Usando este protocolo, as células bacterianas de alta qualidade podem ser produzidas usando apenas equipamentos de laboratório comuns amplamente disponíveis, tornando a expressão genética livre de células facilmente acessível à maioria dos pesquisadores. A combinação da autolise celular do programa com um ciclo de congelamento ou congelamento-seco permite criar uma abordagem prática, laboral e econômica para a produção rápida de lises bacterianas para a expressão genética livre de células. Comece usando um laço de inoculação para esticar as células de uma cepa de E.coli autolise em placas de ágar LB contendo 50 microgramas por ampicillina mililitro, em seguida, incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, usando uma ponta de pipeta, escolha uma única colônia da placa de ágar e adicione-a em um tubo de cultura contendo meio LB com ampicillina. Cresça esta cultura inicial a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione 400 microliters da cultura inicial em um frasco de um litro Erlenmeyer contendo 400 mililitros de meio 2xYTPG suplementados com 50 microgramas por ampicillina mililitro.
Incubar a cultura a 37 graus Celsius com agitação a 300 RPM. Usando um espectótmetro e um cuvette óptico com um comprimento de caminho de um centímetro, meça periodicamente a densidade óptica da cultura em 600 nanômetros. Quando a densidade óptica excede uma, comece a diluir a cultura cinco vezes antes das medições para garantir que as medidas permaneçam dentro da faixa linear de um espectrofotômetro de laboratório típico.
Uma vez que a densidade óptica da cultura diluída de cinco vezes atinja 0,3, remova o frasco da incubadora e prossiga para preparar o lise. Para preparar o lise, colde as células por centrifugação a 1.800 x g durante 15 minutos em temperatura ambiente. Despeje o supernatante e remova o líquido restante usando uma pipeta.
Adicione 45 mililitros de tampão S30A frio à pelota e resuspende a pelota com vórtice. Em seguida, pese um tubo vazio de centrífugas de 50 mililitros antes de transferir as células para o tubo. Centrifugar as células novamente e descartar o supernante.
Aspire qualquer supernante restante usando uma pipeta. Pesar novamente o tubo e subtrair o peso do tubo vazio do peso exibido para obter o peso da pelota. Para cada miligrama de pelota celular, adicione dois microliters de tampão S30A frio suplementado com dois dithiothreitol milimolar.
Em seguida, resuspende as células por vórtice vigoroso. Em seguida, congele as células colocando-as em um congelador negativo de 20 ou negativos 80 graus Celsius até que a pelota esteja completamente congelada, em seguida, descongele as células em um banho de água de temperatura ambiente e vórtice vigorosamente por dois a três minutos. Incubar as células a 37 graus Celsius por 45 minutos com agitação a 300 RPM, depois limpe a amostra de detritos celulares pesados por centrifugação em tubos de centrífuga transparente a 30.000 x g por 45 minutos a quatro graus Celsius.
Transfira cuidadosamente o supernatante para um novo tubo com uma pipeta, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Se o supernante transferido estiver contaminado com material da pelota, repita a centrifugação. Transfira o supernatante para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.
E centrífuga mais uma vez a 21.000 x g ou a velocidade máxima de uma centrífuga de mesa por cinco minutos. Aliquot o automaticamente limpo em volumes desejados e armazene a menos 80 graus Celsius até o uso. Para a expressão genética livre de células usando o autolise, misture oito microliters de autolysato e 8,9 microliters de pré-mistura no gelo.
Adicione DNA a uma concentração final de oito nanomoles, quaisquer outros reagentes necessários e água para obter um volume final de 20 microliters. Adicione a reação a uma microplaca de 384 poços e use um leitor de placas para medir o curso de tempo de fluorescência e os pontos finais. A expressão GFP usando o autolise com uma série de diluição de DNA plasmádulo resulta em forte expressão mesmo com um DNA nanomolar.
Ao comparar a expressão GFP entre um liseto comercialmente disponível e o auto-lysato, o autolysato produziu níveis comparáveis de GFP. A variabilidade entre lotes de lysate produzidos em dois laboratórios diferentes por diferentes pesquisadores foi em cerca de duas vezes. As três variáveis mais críticas são a razão de pelotização celular para tampão, transferindo supernanato livre de detritos e usando a concentração ideal de PEG e magnésio na reação final.
Uma vez que o extrato tenha sido preparado, um grande arsenal de protocolos existentes desenvolvidos para sistemas de livre expressão de células E.coli pode ser usado, como a degradação mediada pelo ClpXP, ou a detecção de quórum mediada pela AHL.
