Bu protokol, uzman olmayanların kendi kendine yeniden protein sentezini uygulama yöntemlerini basitleştirir ve açıklar. Bu yöntemlere daha iyi erişim, platformun ve sağladığı geniş uygulama kümesinin pazardan arındırılmasını sağlayacaktır. Bu tekniğin başlıca avantajları hız, maliyet-etkinlik ve reaksiyon kolaylığı diğer kendini yeniden protein sentezplatformları ile karşılaştırıldığında kurmak vardır.
Platformumuz fonksiyonel genomik, hythopertesting, biyosensörler, eğitim kitleri ve küçük değişiklikler, metabolik mühendislik ve genetik kod genişletme dahil olmak üzere bir dizi uygulama sağlayabilir. Bu teknik sadece temel laboratuvar eğitimi gerektirir ken, yeni kullanıcılar protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesi için sonication gibi teknikler kendilerini tanımak için plan gerekir. Bu yordamı başlatmak için metin protokolünde belirtildiği gibi tüm medya ve kültür E.coli hücreleri hazırlamak.
Bir buzlu su banyosu içine bir litre santrifüj şişe yerleştirin. Bir kez kültürler OD600 3.0 ulaşır, soğutulmuş şişe içine hücre kültürü dökün. Bir çift ışın dengesi kullanarak, santrifüj için bir denge oluşturmak için ilk olarak aynı tartmak kadar ikinci bir litre santrifüj şişe su ekleyin.
Santrifüjü dört santigrat dereceye kadar önceden soğuttuktan sonra, şişeleri 5, 000 g ve 10 santigrat derecede 10 derecede santrifüj edin ve hücreleri peletleyin. Bundan sonra, yavaş yavaş dökün ve supernatant atın. Hücre peletini buza yerleştirin.
Steril bir spatula kullanarak santrifüj şişeden hücre pelet kazımak ve soğuk, 50 mililitrekonik tüp aktarın. İki milimolar DTT ile takviye soğuk S30 tampon 30 mililitre ekleyin ve pelet tamamen hiçbir parça ile resuspended kadar buz üzerinde dinlenme süreleri ile kısa patlamalar girdap tarafından pelet yeniden askıya. Bundan sonra, 10 dakika boyunca 5, 000 g ve 10 santigrat derece numune santrifüj için bir denge olarak su ile dolu başka bir 50 milimetre konik tüp kullanın.
Dökün ve supernatant atın. 20 ila 25 mililitre soğuk S30 tamponu ile peleti yeniden askıya alın. Santrifüj 5, 000 g ve 10 santigrat derecede 10 dakika.
Dökün ve supernatant atın. Daha sonra, 30 mililitre S30 arabelleği ekleyin ve daha önce açıklandığı gibi bir girdap kullanarak peleti yeniden askıya alın. Üç önceden tartılmış, soğuk, 50 mililitrekonik tüpler ayarlayın.
Steril pipetli serolojik pipet dolgusu kullanarak, her tüpe on 10 mililitre pelet süspansiyon uyguluyor. 5, 000 g ve 10 santigrat derecede gerektiğinde uygun terazileri kullanarak tüm tüpleri 10 dakika santrifüj edin. Bundan sonra, dışarı dökün ve supernatants atın.
Pelet dokunmaktan kaçınmak için emin yaparken, erişim tampon kaldırmak için temiz bir doku ile her tüp ve kap içinde dikkatlice silin. Analitik bir denge kullanarak, tüpleri yeniden tartar ve her tüp için son pelet ağırlığını rapor edin. Başlamak için, her pelet hücre kütlesinin bir gram başına 2 milimolar DTT ile soğuk S30 tampon bir mililitre ekleyin.
Daha önce açıklandığı gibi peletleri yeniden askıya almak için bir girdap kullanın. Daha sonra her resuspended pelet 1.4 mililitre ayrı 1.5 mililitre Microcentrifuge tüpler içine aktarın. Bir tüpü bir kabın içinde buzlu su banyosuna yerleştirin ve tüpün altlarına veya kenarlarına değmeyecek şekilde sonicator sondasını yerleştirin.
45 saniye boyunca %50 genlik seti ile tüpü sonicate, ardından 59 saniye dinlenme. Kapalı dönemlerde tüpleri kapatıp ters çevirdiğinden emin olun. Sonication tamamlandıktan hemen sonra, lysate içine bir azı dtt 4.5 mikrolitre ekleyin.
Tüpü karıştırmak için birkaç kez ters çevirin ve sonra buz üzerine yerleştirin. Bu işlemi tekrarlayın, sonicating ve resuspended hücrelerin her tüp için DTT ekleyerek. 18, 000 g ve 4 santigrat derece 10 dakika boyunca örnekleri santrifüj.
Bundan sonra, pipet her supernatant yeni bir 1.5 mililitre Mikrocentrifuge tüp içine, pelet rahatsız olmadığından emin olmak için arkasında bazı supernatant bırakarak. Bir kuvöz sallayarak platformuna supernatant tüpleri alın ve 60 dakika boyunca 250 RPM sallayarak 37 santigrat derece onları kuluçka. Bu ikinci tur tepkisi.
Daha sonra, 10, 000 g ve 10 dakika boyunca dört santigrat derece de örnekleri santrifüj. Yeni tüpler e aktarılan pelet rahatsız etmeden her supernatant çıkarın. Depolama için ekstre birçok 100 mikrolitre aliquots oluşturun.
İlk olarak, çözülme çözeltisi A, b çözeltisi, DNA şablonu, BL21DE3 özü, T7 RNA Polimeraz ve buz üzerinde moleküler sınıf su aliquot. Daha sonra, CFPS reaksiyonu için gerekli olan Mikrosentrifuge tüpleri gerekli miktarda etiket. Pipetleme veya girdap ile her reaktif karıştırın, sonra etiketli reaksiyon tüpü ne solüsyon ekleyin, hücre ekstresi girdap değil emin olun ama bunun yerine karıştırmak için tüp ters.
Son reaksiyonun iyi bir şekilde karıştırıldığından emin olun ve her tüpün alt kısmında 15 mikrolitrelik tek bir boncuk halinde birleştirin. Her reaksiyonu 4 saat boyunca 37 derecede sitsimadan veya bir gecede 30 santigrat derecede inkübedin. Başlamak için, bir 96 iyi plaka almak ve 0.05 molar HEPES 48 mikrolitre pH 8 her iyi nicelleştirme için gerekli içine yükleyin.
Daha sonra, reaksiyon tüplerini kuvözden çıkarın. Her reaksiyonu yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın ve her reaksiyonun iki mikrolitresini HEPES içeren kuyulara aktarın. Yukarı ve aşağı borulama her iyi karıştırın.
Tüm reaksiyonlar yüklendikten ve karıştırıldıktan sonra plakayı bir florometreye yükleyin ve 485 nanometre uyarma dalga uzunluğu ve 510 nanometre lik emisyon dalga boyu kullanarak SFGFP uç noktası floresanlarını ölçün. Elde edilen floresan okumadan süper klasörlenmiş GFP konsantrasyonu belirlemek için önceden oluşturulmuş bir standart eğri kullanın. Bu çalışmada, bir sonication tabanlı E.coli ekstresi hazırlık araştırılmıştır.
Hücre peletleri ve hücre ekstresi en az bir yıl boyunca negatif 80 santigrat derecede kararlıdır. Ayrıca, hücre ekstresi verimlilik önemli bir kaybı olmadan en az beş donma-çözülme döngüleri uğrayabilir. Bu protokoldeki bazı adımlar, sistemin genel üretkenliğine zarar vermeden çeşitli olabilir.
En önemlisi, hücreler hücre ekstresi verimliliği üzerinde önemli bir etkisi olmadan 600 nanometre 2.7 ila 4.0 optik yoğunluk aralığında hasat edilebilir. Ancak, şablon DNA kalitesi CFPS reaksiyonunun hacimsel verimini etkileyen toplu iş-toplu değişkenlik kaynağıdır. Bu bir Midi veya Maxiprep ile DNA arındırıcı tarafından ek bir DNA temizleme adımı takip çözülür.
Reaksiyon kabı cfps reaksiyonunun hacimsel verimini de etkiler. Yüzey alanından hacim oranına bir artış, daha yüksek hacimsel verim ile sonuçlanır. CFPS reaksiyonunun hacimsel verimini optimize etmek ve hücre ekstresinin toplu-toplu değişkenliğini azaltmak için, her yeni ekstre hazırlığı için bir magnezyum titrasyonu yapılmalıdır.
Hücre ekstreleri mililitre toplam protein başına 30 miligram oluşan için, reaktif kullanımını en aza indirmek ve hacimsel verimi en üst düzeye çıkarmak için optimal magnezyum konsantrasyonu ve ekstresi hacmi sırasıyla 10 milimolar ve beş mikrolitre. Reaksiyon ölçeğini değiştirerek, kullanıcılar yüksek iş elde taramadan hedef proteinin daha büyük ölçekli ifadelerine kadar çeşitli yöntemler izleyebilirsiniz. Bu teknik iki temel avantaj sağlar, ilk protein ürünlerini daha hızlı bir şekilde teşler, ikincisi ise proteinleri ifade etmek zor sentezler.
Örnekler sitotoksik veya işlevleri için oksitleyici koşullar gerektiren proteinler içerir. Herhangi bir laboratuvar prosedüründe olduğu gibi, tüm reaktifler dikkatli davranılmalıdır. Ayrıca, santrifüjler her zaman dengeli olmalı ve kulak koruma sonication sırasında kullanılmalıdır.
