Bu protokol kullanılarak, yüksek kaliteli bakteri hücresi lysates sadece yaygın olarak bulunan ortak laboratuvar ekipmanları kullanılarak üretilebilir ve bu da hücresiz gen ekspresyonunu çoğu araştırmacı için kolayca erişilebilir hale getirir. Program hücresel otolizi dondurarak çözme veya dondurarak-kuru döngü ile birleştirmek, hücresiz gen ekspresyasyonu için bakteriyel lizazların hızlı üretimi için pratik, işçilik ve uygun maliyetli bir yaklaşım oluşturulmasını sağlar. Mililitre ampisilin başına 50 mikrogram içeren LB agar plakalarına otoliz E.coli suşunun hücrelerini çizgi etmek için bir aşılama döngüsü kullanarak başlayın, ardından plakaları bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, bir pipet ucu kullanarak, agar plakasından tek bir koloni seçin ve ampisilinli LB ortamı içeren bir kültür tüpüne ekleyin. Bu başlangıç kültürünü bir gecede 37 santigrat derecede büyütün. Ertesi gün, mililitre ampisilin başına 50 mikrogram ile desteklenmiş 400 mililitre 2xYTPG ortamı içeren bir litre Erlenmeyer şişesine 400 mikrolitre marş kültürü ekleyin.
Kültürü 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve 300 RPM'de sallantıda. Spektrofotometre ve bir santimetre yol uzunluğuna sahip optik bir cuvette kullanarak, kültürün optik yoğunluğunu periyodik olarak 600 nanometrede ölçün. Optik yoğunluk biri aştığında, ölçümlerin tipik bir laboratuvar spektrofotometresinin doğrusal aralığında kalmasını sağlamak için ölçümlerden önce kültürü beş kat seyreltmeye başlayın.
Beş kat seyreltilmiş kültürün optik yoğunluğu 0,3'e ulaştığında, şişeyi inkübatörden çıkarın ve lisatı hazırlamaya devam edin. Lisatı hazırlamak için, hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatant dökün ve kalan sıvıyı bir pipet kullanarak çıkarın.
Peletin içine 45 mililitre soğuk S30A tamponu ekleyin ve peletı girdapla yeniden depoleyin. Ardından, hücreleri tüpe aktarmadan önce boş bir 50 mililitre santrifüj tüpü tartın. Hücreleri tekrar santrifüjle ve üstnatantı atın.
Kalan herhangi bir süpernatantı pipet kullanarak aspire edin. Tüpü tekrar tartın ve peletin ağırlığını elde etmek için boş tüpün ağırlığını görüntülenen ağırlıktan çıkarın. Her bir miligram hücre peletı için, iki milimoler dithiothreitol ile desteklenmiş iki mikrolitre soğuk S30A tampon ekleyin.
Daha sonra, güçlü girdap ile hücreleri yeniden depolar. Daha sonra, hücreleri pelet iyice donana kadar negatif 20 veya negatif 80 santigrat derecelik bir dondurucuya yerleştirerek dondurun, ardından bir oda sıcaklığındaki su banyosundaki ve girdaptaki hücreleri iki ila üç dakika boyunca kuvvetlice çözün. Hücreleri 300 RPM'de sallanarak 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın, ardından 30.000 x g'daki şeffaf santrifüj tüplerinde dört santigrat derecede 45 dakika santrifüj yaparak ağır hücresel döküntü örneğini temizleyin.
Peletin rahatsız olmamasına dikkat ederek, süpernatant'ı pipetli yeni bir tüpe dikkatlice aktarın. Aktarılan süpernatant peletten elde edilen malzeme ile kirlenmişse, santrifüjü tekrarlayın. Süpernatantı 1,5 mililitre santrifüj tüplerine aktarın.
Ve bir kez daha 21.000 x g'da veya bir masa üstü santrifüjün maksimum hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Temizlenen otomatik olarak istenen birimlere aliquot ve kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Otomatik elağar kullanarak hücresiz gen ekspresyolü için, sekiz mikrolitre otomatik doğrulama ve 8,9 mikrolitre ön karışımı buz üzerinde karıştırın.
20 mikrolitrelik son bir hacim elde etmek için sekiz nanomol, diğer gerekli reaktifler ve su son konsantrasyonuna DNA ekleyin. Reaksiyonu 384 kuyulu bir mikro plakaya ekleyin ve floresan zaman seyrini ve uç noktaları ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. Plazma DNA'sının seyreltme serisi ile otomatikleştirmeyi kullanan GFP ifadesi, bir nanomolar DNA ile bile güçlü ifade ile sonuçlanır.
Ticari olarak kullanılabilen bir lisat ile otomatikleştirme arasındaki GFP ifadesini karşılaştırdıklarında, otomatikleştirme GFP'nin karşılaştırılabilir düzeylerini üretir. Farklı araştırmacılar tarafından iki farklı laboratuvarda üretilen lysate partileri arasındaki değişkenlik yaklaşık iki kat içindeydi. En kritik üç değişken, hücre peletinin tampon oranına aktarılması, enkazsız süpernatant aktarılması ve son reaksiyonda optimum PEG ve magnezyum konsantrasyonu kullanılmasıdır.
Ekstrakt hazırlandıktan sonra, ClpXP aracılı bozulma veya AHL aracılı çekirdek algılama gibi E.coli hücresiz ifade sistemleri için geliştirilen mevcut protokollerden oluşan büyük bir cephanelik kullanılabilir.
