Bu yöntemler, deneysel bir manipülasyonun, hastalığa neden olan proteinin veya RNA'nın sinaptik süreçleri etkileyip etkilemeyeceği ve terapötik bileşiklerin işlevi geri kazanıp kazanamayacağı konusunda hızlı bir değerlendirme sağlar. Bu teknikler, elektrofizyolojiye kıyasla nispeten kısa bir süre içinde bir grup nörondan sinaptik fonksiyonun güvenilir bir şekilde okunmasını sağlar. Bu protokol, nöronal gelişim veya dejenerasyonun herhangi bir hastalığına uygulanabilir.
Bu, birincil kemirgen nöronal kültürleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen nöronlar için iyi çalışır. Başlamak için, konfokal görüntüleme alma yazılımını kullanarak görüntü alma ayarlarını optimize edin. Tüm numunelerde uyarma gücüne maruz kalma süresini, dedektör kazancını ve kare hızını sabit tutun.
Hızlandırılmış görüntüleme için, boya ağartmayı en aza indirmek için 512 x 512 en boy oranını ve saniyede iki görüntü kare hızı seçin. Ardından, GCaMP altı M / GCaMP üçlü Fitzy ve Stearoyl boya Trixi ile floresan uyarım, dikroik ve emisyon filtresi kombinasyonlarını seçin. Hızlandırılmış görüntüleme sırasında Z'nin sürüklenmesini önlemek için, konfokal görüntüleme edinme yazılımının mükemmel odak özelliğini kullanın.
Ardından, görüntü alma panelindeki zaman sekmesini seçin. Birinci aşama için, aralığı 500 milisaniye ve süreyi üç ila beş dakika olarak ayarlayın. İkinci aşama için, aralığı 500 milisaniye ve süreyi, beş dakikayı ayarlayın.
Daha sonra yapay beyin omurilik sıvısı veya ACSF için yerçekimi perfüzyon aparatını monte etmek için, yüksek potasyum klorür ACSF tamponunu aparatın üstündeki 50 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve akış hızını dakikada bir mililitreye ayarlayın. Ardından, nöronları içeren 35 mililitrelik bir cam tabağı, çanak kenarına yerleştirilmiş perfüzyon borusunun ucu ile konfokal görüntüleme aşamasına yükleyin ve görüntüleme alanını seçin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, birincil kortikal veya motor nöronları düşük potasyum klorür ACSF tamponunda 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra tamponu aspirasyonla ve bir pipet kullanarak çıkarın, karanlıktaki nöronları 50 milimolar potasyum klorür ve 10 Mikro molar stiril boya içeren ACSF ile doldurulmuş bir cam tabanlı Petri kabına yükleyin. Beş dakika sonra, yükleme çözeltisini çıkarın ve spesifik olmayan boya yüklemesini ortadan kaldırmak için nöronları 37 santigrat derecede düşük potasyum klorür ACSF tamponunda 10 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra çanağı ters çevrilmiş konfokal mikroskobun görüntüleme aşamasına yerleştirin ve hücreleri 20 kat hava hedefi veya 40 kat yağ daldırma hedefi altında gözlemleyin.
Çelik boyayı 546 nanometre lazer kullanarak uyarın ve 570 ila 620 nanometre bandpass filtresi kullanarak emisyon toplayın. Görüntüleme alanını seçtikten ve mükemmel odağı kullandıktan sonra, nöronal sınırları işaretlemek için parlak alan, Trixi ve floresan işaretleyici kanallarıyla tek bir hareketsiz görüntü alın. Ardından, satın alma yazılımında Şimdi Çalıştır'ı başlatın ve boya yoğunluğundaki değişiklikleri hariç tutmak için bazal kaydı üç ila beş dakika boyunca gerçekleştirin.
İkinci aşamaya geçişte, perfüzyon sistemi için açma düğmesini tetikleyin ve boya boşaltmayı kolaylaştırmak için nöronlara sürekli olarak 50 milimolar potasyum klorür perfüze edin. Kayıtları beş dakika boyunca gerçekleştirin ve ardından perfüzyon sistemi için kapatma düğmesini tetikleyin. Denemeyi daha sonra konfokal yazılımı kullanarak veri analizi için kaydedin.
GCaMP altı M ile transfeksiyondan 48 saat sonra, birincil kemirgen kortikal nöronlarını 15 dakika boyunca düşük potasyum klorür ACSF ile inkübe edin. Ardından çanağı görüntüleme platformuna monte edin ve GCaMP altı M floresansını bir Fitzy filtresi ve 20 kez veya 40 kez objektif kullanarak görselleştirin. Görüntüleme alanını seçtikten ve mükemmel odağı kullandıktan sonra, nöronal sınırları işaretlemek için parlak alan, Fitzy ve floresan işaretleyici kanallarıyla tek bir hareketsiz görüntü alın.
Ardından, edinme yazılımında Şimdi Çalıştır'ı başlatın ve bazal kaydı üç ila beş dakika boyunca gerçekleştirin. Daha sonra, daha önce gösterildiği gibi nöronlara 50 milimolar potasyum klorür içeren ACSF'yi perfüze edin ve beş dakika boyunca kaydedin. Görüntü alma işlemi durduğunda, deneyi kaydedin ve konfokal yazılımı kullanarak veri analizine devam edin.
Görüntü analizi için, zaman atlamalı görüntüleri konfokal yazılımda açın ve Görüntü'ye tıklayarak görüntüleri hizalayın, ardından işleme, ardından geçerli belgeyi hizalayın ve ardından İlk kareye hizala'yı seçin. ROI seçim aracını kullanarak nöritler boyunca ilgi çekici bölgeleri seçin ve ayrıca arka plan floresan yoğunluğunu temsil eden bir ROI'yi işaretleyin. Ardından, seçilen yatırım getirilerinin zaman içindeki ham floresansını ölçmek için zaman ölçüm panelinden ölçüm işlevini başlatın.
Ölçümden sonra ham floresan yoğunluklarını elektronik tablo yazılımına aktarın. Styryl boya ile yüklü kültürlü sıçan primer kortikal nöronları burada gösterilmiştir. Boya yüklemesinin özgüllüğü, sinaptik vezikül belirteci sinaptofizin ile birlikte etiketlenmesi ile belirlendi ve steril boya pozitif punktanın çoğunluğu bu belirteç için eş pozitiftir.
Tüm görüntüleme periyodu boyunca ham yoğunluk değerlerinin analizi, sinaptofizin ve yoğunluğun sabit kaldığını, stiril boya yoğunluğunun ise stimülasyonu takiben azaldığını ortaya koymaktadır. Yeşil floresan protein transfekte kontrol nöronları için, başarılı sinaptik vezikül salınımı, yüksek potasyum klorür depolarizasyonu üzerine boya floresansının çarpıcı kaybına neden oldu. Bu temsili video, bir nöronun stimülasyonu takiben yeni bir sağ bölgede stiril boyayı seçici olarak boşalttığını göstermektedir.
Buna karşılık, GA 50'ye boya peptidi tekrar yapısına bağlı bir C dokuz ORF 72 ile transfekte edilen nöronlarda, bozulmuş sinaptik iletim, yüksek potasyum klorür depolarizasyonundan sonra bile tutulan boya floresansı ile temsil edilir. Potasyum klorür depolarizasyonundan önce ve sonra GCaMP altı M ile transfekte edilen kortikal nöronların temsili floresan görüntüleri burada gösterilmiştir. GCaMP altı M ile transfekte edilen artmış floresan değerleri ve kortikal nöronlar, potasyum klorür indüklenmiş depolarizasyonu takiben nöritlere kalsiyum girişini gösterir.
Temel kayıt periyodunun sonunda, nöronlar GCaMP altı M'yi düşük floresan ile ifade etti. Daha sonra stimülasyonun başlangıcında dramatik bir floresan artışı gözlenir. Steril boya ve GCaMP için floresan taban çizgisi kayıtlarının kararlı olduğundan emin olun.
Görüntü kaymasını önlemek için her zaman mükemmel odağı kullanın, bu da görüntü sonrası veri işlemeyi zorlaştırır. Nöronların daha fazla kültürlenmesi önerilmez, çünkü yemekler bolluk sırasında havaya maruz kalır. Bununla birlikte, immün boyama veya protein veya RNA'nın ekstraksiyonu, sinaptik değişikliklerin potansiyel nedenlerini değerlendirebilir.
