LISCA adı verilen Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesi de yüzlerce bireysel hücrenin floresan zaman kurslarının otomatik bir okumasıdır. Yaklaşımın avantajı, bireysel hücre yanıtlarının aynı mikro ortamlarda mekansal olarak izole edilmiş hücrelerden kaydedilmesi ve harika istatistiklerle verimli bir emisyon analizine izin vermesidir. Tek hücreli bir dizi yapmak için, PDM katmanından altı mikro toz çizgi içeren tek bir PDMs başyapıtını kesmek için bir neşter kullanın ve başyapıtı mikro desen yukarı bakacak şekilde laboratuvar tezgahına yerleştirin.
Altı mikropattern şeridin her birini PDM'ler damgasına kesmek için bir jilet kullanın ve damganın kenarlarının açık olduğundan emin olmak için desenli alanların bazılarını kesin. Daha sonra, slaydın kanal konumlarını işaretlemek için altı odalı bir kaydırağın kapak kaymasının koruyucu folyosunu dikkatlice çizin ve kapak fişini koruyucu folyo aşağı bakacak şekilde tezgaha yerleştirin. Kapak fişine damgaları işaretli kanal konumlarında, mikro desenler aşağı bakacak şekilde yerleştirmek için cımbız kullanın ve pulların ekini mikroskop altında kontrol edin.
Slaytla temas eden kareler ara alandan daha koyu görünür. Desen kalitesi, slayda düzgün bağlanmamış kareler tarafından azaltılır. Pullar güvenli bir şekilde tutturulmuşsa, kapak fişini ve pulları 0,2 milibar basınçta oksijen plazması ve yaklaşık 40 Watt ile üç dakika boyunca PDM'ler ve kapak kayması hidrofilik arasındaki yüzeyleri yapmak için tedavi edin.
Plazma temizliğinin sonunda, kapak fişini bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve çözeltinin damganın hidrofilik desenine emmesi için her damgaya 15 mikrolitre pegylated poli-l-lizin çözeltisi ekleyin. 20 dakika sonra pulları bir mililitre ultra saf su ile durulayın. Pulları slayttan çıkarmak için cımbız kullanın ve kapak kaymasını ikinci kez ikinci mililitre ultra saf su ile durulayın.
Kapak kayması tamamen kuruduğunda, mikro desenli alanların kanalların alt kısmına hizalaşına dikkat ederek kapak kaymasına altı kanallı yapışkan bir slayt takın. Ve her kanala 40 mikrolitre PBS ve 40 mikrolitre fibronektin çözeltisi ekleyin. İki çözeltiyi karıştırmak için, bir rezervuardan 40 mikrolitre çıkarın ve homojen bir çözelti üretmek için aynı kanalın karşı rezervuarine üç kez ekleyin.
Tüm kanallar karıştırıldığında, her kanalı yıkama başına 120 mikrolitre PBS ile üç kez yıkamadan önce oda sıcaklığında 45 dakika boyunca slaydı kuluçkaya bırakın. PBS'yi 37 santigrat dereceye değiştirin, bir rezervuara 120 mikrolitre orta ekleyerek kanallarda hücre büyüme ortamını tamamen destekleyin ve karşı rezervuardan çıkarın. Her kanala mililitre hücre başına 400.000 hücrenin 40 mikrolitresini ve her kanala 40 mikrolitre hücre büyüme ortamı ekleyin ve hücre çözeltisini gösterildiği gibi ortamla karıştırın.
Karıştırdıktan sonra, her kanaldan 40 mikrolitre süspansiyon çıkarın, böylece yalnızca kanallar hücre süspansiyonu ile doldurulur ve slaytı bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bir saat sonra, faz kontrastı mikroskopisi ile hücre yapışkanını kontrol edin ve her kanala 37 santigrat derece hücre büyüme ortamında 120 mikrolitre ekleyin, ardından slaytı üç saat daha hücre kültürü inkübatörüne geri döndürün. Bir perfüzyon sistemi kurmak için, 37 santigrat derece hücre büyüme ortamı ile dolu bir mililitre şırınnayı sistemin giriş tüpüne bağlayın ve tüpü orta ile doldurmak için vanayı kullanın.
Giriş tüpünü bir kanalın rezervuarına bağlayın, hava kabarcıklarının sıkışmadığına dikkat edin ve mevcut kanalın giriş tüpünün karşısındaki rezervuara bir seri konektör bağlayın. Gerekli sayıda kanal seri olarak bağlanana kadar kanalların geri kalanını gösterildiği gibi bağlayın. Ve çıkış tüpünü doğrudan son kanalın serbest rezervuara bağlayın.
Daha sonra perfüzyon sisteminin sızmadığını doğrulamak için bağlı tüpü orta ile doldurun. Hücrelerin hızlandırılmış görüntülemesi için, faz kontrast görüntüsünü ve floresan görüntüsünü kaydetmek için bir zaman atlamalı protokol ayarlamak için, faz kontrastı görüntüleme ve floresan görüntüleme için optik yapılandırmayı ayarlayın. Uzun süreli ölçümler için daha iyi bir görüntü kalitesi sağlamak için 10 kat hedef, uygun floresan filtreleri ve otomatik odak düzeltme sistemi kullanın.
Faz kontrastı görüntüleme için 10 milisaniyelik bir pozlama süresi ve EGFP floresan yoğunluğunu kaydetmek için 750 milisaniye pozlama süresi seçin. Konum listesindeki ardışık döngüler arasında 10 dakikalık bir zaman aralığı ve 30 saatlik bir gözlem süresi ile bir zaman çizelgesi ayarlayın. Daha sonra, altı kanalı mikroskobun 37 santigrat derecelik ısıtma odasının numune tutucusuna tek mahzen yükselticisine yerleştirin ve perfüzyon sistemi borusunu sahneye bantleyin.
Sıvı atıkları toplamak için çıkış tüplerinin serbest uçlarını 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Ve pozisyon listesinin ardışık döngüleri arasında tanımlanan zaman aralığında konum sayısının taranabilmesine dikkat ederek, tarama zaman atlamalı ölçümü için konum listesini ayarlayın. Ardından zaman atlamalı ölçüme başlayın.
Hücrelerin floresan işaretleyici ile transfeksiyonu için, mikroskop aşamasının hareket etmemesine dikkat ederek, boru sistemini 37 santigrat derece PBS'lik bir mililitre ile yıkamak için bir şırınga kullanın. Kızardıktan sonra, sistemi 300 mikrolitre serumla doldurun, ilgi mRNA ile desteklenmiş orta, mikrolitre başına 0,5 nanogram mRNA'lık son konsantrasyona ve lipoplexlerin bir saat boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin. Kuluçkanın sonunda, sınırsız mRNA'yı çıkarmak için sistemi 37 santigrat derecelik bir mililitre tam hücre büyüme ortamı ile yıkayın.
Analizin sonunda, kanal menüsünde listelenen kanalları görüntüleyin ve önceden seçilmiş hücreleri ve entegre floresan sinyallerini incelemek için zaman dilimlerinde ilerleyin. Floresan zaman kursunu vurgulamak için ilgi çekici bir hücreye tıklayın veya ilgili hücreyi bulmak için bir zaman kursuna tıklayın. Seçmek veya seçimi devre dışı yapmak için hücreyi tıklatırken shift tuşuna basın.
Bir yapışma noktasıyla sınırlı olmayan veya başka bir hücreye bağlı olan hücreleri daha fazla analizden dışlamak için seçin. Tüm hücreler uygun şekilde seçildiğinde veya seçimi kaldırıldığında, hücre alanı ve tümleşik floresan için tek hücre zamanı derslerini uygun bir dizine kaydedin. Transfection sonrası çeviri başlangıç süresini ve hücresel EGFP ekspresyonunun gücünü ölçmek için üç aşamalı bir çeviri modeli kullanılabilir.
EGFP için model çözümü, gösterildiği gibi tek hücreli zaman kurslarına takılabilir. Burada çeviri başlangıç zamanının histogramları ve lipoplex transfected hücrelerin ekspresyon oranı gözlenebilir. Her iki parametre de her hücre için tahmin edildiğinden, bu parametrelerin korelasyonu dağılım grafiğinde gösterildiği gibi ve lipid nanopartikülleri ile transklüse edilmiş hücrelerle karşılaştırılabilir.
Gösterildiği gibi, lipid nanopartikülleri ile enfekte olan hücreler, lipoplexes ile enfekte olmuş hücrelere kıyasla daha az hücreden hücreye değişkenlik gösterir. Ve nüfus ortalaması çevirinin daha hızlı başlangıcını ve daha yüksek bir ifade oranını göstermektedir. Yaklaşımımız alternatif mikro-desenleme yöntemlerine de uyarlanabilir.
LISCA için en önemlisi, iyi bir hücre hapsi ve uygun bir kullanıcı gözetimi ile otomatik görüntü analizinin bir kombinasyonudur. Gördüğünüz gibi, hücre davranışı heterojendir. Ve tek hücreli zaman atlamalı filmler, doğal biyokimyasal ağların tarafsız dinamiklerine erişim sağlar.
Örneğin, yeşil ifadede, apoptoz veya hücre öldürme tahlilleri.
