:500, 1: 1000 ve 1:2000 özgün stoktan seyreltme dizi yapım tavsiye ediyoruz. Bizim durumumuzda, CF 590 ve Q 670 sonda kümeleri için en iyi sinyal-gürültü oranı 1:500 seyreltme faktörü sonuçlandı.
En iyi fiksasyon zaman da başarılı smFISH mayası için önemlidir. Biz o gece fiksasyon 4 ˚C bulundu yerine, oda sıcaklığında 20 dakika, sabitleme önemli ölçüde tutarlılık ve kalite segregasyonun örnekleri için smFISH sonuçlarının geliştirilmiş. Her ne kadar biz nasıl gecede fiksasyon bitkisel örnekleri etkisi olabilir test etmedim, fiksasyon, oda sıcaklığında bu büyüme durumu iyi çalıştı. Böylece, smFISH Protokolü yeni suşları veya büyüme koşulları için en iyi duruma getirmek için kısa fiksasyon saat oda sıcaklığında ile başlayan ve yüksek sinyal değişkenliği oluşursa fiksasyon zaman artan öneririz.
Diğer yayımlanmış protokolleri3,22,23ile karşılaştırıldığında, sindirim ve VRC daha yüksek bir konsantrasyon hibridizasyon sırasında sırasında RNase inhibitörü VRC bizim protokolünü kullanır. VRC ek olarak aşağıdaki iki adımı gelişmiş tutarlılık smFISH sonuçlarının muhtemelen daha iyi RNA molekülleri (enzim ham özleri saf ve RNase içerebilir zymolyase karıştırmak yanında tanıttı nükleaz etkinliğe karşı koruma kirletici maddeleri). Böylece, bizim iletişim kuralı veya VRC daha yüksek konsantrasyonlarda optimizasyonu için listelendiği gibi VRC miktarı kullanmanızı öneririz.
Hücreleri önemli bir kısmını arabellek B ve formamide yıkama arabellek çamaşır adımları sırasında kaybolabilir. Hücre kaybı azaltmak için Santrifüjü hızını artırmak. Bizim durumumuzda, örneklerimizi sırasında arabellek B cips için yüksek hızlı (21.000 x g) kullanarak önemli ölçüde azaltılmış hücre kaybı yıkar. Ancak, dolayısıyla Santrifüjü hızını değiştirme değil önerilir hücreleri zymolyase sindirim sonra çok kırılgan hale gelir. Bunun yerine, büyük ölçüde yıkama formamide yıkama arabellekte sırasında hücreleri cips yardımcı düşük yapışma tüpler bilimsel ABD üzerinden kullanmanızı öneririz. Genel olarak, bizim iletişim kuralı sürekli hücre verimli görüntüleme için yoğun bir monolayer oluşturabilirsiniz. Genellikle, 7 alanları bakış verim > 130 hücreleri miktar için uygun.
Son olarak, en uygun parametreler için ve görüntü analizi gerekli çıkışları belirlemek önemlidir. SmFISH noktalar algılamak için yayımlanan analiz programları yaygın olarak ham görüntüleri arka plan sinyal kaldırmak için Gauss çekirdek kullanarak filtre ve kullanıcılardan görüntüleri2,17her kümesi için kullanılacak sinyal-gürültü oranı belirlemek ister. Ne yazık ki, şu anda tek bir standart hangi tarafından uygun parametreleri belirlenir değildir ve bu yüzden bazı ampirik bu farklı ayarları test gereklidir. Bu adımların her biri için gerekli parametreleri ayarlamak için bir tekrarlayarak farklı parametre kümesi giriş ve ne kadar iyi her kümesinden elde edilen sonuçları maçlar bu el ile birkaç temsilcisi hücrelerde sayım odasından kontrol gerekiyor. Bir parametre kümesi bulunduktan sonra farklı büyüme koşulları ve genetik arka planlar rağmen elde edilen görüntülerin çoğu için kullanılabilir.
Ayrıca, maksimum yoğunluk projeksiyon smFISH görüntülerin miktar22önce gerçekleştirilen bir test edebilirsiniz. Bu adım nokta algılama algoritması basitleştirir ve önemli ölçüde bazı potansiyel olarak yararlı bilgiler rağmen onların hücre altı yerelleştirme gibi bireysel noktaları hakkında pahasına görüntüleme süresini azaltır. Bizim durumumuzda, mRNA molekülleri NDC80 Gen tarafından üretilen sayısı yeterince düşük noktalar de bu işlendikten sonra (tutanaklar tomurcuklanma içinde3,7Maya için nadir değildir) ayrı kaldık. Colocalization Analizi kritik nerede durumlarda analiz boru hattı colocalization değerlendirmek için her kanaldaki her smFISH spot konumunu belirlemek gerekir. Bağlı olarak özel sorular sordu, her nokta yoğunluğu gibi diğer bilgileri de boru hattı daha ayrıntılı bir çözümleme için elde edilebilir gerekebilir. Anahtar en iyi duruma getirme iletişim kuralında adımlar ve görüntü analiz boru hattı yüksek faiz soru çalışmaya smFISH verilerin kalitesini elde etmek çok önemlidir.

Dinamik, düzenleme, Gen ifadesinin bir organizma gibi çevresel stres, enfeksiyon ve değişiklikler onun yanıt gelişimi metabolizmasında kullanıyor. Transkripsiyon regülasyonu odak çalışmaları RNA bereket ölçen teknolojilerine güveniyor. Böyle bir yöntem tek molekül floresans in situ hibridizasyon (smFISH) olarak adlandırdığı bireysel RNA molekülleri tek hücreler1,2tespiti için kullanılır. Bu yöntem, hücre hücre değişkenlik gen ekspresyonu ölçümü ve hücre içi RNA yerelleştirme belirlenmesi sağlar.
En sık kullanılan smFISH teknikte bireysel bir RNA molekülü tespiti hedef RNA tamamlayıcı ve aynı floresan boyalar için Birleşik birden çok kısa DNA prob (genellikle ~ 48 20-mer probları) gerektirir. Tek bir floresan sonda bağlama sinyali zayıf sonuçlar, ancak tüm probları topluluğu sinyalini sağlamdır. Tek bir sonda hedef kapalı bağlama sergi olsa bile, böyle sinyal çok zayıf olarak hedef RNA molekülü3kıyasla beklendiği için bu özellik sinyal-gürültü oranı büyük ölçüde artırır. İçinde hata algılama RNA molekülleri sayısı sayılır ve çeşitli büyüme koşullarında ve farklı mutantlar arasında göre.
İlk gelişimi beri smFISH gen ifade4,5,6,7 patlama transkripsiyon Uçbirleştirme transkripsiyon uzama1,gibi2, çeşitli yönlerini incelemek için uyarlanmıştır , 8 , 9, hücre içi allelic ifade10,11,12ve RNA yerelleştirme13,14,15. Son zamanlarda, hangi aynı genin iki transkript izoformlarının ifade eğitim için bu yöntemi kullandık kısa transkript izoformu (NDC80ORF) vardır onun tüm sıra uzun izoformu (NDC80luti ile paylaştı )16. İki mRNA izoformlarının benzersiz olarak tanımlamak için biz iki yoklama kümesi kullanılır: bir set NDC80lutibenzersiz sırasını belirli ve diğer küme başka bir floresan boya, Birleşik, iki izoformlarının ortak bölgesine bağlar. NDC80luti RNA colocalized bir yer her iki floresan sinyali ile ise tanımlanan NDC80ORF RNA biri sadece sinyal ortak soruşturma kümesinden içerir. Sayısı beri NDC80ORF transkript sonda hibridizasyon, yüksek verim ve yüksek sinyal gürültü oranı güvenle smFISH noktalar tanımlamak ve hata azaltmak gerekli "çıkarma" yöntemine göre hesaplanır yayma.
Bu kağıt tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaesmFISH gerçekleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı, cep numarası, fiksasyon süresi, sindirim süresi, sindirim arabellek, sonda konsantrasyon ve hibridizasyon içinde smFISH deneyler için kullanılan arabellek en iyi duruma getirilmiş S. cerevisiae geçiren SK1 zorlanma arka için bitkisel büyüme veya mayoz. Ancak, aynı zamanda bu el yazması Not: resim alma ve (2) ek optimizasyon farklı zorlanma arka planlar ve büyüme koşulları için gerektirebilir Protokolü adımları sonra smFISH verilerin kalitesini kontrol etmek için (1 yöntemi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Tek molekül floresans in situ hibridizasyon (smFISH) gen ekspresyonu nedeniyle algılayıp bireysel RNA molekülleri saymak için onun yetenek tek kişilik hücrelerde çalışma için güçlü bir tekniktir. Derin-dayandırılmış yöntemleri için tamamlayıcı, smFISH hücre hücre varyasyon transkript bolca ve belirli bir RNA'ın hücre altı yerelleştirme hakkında bilgi sağlar. Son zamanlarda, NDC80 gen ifade mayası mayoz sırasında çalışmaya smFISH kullanmış, hangi iki transkript izoformlarının adlı biri yok ve tüm onun sırası ile uzun izoformu paylaşılan kısa transkript izoformu vardır. Güvenle her transkript izoformu tanımlamak için bilinen smFISH iletişim kuralları en iyi duruma getirilmiş ve yüksek tutarlılık ve kalite tomurcuklanma sırasında alınan örnekleri için smFISH veri elde Maya mayoz. Burada, en iyi duruma getirilmiş bu iletişim kuralı olup kaliteli smFISH veri elde edilir ve bu iletişim kuralı diğer maya suşları ve büyüme koşulları uygulamak için bazı ipuçları belirlemek için kullandığımız ölçütleri açıklanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.1K Görüntüleme.  University of California, Berkeley. Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Video: Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Genetik

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.