Questi metodi consentono una rapida valutazione se una manipolazione sperimentale, una proteina causativa della malattia o l'RNA possono avere un impatto sui processi sinaptici e se i composti terapeutici possono ripristinare la funzione. Queste tecniche forniscono una lettura affidabile della funzione sinaptica da un gruppo di neuroni in un periodo di tempo relativamente breve rispetto all'elettrofisiologia. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi malattia dello sviluppo neuronale o della degenerazione.
Questo funziona bene per le colture neuronali primarie di roditori e per i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte. Per iniziare, ottimizza le impostazioni di acquisizione delle immagini utilizzando il software di acquisizione di immagini confocali. Mantieni costante il tempo di esposizione della potenza di eccitazione, il guadagno del rilevatore e la frequenza dei fotogrammi su tutti i campioni.
Per l'imaging time lapse, selezionare un rapporto di aspetto di 512 per 512 e una frequenza fotogrammi di due immagini al secondo per ridurre al minimo lo sbiancamento del colorante. Quindi selezionare le combinazioni di eccitazione fluorescente, dicroico e filtro di emissione per GCaMP sei M / GCaMP tre con Fitzy e colorante stearoilico con Trixi. Per evitare la deriva Z durante l'imaging time lapse, utilizzare la funzione di messa a fuoco perfetta del software di acquisizione di immagini confocali.
Quindi, selezionare la scheda ora nel pannello di acquisizione delle immagini. Per la fase uno, impostare l'intervallo 500 millisecondi e la durata da tre a cinque minuti. E per la fase due, impostare l'intervallo 500 millisecondi e la durata, cinque minuti.
Quindi, per assemblare l'apparato di perfusione gravitazionale per liquido cerebrospinale artificiale o ACSF, caricare il tampone ACSF ad alto contenuto di cloruro di potassio in una siringa da 50 millilitri nella parte superiore dell'apparecchio e impostare la portata a un millilitro al minuto. Quindi, caricare una parabola di vetro da 35 millilitri contenente neuroni sullo stadio di imaging confocale con l'estremità del tubo di perfusione posizionato sul bordo del piatto e scegliere il campo per l'imaging. 48 ore dopo la trasfezione, incubare i neuroni corticali o motori primari in un tampone ACSF a basso contenuto di cloruro di potassio per 10 minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi rimuovere il tampone mediante aspirazione e utilizzando una pipetta, caricare i neuroni al buio su una capsula di Petri con fondo di vetro riempita con ACSF contenente cloruro di potassio millimolare e 10 colorante stirilico micro molare. Dopo cinque minuti, rimuovere la soluzione di carico e bagnare i neuroni in un tampone ACSF a basso contenuto di cloruro di potassio a 37 gradi Celsius per 10 minuti per eliminare il carico di colorante non specifico. Quindi posizionare la parabola sullo stadio di imaging del microscopio confocale invertito e osservare le cellule sotto un obiettivo ad aria 20 volte o un obiettivo di immersione in olio 40 volte.
Eccitare il colorante in acciaio utilizzando un laser a 546 nanometri e raccogliere le emissioni utilizzando un filtro passa-banda da 570 a 620 nanometri. Dopo aver selezionato il campo di imaging e aver attivato una messa a fuoco perfetta, scatta una singola immagine fissa con campo luminoso, Trixi e canali marcatori di fluorescenza per contrassegnare i confini neuronali. Quindi avviare Run Now nel software di acquisizione ed eseguire la registrazione basale per tre-cinque minuti per escludere variazioni nell'intensità del colorante.
Proprio al passaggio alla fase due, attivare il pulsante di accensione per il sistema di perfusione e perfondere costantemente il cloruro di potassio 50 millimolari ai neuroni per facilitare lo scarico del colorante. Eseguire le registrazioni per cinque minuti, quindi attivare l'interruttore di spegnimento per il sistema di perfusione. Salvare l'esperimento per l'analisi dei dati in un secondo momento utilizzando il software confocale.
48 ore dopo la trasfezione con GCaMP sei M, incubare i neuroni corticali dei roditori primari con ACSF a basso contenuto di cloruro di potassio per 15 minuti. Quindi montare la parabola sulla piattaforma di imaging e visualizzare la fluorescenza GCaMP sei M utilizzando un filtro Fitzy e un obiettivo 20 volte o 40 volte. Dopo aver selezionato il campo di imaging e aver attivato la messa a fuoco perfetta, scatta una singola immagine fissa con canali luminosi, Fitzy e marcatori di fluorescenza per contrassegnare i confini neuronali.
Quindi, avviare Run Now nel software di acquisizione ed eseguire la registrazione basale per tre o cinque minuti. Quindi perfondere ACSF contenente cloruro di potassio millimolare ai neuroni come dimostrato in precedenza e registrare per cinque minuti. Quando l'acquisizione dell'immagine si interrompe, salva l'esperimento e procedi all'analisi dei dati utilizzando il software confocale.
Per l'analisi delle immagini, apri le immagini time lapse nel software confocale e allinea le immagini facendo clic su Immagine, seguita dall'elaborazione, seguita da Allinea documento corrente, quindi seleziona Allinea al primo fotogramma. Seleziona le regioni di interesse lungo i neuriti utilizzando lo strumento di selezione del ROI e contrassegna anche un ROI che rappresenta l'intensità della fluorescenza di fondo. Quindi, avviare la funzione di misurazione dal pannello di misurazione del tempo per misurare la fluorescenza grezza nel tempo per i ROI selezionati.
Dopo la misurazione, esportare le intensità di fluorescenza grezze nel software del foglio di calcolo. I neuroni corticali primari di ratto coltivati caricati con colorante stirilico sono mostrati qui. La specificità del carico del colorante è stata determinata dalla co-etichettatura con sinaptofisina con marcatore di vescicole sinaptofische e la maggior parte dei puncta positivi al colorante sterile sono co positivi per questo marcatore.
L'analisi dei valori di intensità grezzi durante l'intero periodo di imaging rivela che la sinaptofisina e l'intensità rimangono costanti mentre l'intensità del colorante stirilico diminuisce dopo la stimolazione. Per i neuroni di controllo trasfettati con proteina fluorescente verde, il successo del rilascio di vescicole sinaptiche ha provocato la sorprendente perdita di fluorescenza del colorante a causa dell'elevata depolarizzazione del cloruro di potassio. Questo video rappresentativo mostra un neurone che scarica selettivamente il colorante stirilico in una nuova regione destra dopo la stimolazione.
Al contrario, nei neuroni trasfettati con un C nove ORF 72 legato al costrutto di ripetizione del peptide del colorante a GA 50, la trasmissione sinaptica compromessa è rappresentata dalla fluorescenza del colorante mantenuta anche dopo un'elevata depolarizzazione del cloruro di potassio. Immagini rappresentative di fluorescenza di neuroni corticali trasfettati con GCaMP sei M prima e dopo la depolarizzazione del cloruro di potassio sono mostrate qui. L'aumento dei valori di fluorescenza e i neuroni corticali trasfettati con GCaMP six M indicano l'ingresso di calcio nei neuriti a seguito di depolarizzazione indotta dal cloruro di potassio.
Alla fine del periodo di registrazione basale, i neuroni hanno espresso GCaMP sei M con una bassa fluorescenza. Un drammatico aumento della fluorescenza viene quindi osservato all'inizio della stimolazione. Assicurarsi che le registrazioni basali di fluorescenza per il colorante stirilico e GCaMP siano stabili.
Usa sempre una messa a fuoco perfetta per evitare la deriva dell'immagine, il che renderebbe difficile l'elaborazione dei dati post-immagine. L'ulteriore coltura dei neuroni non è raccomandata, poiché i piatti sono esposti all'aria durante la profusione. Tuttavia, la colorazione immuno o l'estrazione di proteine o RNA può valutare le potenziali cause di alterazioni sinaptiche.
