AI laboratuvarının tüm üyelerine yararlı yorumları ve önerileri için teşekkür ederiz. Servis-GFP vektörünü bize sağladığı için Prof. Mark Hipp&#39;e (Max Planck Biyokimya Enstitüsü) teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (ISF # 124/14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Kariyer Entegrasyonu Hibe (CIG # 333794) ve İsrail&#39;de Psikobiyoloji için Ulusal Enstitü ( NIPI # b133-14 / 15).

1. Hücre Hattı Hazırlama <ol><li> Sıvı azotlu bir kapta saklanan yaklaşık 1.000.000 fare nöroblastoma spinal kord hücresini (NSC-34 hücreleri) çözdürün. Hücreler tamamen eriyene kadar 37 ° C su kuluçka makinesini kullanın. </li><li> Taze, sıcak ortam (% 10 sığır fetüsü serumu (FBS),% 1 L-glutamin ve% 1 kalem strep antibiyotikleri içeren DMEM ortamı) ekleyin. </li><li> Çözülmüş hücreleri (SL16R) 500 xg&#39;de 5 dakika süreyle santrifüj ederek bir hücre pelletini oluşturun. Ortamı atın ve hücre yeniden süspansiyonu için 1 mL yeni ortam ekleyin. </li><li> Yeniden süspanse edilen hücreleri 15 mL&#39;lik bir şişeye yerleştirin ve ekstra 5 mL&#39;lik bir ortam ekleyin. Hücreleri bir gece boyunca 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 ile steril bir inkübatörde inkübe edin. </li><li> Buna paralel olarak, 60 mm&#39;lik bir kültür çanağına 8 kaplanmamış lamelleri (kapak camı: 12 mm, 0.13-0.17 mm kalınlığında) yerleştirin ve kuru olana kadar% 70 etanol ile 30 dakika UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin. Her çanağa orta miktarda ilave edin ve artık etanolü yıkamak için atın.</li><li> Yapışkan hücrelerin ayrışmasına izin vermek için yaklaşık% 90 konfluansa (kaba yaklaşık 6 milyon hücreye ulaştıktan sonra) tripsin tamponu (1 L Hanks &#39;Dengeli Tuz Çözeltisi içinde 2.5 g tripsin ve 0.2 g EDTA) ekleyin. NOT: NSC-34 hücreleri hassasdır ve ortamı kullanarak ayrılmadan önce 15 s tripsin tampon inkübasyonu ve tripsin içermeyen inkübasyondan 1 dakika daha gereklidir. </li><li> Plaka zaten 3 ml orta, yaklaşık 350.000 tabak başına lamelleri içeren 60 mm kültür yemekleri üzerine hücreleri. Lamelleri üzerine hücre eklenti sağlamak için 24 saat inkübatör bırakın. </li></ol> 2. Hücre Transfeksiyon NOT: Yaklaşık 24 saat sonra NSC-34 hücreleri% 40 birleşmeye (yaklaşık 800.000 hücre) ulaşır ve transfeksiyon için hazır olacaktır. <ol><li> Steril mikrosantrifüj tüpünde saf DMEM ortamı (her 60 mm kültür çanağı için 300 μL DMEM ortamı hazırlayın) hazırlayınes. </li><li> Her DMEM içeren mikrosantrifüj tüpüne transfeksiyon için gereken 2 μg&#39;lık her plazmid ilave edin. NOT: Mekik-GFP plazmiti, tüm hücre aktarımlarında zorunludur. </li><li> Gerekli plasmidleri içeren tüm mikrosantrifüj tüplerine transfeksiyon reaktifi ekleyin. Burada, her 2 ug DNA için ticari transfeksiyon reaktifi 4 mcL ekleyin. </li><li> DMEM, plazmid ve transfeksiyon reaktifi içeren mikrosantrifüj tüplerini vorteksleyin ve 25 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Her mikrosantrifüj tüpünü bir kültür çanağına ekleyin ve homojen bir solüsyon oluşturmak için çanağı hafifçe karıştırın. Çanağı inkübatöre 48 saat geri koyun. NOT: Mekik-GFP&#39;nin tüm hücrelerde eksprese edilmesi gerektiği için, mekik-GFP transfeksiyon etkinliği kısmen incelenebilir ve gecede transfeksiyon sonrasında floresanlı mikroskopi kullanılarak ön test edilebilir. Floresansız ifade edilen proteinlerin tam bir incelemesi, bir immünoblot analiziolduğunu. </li></ol> 3. Mikroskopi <ol><li> Bir lamel tutucuya transfekte NSC-34 hücreleri içeren lamelleri takın ve müttefiki ölen hücreleri kaldırmak için hafifçe fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. </li><li> Ters çevrilmiş mikroskoplu yeşil bir fluoresan filtre kullanarak uygun bir hücre yamasını belirleyin. NOT: Uygun bir hücre yaması, çok sayıda hücreyi (bir alandaki 20-30 hücre) gösteren ve çekirdeklerin hücrelerde açıkça tanımlandığı bir mikroskop alan olarak tanımlanır. Hücre yamasındaki hücre çekirdeği önce gözle tanımlanır ve görüntüleme yazılımı ile manuel olarak işaretlenir. </li><li> Mikroskop altında lamelleri damlayan lamelleri PBS 10 ng / mL LMB içeren bir exportin-1 inhibitörü Leptomisin B (LMB) tampon 200 mcL ekleyin. NOT: Bu zaman noktası sıfır aralığı olarak ayarlanır. </li><li> İşaretli çekirdeklerin floresan yoğunluğunu yaklaşık 400-500 s boyunca 3 s aralıklarla ölçün. </li><li&gt; Her bir deneyde her bir transfeksiyon grubu için 3 ila 5 kapak fişi testi yapın. </li></ol> 4. Analiz NOT: Farklı hücreler, farklı düzeylerde floresan mekik-GFP ifade ettiğinden, her hücrenin nükleer flüoresan yoğunluğunu kendi başlangıç ​​flüoresan yoğunluğuna normalleştirmek önemlidir. <ol><li> İşaretlenen çekirdeğin flüoresan yoğunluğunu, her çekirdeğin 3-s floresan aralığını o çekirdeğin başlangıç ​​altı aralık ortalamasına bölerek normalize edin. </li><li> Her çekirdeğin normalleştirilmesinden sonra, her bir hücre yamasının zamana bağlı olarak çekirdek flüoresansındaki değişikliği temsil eden bir floresan yoğunluk eğrisi oluşturun. Bunu yapmak için, her hücre yamasındaki tüm hücrelerin ortalamasını hesaplayın (her yamanın yaklaşık 20-30 hücresinden oluşur). NOT: Çekirdek floresan yoğunluğu eğrisi artan ti içinde daha iyi gözlemlenen bir Michaelis-Menten doygunluk eğrisine benzemektedirBen dönemler. Bunun nedeni, nükleer transporta bağlı olarak zamanla mekik-GFP sitozolik miktarlarında bir azalmadır. Bu azalma, bir mekik-GFP&#39;nin çekirdeğe taşınma ihtimalini istatistiksel olarak düşürmekte ve dolayısıyla nükleer flüoresan satürasyonuna ulaşmaktadır. Eğrinin doğrusal başlangıç ​​hızından türeyen eğim, V max giriş hızını çekirdeğe verir. </li><li> Her bir deney grubunu temsil eden bir eğim oluşturmak için grafik yazılımı kullanarak, üç ila beş bağımsız deneyden türetilen her bir hücre yamasının V maks eğimlerini analiz edin. Tek yönlü ANOVA istatistiksel analizini kullanarak niceleme yapın. </li></ol> 5. Protein İfade Doğrulaması <ol><li> Buz üzerindeki her bir deney grubundan kalıntı hücreleri (yukarıdaki deneyde kullanılmayan) içeren 60 mm&#39;lik kültür yemekleri yerleştirin. </li><li> Ortamı atın ve seyreltmek ve kalan ortamı yıkamak için hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> Hücrelere 200-400 muamele edinPBS,% 0.5 Triton ve proteaz inhibitörü kokteyl tableti (PI) içeren lizis tamponu μL&#39;si. Hücre kazıyıcı kullanarak kazıyın. </li><li> Lizis tamponunda hücreleri bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve buz altında 1 dakika süreyle 4.000 rpm&#39;de bir homojenleştirici ile homojenize edin. </li><li> Homojenleştirilmiş hücreleri 2500 xg&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın, bir Bradford testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün ve -20 ° C&#39;de kullanana kadar saklayın. </li><li> 30 ve 70 μg toplam protein (protein bağlı olarak) arasında toplayın ve bir immunoblot tahlili kullanılarak protein ekspresyonu için test etmek için bir SDS-PAGE jel yükleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2002).</li><li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins.">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li><li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location.">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li><li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals.">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877 (2016).</li><li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport.">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li><li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli,+impede+RNA+biogenesis,+and+kill+cells.">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li><li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS.">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li><li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export.">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport.">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li><li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9ORF72+poly(GA)+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins.">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li><li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS.">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li><li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD.">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li><li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+frontotemporal+dementia+and/or+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72.">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li><li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

Yazarlar açıklayacak bir şeye sahip değiller.

Bu protokol, nükleositoplazmik taşınımdaki dakika değişikliklerini değerlendirmek için oldukça hassas ve niceliksel yeni bir testi gösterir. Bu sistemi kullanarak, protein dağılımında dramatik değişikliklerle sonuçlanan büyük kusurları değil, nükleositoplazmik taşınmayı ve onun işlev bozukluğunu gerçek zamanlı olarak gözlemlemek ve ölçmek mümkündür. Bu tahlil sadece duyarlılık avantajına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda az miktarda hazırlık gerektirir, ucuzdur ve çok kolay ve düşük etkileşimli bir testtir. Bu sistemin etkinliğini test etmek için daha önce bir nükleositoplazmik ulaşım eksikliğine neden olduğu gösterilen ALS ve FTD modelleri olan C9orf72 proteinleri, poli (GR) ve poli (PR) DPR&#39;ler 5 , 7 , 8 , 10 , 12 kullanıldı. Bu tahlil kullanılarak, gerçek zamanlı olarak, yaklaşık% 50&#39;lik bir düşüş göstermiştir.Bir kontrol vektörü ile transfekte edilen hücrelere kıyasla DPR&#39;leri ifade eden hücrelerde nükleer ithalat oranı. Bu nedenle, bu sistem, nükleositoplazmik nakliyedeki muhtemel kusurların mevcut olabileceği diğer ve bu ALS veya FTD mutantlarının veya diğer hastalıkların neden olabileceği, nükleositoplazmik taşınımdaki küçük değişiklikleri kolayca ölçme olanağını açar. Burada açıklanan protokol motor nöron benzeri hücrelerle ilgiliyse de, diğer hücre tiplerine kolayca adapte edilebilir. En önemlisi, bu sistemi kullanarak, farklı moleküler faktörlerin veya ilaçların, ALS, FTD veya diğer bozukluklarda nükleositoplazmik transport eksikliklerini önlemeye veya kurtarmaya (hatta kısmen de olsa) yardımcı olabileceğini belirlemek artık mümkün. Bu tahlilin kullanılmasında olası bir kısıtlama, net bir çekirdek içermeyen hücrelerde hücre çekirdeğini gözlemleme ve işaretleme yeteneğinin sınırlı olmasıdır. Bunun üstesinden gelmek için olası bir çözüm, daha büyük bir görkemli<html> tirme. Bununla birlikte, bu sonuçta her hücre yamasındaki hücrelerin miktarını düşürecek ve önemli bir değere ulaşmak için gerekli deney miktarını artıracaktır. Başka bir husus, LMB ilavesinden önceki mekik-GFP çekirdeğinden sitoplazma oranına ilişkindir. Bu oran, farklı hücre tiplerinde çok farklı olabilir ve sonuç olarak görünür bir çekirdeği göstermek için çok küçük olabilir (1: 1&#39;e yakın bir oran olabilir). Olası bir çözüm, önceden bir nükleer işaretleyici kullanmaktır. Her hücre kendi orijinal nükleer flüoresansına normalleştirildiğinden bu, nihai analizi etkilemez. Ek olarak, bu tahlil, nükleer flüoresansta optimal artışın etkin bir şekilde izlenmesi için gerçekleştirilmeden önce, exportin inhibisyonu için kullanılan LMB konsantrasyonunun kalibre edilmesi önerilir. Nükleositoplazmik transport yetersizliğinin ALS 5&#39;deki motor nöronların dejenerasyonunda ana rolü oynadığı öne sürülmüştür ,= &quot;Xref&quot;&gt; 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Durum buysa, C9orf72 modelinde gözlemlenenlere benzer nükleosittoplazmik nakil kusurlarının diğer ALS modellerinde rol oynayacağı öngörülmektedir. Bununla birlikte, farklı modeller arasındaki büyük değişkenlik nedeniyle, nihai sonuçlan ve nükleositoplazmik bozulmadan kaynaklanan moleküler bulgular her iki durumda farkedilmeyebilir veya fenotipik olarak farklı olabilir. Farklı FALS modelleri üzerine kapsamlı araştırmalara rağmen, bunları ortak mekanizmalarla ilişkilendirmek bir sorun olarak kalmaktadır. Bu tahlil, şimdi bu meydan okumanın en azından kısmen aşılması için fırsat sağlayabilir.

Nükleer gözenek kompleksi (NPC), büyük moleküllerin hücre çekirdeğine girip çıkmasını kontrol eder. Düzenleme 1 olmadan çekirdeğe girebilen küçük moleküllerin aksine, daha büyük moleküllerin taşınması NPC tarafından güçlü bir şekilde kontrol edilir. Proteinler ve RNA gibi bu büyük moleküller, çekirdekten ithal edilecek ve ihraç edilecek olan importinler ve exportinler de dahil olmak üzere ulaşım faktörleri ile ilişkilendirilmektedir. İthal edilmek için, proteinler, genellikle nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) olarak adlandırılan ve importins 2 ile bağlanan küçük bir peptid motifi içermelidir. Bu amino asit dizileri bir etiket görevi görür ve 3 , 4 bileşiminde çeşitlilik gösterir. Proteinler, çekirdeğin, exportin ile ilişkisinden dolayı sitoplazmaya ihraç edilebilirS, genellikle bir nükleer ihraç sinyali (NES) 2 olarak adlandırılan bir sinyal sekansını bağlar. Hem importins hem de exportins, küçük Ras ile ilgili nükleer protein GTPase (Ran) 2&#39;nin düzenlenmesi nedeniyle yüklerini taşıyabiliyorlar. Ran&#39;ın, GTP&#39;ye veya GSYİH&#39;ye bağlı olup olmadığına bağlı olarak farklı konformasyonel hallerde bulunduğu gösterilmiştir. GTP&#39;ye bağlandığında, Ran importins veya exportins&#39;e bağlanabilir. Exportins, RanGTP&#39;ye bağlandığında yüklerini serbest bırakırken, exportins&#39;ler ihracat kargolarıyla bir kompleks oluşturmak için RanGTP&#39;yi bağlamalıdır. Ran&#39;ın hakim nükleotid bağlanma durumu, çekirdeğin (RanGTP) veya sitoplazmanın konumuna (RanGDP) bağlıdır. Son zamanlarda, bir dizi çalışma, nükleositoplazmik yolakta ve hem amiyotrofik lateral sklerozda (ALS) hem de frontotemporal bunama (FTD) 5,6 arasındaki bozukluklar arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir </sup&gt; , 7,8,9,10,11,12 . ALS, hem üst hem de alt motor nöronlarını (MN) etkileyen ve sonuçta ortalama 2-5 yıl içinde felç ile sonuçlanan ilerleyici ve ölümcül nörodejeneratif bir hastalıktır. Çoğu ALS vakası, herhangi bir görünür genetik bağlantı bulunmayan sporadik (SALS) olarak sınıflandırılır, ancak% 10 dominant bir şekilde miras kalır (ailesel ALS; FALS). Son zamanlarda, kromozom 9 açık okuma çerçevesi 72 (C9orf72) genindeki hekzanükleotid tekrar genişlemeleri (HRE), ALS ve FTD&#39;nin genetik bir nedeni olarak 14 , 15 olarak tanımlandı. Bu mutantlar FALS vakalarının% 30-40&#39;ını oluşturur ve farklı çalışmalar iddia edilmiştirNükleositoplazmik taşınımı etkileyerek toksikliğe neden olduklarını, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Bu çalışmalar çoğunlukla HRE&#39;lerin nükleositoplazmik nakil üzerindeki nihai sonuçlarını ve tezahürlerini göstermiştir, ancak gerçek zamanlı olarak nükleositoplazmik bozulma göstermezler. Sonuç olarak, sadece ağır nükleositoplazmik transport yetersizliği 11 , 17 , 18 olarak değerlendirildi. Bu protokol yeni ve veGerçek zamanlı olarak nükleositoplazmik transport bozukluğunu değerlendirmek ve ölçmek için hassas duyarlılık testi. Bir NLS-NES-GFP proteini (mekik-GFP) alma oranı, flüoresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak nicelleştirilebilir. Bu daha önce tarif edildiği gibi bir exportin inhibitörü kullanılarak yapılır, böylece mekik-GFP&#39;nin çekirdeğe girmesine izin verir. Floresan mikroskopi ve gerçek zamanlı olarak flöresan değişiklikleri nicelikli bir yazılım kullanarak çekirdekte bulunan mekik-GFP&#39;nin flüoresans yoğunluğundaki kademeli değişikliklerin sayısal olarak tespit edilmesi mümkündür. Sonuç olarak, herhangi bir zamanda nükleer mekik-GFP miktarını temsil eden, flüoresan-zaman ekseninin bir Michaelis-Menten benzeri doyum eğrisi yapılabilir. Eğrilerin başlangıçtaki doğrusal oranını kullanarak, flüoresans doygunluğundan önce çekirdeğe girme oranını temsil eden bir eğim oluşturmak mümkündür. Deneyi doğrulamak için, tercüme etmekDaha önce nükleositoplazmik taşınmayı kesintiye uğrattığı bildirilen poli (GR) ve poli (PR) C9orf72 dipeptide tekrarlar 5 , 7 , 8 , 10 , 12 kullanıldı. Bu tahlil kullanılarak, kontrole kıyasla nükleer ithalat oranında% 50&#39;lik bir düşüş gözlendi. Bu sistemi kullanarak, nükleositoplazmik taşınımdaki dakika değişiklikleri incelenebilir. Dahası, farklı faktörlerin bir nükleositoplazmik nakil defekti kurtarma kabiliyeti belirlenebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td>
			<td>tebu-bio</td>
			<td>CLU140-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5g/L L-glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS European Grade</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm</td>
			<td>Bar Naor LTD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">TurboFect Transfection Reagent</a></td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING WORKBENCH 2&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptomycin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp</td>
			<td>Glas-Col</td>
			<td>099C K5424CE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002455</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

Nükleositoplazmik nakil, büyük moleküllerin hücre çekirdeğinden ithalatı ve ihracını ifade eder. Yakın geçmişte, bir dizi çalışma amyotrofik lateral skleroz (ALS) ile nükleositoplazmik yolakta bozulmalar arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir. ALS motor nöronları etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır ve sonuçta ortalama 2-5 yıl içinde felç ile sonuçlanır ve ölümle sonuçlanır. Çoğu ALS olgusu, herhangi bir görünür genetik bağlantıdan yoksun, dağınıktır, ancak% 10 hakim bir şekilde kalıtsaldır. Yakın zamanda, kromozom 9 açık okuma çerçevesi 72 (C9orf72) genindeki hekzanükleotid tekrar genişlemesi (HRE), ALS ve frontotemporal bunama (FTD) genetik bir nedeni olarak tanımlandı. Önemli olarak, farklı gruplar yakın zamanda, bu mutantların nükleositoplazmik taşınımı etkilediğini önermişlerdir. Bu çalışmalar çoğunlukla HRE&#39;lerin nükleositoplazmik nakil üzerinde nihai sonucu ve tezahür göstermiştir ancak bunlar nükleer transport bozukluğunu göstermemektedirgerçek zaman. Sonuç olarak, çoğunlukla yüksek aşırı ekspresyon veya eksojen protein yerleştirilmesinden dolayı ciddi nükleositoplazmik ulaşım eksikliği saptanabilir. Bu protokol, nükleositoplazmik transport bozukluğunun gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesi ve nicelleştirilmesi için yeni ve çok hassas bir tahlil tarif etmektedir. Bir NLS-NES-GFP proteini (mekik-GFP) alma oranı, flüoresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak nicelleştirilebilir. Bu bir exportin inhibitörü kullanılarak gerçekleştirilir, böylece GFP&#39;nin mekik içine girmesine izin verilir. Tahlilin geçerliliği için, C9orf72 HRE, daha önce nükleositoplazmik taşınmayı bozduğu gösterilen, poli (GR) ve poli (PR) dipeptid tekrarlarını çevirmiştir. Tanımlanan tahlil kullanılarak, kontrole kıyasla nükleer ithalat oranında% 50&#39;lik bir düşüş gözlendi. Bu sistemi kullanarak, nükleositoplazmik taşınımdaki küçük değişiklikler incelenebilir ve farklı faktörlerin bir nükleositoplazmik tr&#39;ini (kısmen bile) kurtarma yeteneği incelenebilirAnsport defekti belirlenebilir.

Burada sunulan prosedürü kullanarak, motor nöron benzeri NSC-34 hücreleri bir NLS-NES-GFP (mekik-GFP) proteini ile transfekte edildi. NLS ve NES sinyal sekanslarına sahip olan bu protein ( Şekil 1 ), çekirdek ve sitoplazma arasında dolaşım yapabilir. Jenerik GFP, difüzyon yoluyla herhangi bir lokalizasyon sinyal etiketinin yokluğunda çekirdeğe girebilir veya çekilebilir ve dolayısıyla çekirdek ile sitoplazma arasında eşit olarak dağıtılır ( Şekil 2A ). Bunun aksine, mekik-GFP proteini çoğunlukla sitoplazmada, dağılımını etkileyen NES ve NLS sinyali nedeniyle bulunur ( Şekil 2B ). Böylece, sadece protein ihracatını inhibe eden exportin inhibitörü leptomycin B (LMB) ilavesi, mekik-GFP&#39;nin çekirdeğe biriktirilmesine ve en sonunda mekik-GFP ithalat oranının ölçülmesine izin verir ( Şekil 2C ). Bir floresan mikroskop kullanarak<html> Floresan değişiklikleri gerçek zamanlı olarak ölçmek için ftware, mekik-GFP&#39;nin nükleer flüoresans yoğunluğundaki kademeli değişiklikler nicelenebilir. Sonuç olarak, herhangi bir zamanda nükleer mekik-GFP miktarını temsil eden, flüoresans zaman zaman ekseni ( Şekil 3 ) bir Michaelis-Menten benzeri doyma eğrisi üretilebilir. Eğrilerin başlangıçtaki doğrusal oranını kullanarak ( Şekil 3&#39;deki daire ile gösterildiği gibi) flüoresan doyumundan önce çekirdeğe giriş hızını temsil eden bir eğim oluşturulabilir. Çeşitli çalışmalar, farklı C9orf72 proteinlerinin Drosophila melanogaster modellerinde ve / veya kültürlenmiş hücrelerde 6 , 11 zehirli olduğunu göstermektedir . Mutasyon geçirmiş C9orf72 geninde HRE&#39;lerden üretilen di-peptid tekrarları (DPR&#39;ler), poli (PR) ve poli (GR) nükleoler stres 8&#39;i indüklediği bulunmuştur ,Lass = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 ve nükleositoplazmik bozukluğun engellenmesi ile ilişkilendirildi ve onları özellikle zararlı görünmelerini sağladı. Tanımlanan deneyin faydasını doğrulamak için, motor nöron benzeri NSC-34 hücreleri, bu iki DPR plazmiti poli (PR) ve poli (GR) ile transfekte edildi. Poli (PR) ve poli (GR) DPR&#39;ler de GFP&#39;ye konjuge edildiğinden, DPR&#39;lerin leptomisin-B&#39;den de etkilenmediğini doğrulamak önemlidir ve bu da sahte pozitif sonuçlara neden olur. Poli (PR) ekspresyonu nükleusta tamamen inklüzyon olarak gözlendi; Dolayısıyla, yanlış pozitif bir nükleer ithalat sinyali veremedi ( Şekil 4A ). Öte yandan, poli (GR) ekspresyonu, sitozolde homojen olarak ve çekirdeği kapanımlar olarak görüldü ( Şekil 4B ). NSC-34 hücrelerini yalnızca poli (GR) ile transfekte edip leptomisin-B ekleyince eksprese edilen poli (GR) mekik hareketi gözlenmedi ( Şekil 5 ). <p class=Mekik-GFP&#39;nin nükleositoplazmik nakil oranını analiz ederek, NSC-34 hücrelerinin poli (PR) veya poli (GR) DPR&#39;leri birlikte eksprese ettiği bulunmuştur , Kontrol olarak boş bir plazmitle transfekte edilen hücrelere nazaran nükleer ithalat oranının yaklaşık% 50 oranında azaldığını göstermektedir ( Şekil 5 ). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig1.jpg" /> Şekil 1: NLS-NES-GFP (mekik-GFP) yapısının şematik. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig2.jpg" /> Şekil 2: Leptomisin B, mekik-GFP&#39;nin NSC-34 hücrelerinden çekilmesini engelliyor. NSC-34 hücrelerinin temsili görüntüsü exp( B ) önce ve 10 ng / mL Leptomisin B (LMB) ( C ) ilavesinden 20 dakika sonra jenerik GFP ( A ) veya mekik-GFP proteinini içermektedir. LMB ilavesinin ardından, mekik-GFP çekirdeğe girer, ancak sitoplazma geri dönüşü engellenir. Böylece, mekik-GFP çekirdeklerde birikir. Ölçek çubuğu = 15 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig3.jpg" /> Şekil 3: Nükleer flüoresansında bir artış gösteren Michaelis-Menten benzeri arsa. Temsilci Michaelis-Menten&#39;e benzer eğriler, iki grubun nükleer flüoresansında bir artış gösterdi, etkilenen ve etkilenmeyen nükleositoplazmik nakil hücreleri, 25 dakika içinde. Başlangıçtaki 5 dakika, artan oranda yüksek bir fark gösteriyor;Zamanla katlandı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig4.jpg" /> Şekil 4: NSC-34 hücrelerinde C9orf72 DPR poli (PR) ve poli (GR) ekspresyonu. C9orf72 DPR&#39;leri, poli (GR) ( A ) ve poli (PR) ( B ) ile transfekte edilen NSC-34 hücrelerinin temsili görüntüleri. Poli (GR) hücrelerin çekirdeklerinde eksprese edilir ancak aynı zamanda sitozolda homojen olarak dağıtılır. Poli (PR) ağırlıklı olarak çekirdeklerde ifade edilir. Ölçek çubuğu = 30 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig5.jpg" /><br/&gt; Şekil 5: Poli (PR) ve poli (GR) C9orf72 DPR&#39;leri, NSC-34 hücrelerinde nükleer ithalat oranını kuvvetle inhibe eder. Motor nöron benzeri NSC-34 hücreleri boş bir plazmid, poli (PR) veya poli (GR) ile birlikte mekik-GFP ile birlikte transfekte edildi. Nükleer ithalat oranı, eğrinin V max&#39;daki başlangıç ​​doğrusal oranı eğimi olarak tanımlandı . Boş plasmidle elde edilen nakil oranı% 100 olarak tanımlandı. Poli (PR) ve poli (GR) ile birlikte transfeksiyon, taşınım oranını kontrol ile karşılaştırıldığında yaklaşık% 50 inhibe etti. Kantitatif analiz, tek yönlü ANOVA kullanılarak üç ila beş bağımsız deney üzerinde gerçekleştirildi. **** p &lt;0.0001; *** p &lt;0.001. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Görüntüleme.  Ben-Gurion University of the Negev.  Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır. 

Video: Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Nörobilim

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Using Informational Connectivity to Measure the Synchronous Emergence of fMRI Multi-voxel Information Across Time

It is now appreciated that condition-relevant information can be present within distributed patterns of functional magnetic resonance imaging (fMRI) brain activity, even for conditions with similar levels of univariate activation. Multi-voxel pattern (MVP) analysis has been used to decode this information with great success. FMRI investigators also often seek to understand how brain regions interact in interconnected networks, and use functional connectivity (FC) to identify regions that have correlated responses over time. Just as univariate analyses can be insensitive to information in MVPs, FC may not fully characterize the brain networks that process conditions with characteristic MVP signatures. The method described here, informational connectivity (IC), can identify regions with correlated changes in MVP-discriminability across time, revealing connectivity that is not accessible to FC. The method can be exploratory, using searchlights to identify seed-connected areas, or planned, between pre-selected regions-of-interest. The results can elucidate networks of regions that process MVP-related conditions, can breakdown MVPA searchlight maps into separate networks, or can be compared across tasks and patient groups.

Informational connectivity measures the correspondence between time courses of multi-voxel information across different brain regions. Multi-voxel pattern discriminability time series are extracted from regions and compared, revealing networks that are not identified in a typical functional connectivity approach.

Across Time fMRI Multi-voksel Bilgi Senkron Çıkışı Tedbir Bilgilendirici Bağlantı kullanma

It is now appreciated that condition-relevant information can be present within distributed patterns of functional magnetic resonance imaging (fMRI) brain ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the extracellular space (ECS) of the living brain. The ECS surrounds all brain cells and contains both interstitial fluid and extracellular matrix. The transport of many substances required for brain activity, including neurotransmitters, hormones, and nutrients, occurs by diffusion through the ECS. Changes in the volume and geometry of this space occur during normal brain processes, like sleep, and pathological conditions, like ischemia. However, the structure and regulation of brain ECS, particularly in diseased states, remains largely unexplored. The RTI method measures two physical parameters of living brain: volume fraction and tortuosity. Volume fraction is the proportion of tissue volume occupied by ECS. Tortuosity is a measure of the relative hindrance a substance encounters when diffusing through a brain region as compared to a medium with no obstructions. In RTI, an inert molecule is pulsed from a source microelectrode into the brain ECS. As molecules diffuse away from this source, the changing concentration of the ion is measured over time using an ion-selective microelectrode positioned roughly 100 &#181;m away. From the resulting diffusion curve, both volume fraction and tortuosity can be calculated. This technique has been used in brain slices from multiple species (including humans) and in vivo to study acute and chronic changes to ECS. Unlike other methods, RTI can be used to examine both reversible and irreversible changes to the brain ECS in real time.

This protocol describes real-time iontophoresis, a method that measures physical parameters of the extracellular space (ECS) of living brains. The diffusion of an inert molecule released into the ECS is used to calculate the ECS volume fraction and tortuosity. It is ideal for studying acute reversible changes to brain ECS.

Beyin Ekstraselüler Alanının Hacim Fraksiyonu ve Kıvrımını Nicelleştirmek için Tetrametilamonyum ile Gerçek Zamanlı İyontoforez

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal growth, development, and survival. We describe a detailed method for the use of microfluidic chambers (MFCs) for tracking axonal transport of fluorescently labeled organelles in MN axons. This method is rapid, relatively inexpensive, and allows for the monitoring of intracellular cues in space and time. We describe a step by step protocol for: 1) Fabrication of polydimethylsiloxane (PDMS) MFCs; 2) Plating of ventral spinal cord explants and MN dissociated culture in MFCs; 3) Labeling of mitochondria and acidic compartments followed by live confocal imagining; 4) Manual and semiautomated axonal transport analysis. Lastly, we demonstrate a difference in the transport of mitochondria and acidic compartments of HB9::GFP ventral spinal cord explant axons as a proof of the system validity. Altogether, this protocol provides an efficient tool for studying the axonal transport of various axonal components, as well as a simplified manual for MFC usage to help discover spatial experimental possibilities.

Axonal transport is a crucial mechanism for motor neuron health. In this protocol we provide a detailed method for tracking the axonal transport of acidic compartments and mitochondria in motor neuron axons using microfluidic chambers.

Mikroakışkan Odacıksistemi Kullanılarak Motor Nöron Kültürlerinde Organellerin Aksonal Taşınması

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Real-Time fMRI Brain Mapping in Animals

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a real-time fMRI platform to guide experimenters to monitor fMRI responses instantaneously during acquisition, which can be used to modify the physiology of animals to achieve desired hemodynamic responses in animal brains. The real-time fMRI set-up is based on a 14.1T preclinical MRI system, enabling the real-time mapping of dynamic fMRI responses in the primary forepaw somatosensory cortex (FP-S1) of anesthetized rats. Instead of a retrospective analysis to investigate confounding sources leading to the variability of fMRI signals, the real-time fMRI platform provides a more effective scheme to identify dynamic fMRI responses using customized macro-functions and a common neuroimage analysis software in the MRI system. Also, it provides immediate troubleshooting feasibility and a real-time biofeedback stimulation paradigm for brain functional studies in animals.

Animal brain functional mapping can benefit from the real-time functional magnetic resonance imaging (fMRI) experimental set-up. Using the latest software implemented in the animal MRI system, we established a real-time monitoring platform for small animal fMRI.

Hayvanlarda Gerçek Zamanlı fMRI Beyin Haritalaması

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a ...