Biz yazının eleştirel okuma Dr. Grant Sumida teşekkür ederim. Bu çalışma, Beckman Genç Araştırmacı Ödülü (SY), Hellman Aile Yeni Fakülte Ödülü (SY), NIH EUREKA, University of California Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi tarafından desteklenmiştir.

1. Istikrarlı hücre hattı oluşturma (örneğin MDCK hücreleri) <ol><li> P35 çanak confluency% 80-90 Plaka hücreleri. Hücrelerin transfeksiyon verimliliği azaltacaktır% 100 konfluent tek tabaka oluşturur izin vermeyin. </li><li> Lipofectamine 2000 kullanarak ilgi plazmid hücreleri Transfect. Transfeksiyon koşulları üreticinin protokolü kullanılarak optimize edin. </li><li> Ertesi gün, geçit, iki P150 petri kutularının içine hücreler. Büyük bir çanak stabil kolonileri arasında yeterince boşluk izin tavsiye edilir. </li><li> Ertesi gün, medya değiştirmek ve her yemek için 500 mg / ml G418 ekleyin. G418 konsantrasyonu ayrı hücre hatları için optimize edilmelidir. </li><li> Yaklaşık 2 hafta boyunca her gün medya değiştirin. 2 hafta sonra, G418-dirençli koloniler oluşturmaya başlar, ve çıplak gözle görülebilir. </li><li> Ters bir floresan mikroskop kullanarak, GFP pozitif koloniler tespit. Plaka üzerinde bir sharpie kalem kullanarak bu koloniler işaretleyin. </li><li> Selektif, doku kültürü plakadan koloniler trypsinize, medya aspire ve hücreler iki kez PBS veya tripsin çözüm ile yıkayın. Ikinci yıkama, tüm çözüm aspire yok. Plakanın altındaki sıvı ince bir tabaka hücreleri kurumasını önlemek için bırakın. </li><li> Her işaretli koloni için koloni kenarı etrafında temizlemek için mümkün olduğunca yakın steril bir pamuklu bir bez kullanın. Bu hücre koloni içeren ıslak alan bir ada yaratacaktır. Pipet 10 ul koloni üzerine tripsin. Her koloni için tekrarlayın ve kurutma önlemek için hızlı bir şekilde devam edin. Deneyimli bir araştırmacı genellikle ~ P150 plaka başına 12 koloniler alabilirsiniz. </li><li> 37 o plaka ° C&#39;de 5-10 dakika hücreleri ayırmak plaka ve yuvarlak görünene kadar. </li><li> Her koloni için: Pipet 10 koloni üzerine tripsin ul ve plaka hücreleri ayırmak için birkaç kez aşağı ve yukarı pipetle. Sonra 24 iyi bir çanak tek bir kuyuya koloninin tüm hücreleri pipetle. </li> &lt;li&gt; stabil kolonileri büyüdü sonra, her koloninin protein ifade standart western blot ve immünofloresan kullanılarak analiz edilmektedir. Daha fazla analiz için bu hücre hatları genişletin. </li></ol> 2. En iyi kolajen bağlama (isteğe bağlı) cam alt çanağı yüzey modifikasyonu <ol><li> P35 10 mm açılması ile her yemeğin cam kısmı üzerine cam silanize için,% 2 pipet 300 ul 3-Aminopropyltrimethoxysilane çözüm. Silanization ve çapraz bağlama şematik Şekil 1&#39;e bakınız. 3-Aminopropyltrimethoxysilane filtrelenmiş su ile seyreltilir. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> 3-Aminopropyltrimethoxysilane çözüm aspire edin ve her 10 dakika için filtrelenmiş su ile üç kez yıkayın. </li><li> 50 ° C 1,5 saat, su ve sıcak plaka üzerinde yer yemekleri aspire. Yeri üstleri biraz çanak kapalı yemekleri tabak içinde bu nem kaçabilir. </li><li> Isı yemekleri çıkarın ve coo izinl. </li><li> Pipet 300 ul% 2 cam bölümü her yemeğin üzerine glutaraldehid çözüm. Glutaraldehid PBS içinde seyreltilir. </li><li> 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Glutaraldehit solüsyonu aspire edin ve her biri 10 dakika PBS üç kez bulaşıkları yıkamak. </li><li> 1 saat süreyle UV ışınlarına maruz kalma yemekler sterilize edin. Silanlanmış yemekler oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol> 3. Tracer parçacıkları ile 3D kollajen jel hazırlanması <ol><li> 5 dakika 15.000 rpm&#39;de santrifüj stok tracer partiküller (parçacıklar: 10 10 / ml) 100 ul iplik floresan tracer parçacıklar yıkayın, sıvı dışarı aspirat ve 500 ul medya ekleyin . 5 kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, medyanın 30 ul tekrar süspansiyon parçacıklar. </li><li> GFP ifade hücrelerin her zamanki gibi Trypsinize. </li><li> Yeniden süspanse hücre pelletini yaklaşık 2 x 10 6 hücre / ml. </li><li> Pipet 240 ul Eppendorf tüpe büyüme medya. </li><li> 1M HEPES 12.6 ul, 20 ul filtrelenmiş su, hücre çözüm 50 ul, sonra floresan parçacıklar 10 ul ekleyin. </li><li> Son olarak, sığır dermis Kolajen I çözümü (1 mg / ml &#39;lik bir çalışma konsantrasyonunu elde etmek için) 167 ul ekleyin. </li><li> Iyice çözüm karıştırın, daha sonra Silanlanmış cam alt çanağı cam kısmı üzerine çözüm pipetle 80 ul. </li><li> Inkübatör içine yerleştirin çanağı ve jel 37 polimerize izin ° C de 30 dakika boyunca. P35 cam alt çanak tipik kollajen jel Şekil 1A bakın. </li><li> Her çanak büyüme ortamı dikkatli bir şekilde 2 ml ekleyin. </li></ol> 4. Time-lapse görüntü elde etme Prosedürü <ol><li> Mikroskop muhafaza sıcaklık kontrolü açın ve 37 ° C kapsamında odasında bir kararlı durum sıcaklık dengelenmesi Canlı hücre görüntüleme sistemi bir örneği için Bkz: Şekil 2. </li><li> , Nötr bir pH&#39;ı korumak için 25 mM HEPES ile desteklenmiş yeni medya medya değiştirin. IçinDIC görüntüleme, tabak cam üst bir üst değişimi. Parafilm ince bir şerit kullanarak, medya buharlaşmasını önlemek için çanağı yan kapağı. </li><li> Immersiyon yağı hedefi için, objektif bir damla immersiyon sıvısının yerleştirin. </li><li> Mikroskop sahnede çanak içeren kollajen jel yerleştirin ve çanak daldırma sıvı ile temas edinceye emin olun. </li><li> Örnek ve resme ilgi hücreleri aramak için odaklanın. Sahne kayma en aza indirmek için, bulaşık, uzun bir yakalama başlamadan önce yaklaşık 45 dakika boyunca yerleşmek için izin verir. </li><li> Görüntü elde parametrelerini belirtin. Modüle lazer gücü, maruz kalma süresi, sıklığı ve süresi yakalama zaman, hücrelere zarar verebilir lazer pozlama, en aza indirin. Gerçek parametreler mikroskop sistemi ve hücre tipine göre değişir. </li><li> Time-lapse satın alma sırasında, bir inhibitörü eklenebilir. Inhibitörü Ayrıca deney için, parafilm çanak mühür yoktur. <ol><li> HazırlıkHEPES istenen bir çalışma konsantrasyonu ilaç ile medya eklenmiştir. </li><li> Duraklatmak görüntü yakalama, medya, ilaç ve dikkatli bir şekilde, çanak bozmadan çanak üst kaldırmak için ne zaman hazır. </li><li> Çanak medya aspire, ve çanak içine medya içeren ilaç pipetle. Sonra, çanak üst dikkatli bir şekilde değiştirin. </li><li> Örnek olabilir ek olarak yeni medya nedeniyle out-of-focus, odak ayar yapın. </li><li> Yakalama yeniden başlatın, sonra sonraki 30 dakika için yakalama izlemek ve gerektiğinde odak yeniden ayarlamalıdır. Ilaç Ayrıca deney bir örneği için Bkz: Şekil 4. </li></ol></li></ol> 5. Sıkı bağlamak prosedürü ve analizi <ol><li> Sıkı bağlamak kurulum sistemleri arasında, üreticinin talimatları takip edin değişir. </li><li> Canlı hücre görüntüleme için parametreleri ayarlayın. </li><li> Photobleaching için parametreleri ayarlayın. Hücrenin zarar vermeden floresan sinyal photobleach için yeterli lazer gücünü kullanın. Test bu paruygulama hücreleri üzerinde koşulları uygun olarak belirlenmelidir. </li><li> Görüntü yakalama başlatın ve ilgi bölge photobleaching önce en az 5 kare görüntü yakalama izin verir. </li><li> Yakalama devam edin ve kurtarma zamanı tam floresan kurtarma yakalamak için yeterli olmalıdır. Sıkı bağlamak deney bir örnek için Şekil 5&#39;e bakınız. </li><li> Floresan kurtarma photobleached alanının ortalama floresan yoğunluğu (önce ve photobleaching sonra), zamanla ölçerek analiz edin. Istatistiksel analiz yazılımı (örneğin Excel) kullanarak, üstel denklem için kurtarma eğrisi uyum: I = f (1-e-kt), ben ben f son şiddeti, yoğunluğu, t zamanı ve τ ½ yarım nihai değere ulaşmak için yoğunluk için gereken zamanı: τ ½ = ln (2) / k Yarı zamanlı, protein hareketlilik oranının bir ölçüsüdür. </li><li> Parametreleri, yarı zamanlı ve uygun üstel eğri nihai yoğunluğu elde edin. Inci hesaplayıne final ilk floresan yoğunlukları oranı alarak mobil kesir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Matriks içinde sağlıklı epitel hücreleri canlı hücre görüntüleme bir örnek Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Sağlıklı hücreler, düzgün, sürekli bir membran ve farklı çekirdeği sağlıksız hücrelerin sık sık kesintiye membran ve aşırı sayıda vakuol iken sergilerler. 3 boyutlu bir matris, tek epitel hücreleri 1 göç ve birkaç gün boyunca, epitel hücreleri içinde matris 2 üç boyutlu, küresel, çok hücreli kistler oluşturur. Hücreler de son derece dinamik ve kist içinde göç (Şekil 3). Çevresindeki matriks (Şekil 4), gömülü tracer parçacıkların yer değiştirme yoluyla göç eden hücreler tarafından uygulanan çekiş güçlerinin bir sonucu olarak matris deformasyon analiz edilir. Tracer parçacık hareketleri, farklı bir maksimum projeksiyon görüntü olarak görüntülenir.ent zaman noktalarında, ve her seferinde noktası (Şekil 4B) göstermek için sözde renkli. Alternatif olarak, bireysel bir tracer parçacık görüntüleri (Şekil 4C) zamanla izleme parçacık hareketi göstermek için bir montaj olarak görüntülenir. ImageJ Tüm görüntü analizi kullanılarak yapıldı. Bu matris deformasyon nitel değerlendirmeler ve bu nedenle göç eden hücreler tarafından uygulanan kuvvetler, çekiş kuvveti dağılımı faydalı ilk yaklaşımdır. 3D göçmen hücreler tarafından uygulanan çekiş güçleri kantitatif tahmini Bu protokol kapsamı dışında ve başka bir yerde 3,4 açıklanmıştır. Deney photobleaching sonra tipik bir floresan kurtarma Şekil 5&#39;te gösterilmiştir. Ilgi bölgesi floresan yoğunluğu gözle görülür sağlıklı ve bozulmamış hücrelerin korurken arka plan düzeyleri (sinyal-gürültü oranı en üst düzeye çıkarmak için) göre azalmış, böylece optimize edilmiş lazer ayarları kullanarak photobleached olmalıdır. En iyi ayar b gerekirHer sıkı bağlamak kurulum farklı olarak e deneysel olarak belirlenir (örneğin, sıkı bağlamak kullanarak lazer tarama konfokal sistem). Maruz kalma sonrası sıkı bağlamak görüntü elde etme ve zaman aralığı dikkatle arka plan photobleaching önlemek için kontrol edilmelidir. Daha düşük lazer gücü, kısa maruz kalma süresi, ve duyarlı kamera kullanımı ve yüksek verimli optik kullanımı, yüksek kaliteli sıkı bağlamak görüntüleme için çok önemlidir. Floresan görüntü alımı sırasında beyazlatma önemli ise, bu arka plan solmaya sayısal ve gözlenen floresans yoğunluğu kurtarma gelen normalize edilmelidir. 3D çevre doğası nedeniyle, floresan kurtarma z bileşeni önemli hale gelebilir. Bu nedenle, photobleached bölgenin öncesi ve sonrası 3D yığın görüntüleri alarak photobleached hacmi tanımlamak için önemlidir. Daha fazla analiz ve modelleme floresan kurtarma, başka bir yerde 5,6 tartışılmıştır. Canlı hücre görüntüleme t eşsiz kombinasyonuechniques: GFP matris deformasyon ve inhibitörlerinin yanı sıra izlemek için sitoskeletal proteinler, kırmızı floresans tracer parçacıklar dinamikleri takip etmek, protein dinamiği, çekiş gücü ve moleküler yollar analizi için aynı anda kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> Şekil 1 kollajen jel hazırlanması. A) cam alt çanak Polimerize kollajen matriks. Pembe renkli jel gömülü floresan parçacıklar nedeniyle. B) Usulü cam yüzey kollajen jel çapraz bağ cam alt yemekleri tedavisinde. İlk olarak, cam alt çanak 3-Aminopropyltrimethoxysilane çözüm, cam kollajen matriks çapraz bağları glutaraldehid çözümü ile tedavi edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> Şekil 2 sıkı bağlamak / konfokal mikroskop kurulum Şemalar. Konfokalmikroskop CoolSnap HQ II CCD kamera ile Zeiss AxioObserver dayalı ve tamamen Slidebook yazılımı (Akıllı Görüntüleme Yenilikler) tarafından otomatik. Konfokal birim özel tasarlanmış ve iki lazerler arasında geçiş milisaniye izin Yokogawa dönen disk ünitesi CSU10 Acousto Optik Ayarlanabilir Filtresi (AOTF) ile iki katı hal lazerleri (50 mW gücünde ve 40 mW ile 561 nm ile 488 nm) dayanmaktadır. Emisyon filtreleri (# 118.661 ve 118.085, Chroma Teknolojisi) 525 / 50 nm ve 620 / 60 nm ve dikroik ayna 488-568 BrightLine Çift bant (Semrock). Hedefleri NA 1.1 ve 0.62 mm çalışma mesafesi ile uzun bir çalışma mesafesi 40x C-Apochromat amacı, NA 1.4 ile 63x Plan-Apochromat amacı ve 0.19 mm çalışma mesafesi vardır. Mikroskobu, bir fiber optik dye lazer, bilgisayar kontrollü bir ışın konumu ve yoğunluğu ve kırınım sınırlı spot büyüklüğü pompalanır oluşan bir sıkı bağlamak photoablation sistemi içerir. Ayrıca, mikroskop ile donatılmıştır.her eksen üzerinde 0.1 mikron doğrusal kodlayıcılar içeren bir xy motorlu sahne. Time-lapse görüntüleme sırasında, çevre sıcaklığı, özel olarak tasarlanmış bir mikroskop odası ve bir geri bildirim sıcaklık kontrolü ile bir ısıtıcı tarafından yapılmaktadır. Herhangi bir gürültü ve titreşim izole etmek için, tüm mikroskop sistemi titreşimsiz bir masaya. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> Şekil 3 GFP-aktin ifade epitel hücrelerinin hücre görüntüleme yaşayın. Bu hücreler kültür 3D kollajen matriks 4 gün sonra bir kist oluşmuş. Diğerleri (kırmızı ok ucu) içinde kist iç göç ederken bazı hücreler, kist (sarı ok ucu) yüzeyi boyunca hareket eder. Ölçek çubuğu 10 mm, saat zaman. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> Şekil 4 çekiş kuvveti etkisi Rho-kinaz inhibisyonu. A) G ifade göç MDCK hücre DIC görüntüFP nükleer işaretleyici etiketli. Görüntü Rho-kinaz inhibitörü Y-27.632 tedavisi hemen önce çekildi. Ölçek çubuğu 10 mm. B) Parçacık deplasman Y-27.632 ek kaynaklanan. Parçacık konumları farklı zaman noktalarında (0 - 52 dakika) yoğunluğunu ölçeğine göre sözde renkli, daha sonra tek bir görüntü yansıtılıyor. Beyaz bölgeye göç eden hücreler, GFP pozitif çekirdeğini oluşturur. Ölçek çubuğu 10 mm. Saat dakika. C) hücre firar kenarında parçacık hareketi B (ok). Asterisk Y-27.632 ek önce çekilen son kare gösterir. Tracer parçacık sırasıyla, doğru ve önce uzağa göç hücre sondaki kenar ve Y-27.632 eklenmesinden sonra taşındı. Ölçek çubuğu 1 mikron. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> Şekil 5, üç-boyutlu bir matris hücre göç ifade GFP-aktin sıkı bağlamak analizi . A) Timelapse görüntüleri GFPaktin hücre photobleaching öncesi ve sonrası dile getirdi. GFP-aktin hücre arka tarafta biriken küçük bir bölge timepoint 0 (kırmızı ok ucu) photobleached. Saniye Saat, ölçek çubuğu 5 mikron. B) photobleached bölgesi (düz çizgi) ve floresan kurtarma (daireler) üstel uyum ortalama floresan yoğunluğu zamanla çizilir. Floresan yoğunluğu photobleaching önce başlangıç ​​değeri normalize edildi.

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada, üç boyutlu bir matris hücre göçü mekanizmaları çalışma canlı hücre görüntüleme kullanmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin başarı stably GFP-etiketli proteinlerin ifade &quot;iyi&quot; klonlar elde bağlıdır. GFP proteinlerin düşük seviyesi çok yüksek, GFP seviyesi hücrede istenmeyen yan etkileri var ise, hücre sağlığını tehlikeye atar aşırı uyarım pozlama gerektirir. Böylece, hücre içine genler transfect vektör seçim (örneğin, organizatörü, floresan etiketi, vb) önemlidir. GFP, kırmızı floresan proteini (RFP) 7,8 dahil olmak üzere daha başka birçok floresan etiketleri vardır. Bu protein etiketleri belirli bir ikaz ışığı dalga boyu ve floresan filtreleri bu nedenle farklı ayarlar gerektirir. Buna ek olarak, farklı antibiyotik dirençli genler (örneğin, G418, hygromycin, puromycin vb) de mevcuttur ve kararlı klonlar oluşturmak için kullanılabilir. Canlı hücre görüntüleme için, geçici olarak hücrelerin c transfektebir de kullanılır. Bu, zaman ve kararlı bir hücre hattı geliştirmek için gerekli çabayı en aza indirir olsa da, geçici olarak transfekte hücreler genellikle sağlıksız ve deneylerde kullanmak için bu nedenle daha az güvenilir. Buna ek olarak, hücrelerinin geçici olarak transfekte nüfusun heterojen bir karışım hücreleri ifade ve olmayan ifade ve ifade hücreler zamanla floresan protein ekspresyonu kaybedersiniz. Buna karşılık, ifade seviyesini geçici olarak ifade hücrelerin daha düşük olmasına rağmen stabil bir şekilde ifade hücreleri genellikle hücreleri ve protein ifade istikrarlı ve homojen olmalı, tek bir koloni klonlanmış vardır. Istikrarlı hücrelerinin, koloninin tek bir hücre kaynaklı olması muhtemel olduğundan, transfekte plazmid sürece, (sadece o klonu özgü fenotipleri önlemek için, morfolojisi ve normal, untransfected hücrelere benzer bir davranış koloniler almak için önemlidir. ) hücre morfolojisi karıştırmayı için tasarlanmıştır. Çoklu koloniler eski için kullanılması gerekenperiments klonal varyasyonu nedeniyle fenotipleri önlemek için. Alternatif olarak, viral transfeksiyon veya elektroporasyon ilgi genleri tanıtmak için kullanılıyor olabilir. Bu viral transfeksiyon zor transfect hücreleri veya birincil hücre (diğer transfeksiyon teknikleri ayrıntılı protokolleri bu dergide başka açıklanan) için yararlıdır. Bu prosedürün trickiest parçası subcloning. Kararlı klonlar pamuklu yöntem klonlama halkasını kullanarak, ya da alternatif olarak, burada açıklanan kullanılarak alınabilir. FACS GFP-pozitif hücrelerin seçimi için başka bir yöntem kullanıyor. FACS sadece floresan yoğunluğunun büyüklüğü dayalı hücreleri seçer. Buna karşılık, burada açıklanan klonlama yöntemi kullanarak, kullanıcı GFP ifade düzeyi ile değil, aynı zamanda bir mikroskop kullanarak hücresel yerleşimi sadece görsel olarak tanıyabilirsiniz. Ayrıca, FACS kullanarak klonlama tipik bir hücre daha heterojen nüfus sonuçları. Bu sorunu aşmak için, FACS sıralanmış hücreler olabilirher yanı, sadece tek bir hücre içerir, böylece doğrudan 96 kaplarına kaplamalı. Kolonileri tek hücrelerden kaynaklanan homojen bir nüfus olmalıdır. Kollajen matriks (Şekil 1) cam alt çanak bağlamak için kullanılan yöntem, uzun bir süre için bir jel canlı hücre görüntüleme ve kültür hücreleri için kritik öneme sahiptir. Matris cam takmak için ilk adım bir silan tek tabaka oluşumu. Bir tek tabaka yatırmak için silan başarısızlığı genellikle camdan kollajen matriks dekolmanı neden olacaktır. Bu matriks içinde gömülü hücreler kasılma çekiş güçleri uygulamayın ve matris küçültmek için neden, böylece yemeğin matris dekolmanı olasılığını artırarak çünkü. Bu nedenle, yemeğin silan / glutaraldehid tedavi için jel bulaşık eklenti korumak için kritik öneme sahiptir. Kollajen montaj koşulları (konsantrasyon, zaman, ve pH) farklı kollajen tip ve parti için optimize gerekebilir unutmayın. IçindeAyrıca, protokol farklı tipleri ile kollajen veya Matrigel veya matris 9 elde edilen fibroblast gibi diğer 3D jeller kullanılabilir. Birçok hücre HEPES tamponu yanıt olumsuz etkiler görünmüyor olsa da, bazı hücreler daha finicky. Time-lapse edinimi sırasında hücre sağlığını korumak için, CO 2 inkübatör mikroskop kasasının içindeki pH kontrolü eklenebilir. Buna ek olarak, hücrelerin lazer maruziyet en aza indirilmelidir. Hücreler tarafından yayılan floresan çok zayıfsa, floresan daha duyarlı bir kamera, ya da daha iyi bir hedefi ya da daha verimli bir filtre seti kullanarak daha etkin bir şekilde toplanmış olabilir, mikroskop muhafaza içinde Hücre morfolojisi morfolojisi ile karşılaştırılmalıdır CO 2 inkübatör hücreleri sağlıklı ve normal davranmaya emin olun. Bu yöntem tek bir hücre tabanlı testlerin açıklar, bazı hücre-hücre değişimi bekleniyor. Bu nedenle, deney ve veri sıfatıyla tekrarntification gereklidir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kollajen, sığır, Tip I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Stok 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Suda sulandırınız </td></tr><tr><td> glutaraldehid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> PBS içinde seyreltin </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres polistiren mikroküreler 1 mikron, kırmızı floresans (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Kültür medya bileşenleri: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Geleneksel olarak, hücre göçü, iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Ancak, yara iyileşmesi, doku rejenerasyonu ve kanser metastazı gibi önemli biyolojik süreçleri sırasında, hücrelerin karmaşık, üç boyutlu ekstrasellüler doku ile dolaşmak gerekir. Bu biyolojik süreçlerin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için, hücre göçü sürüş için sorumlu proteinlerin rollerini incelemek için önemlidir. Burada, epitel hücre hattı (MDCK) kullanarak hücre göç mekanizmaları incelemek için bir protokol taslağı, ve üç boyutlu bir model sistem olarak, lifli, kendi kendine polimerize matris. Bu optik net ekstraselüler matriks, canlı hücre görüntüleme çalışmaları kolayca mükellef ve fizyolojik, yumuşak doku ortamı daha iyi taklit eder. Bu rapor doğrudan protein yerelleştirme ve dinamikleri görselleştirmek için tekniği ve çevresindeki üç boyutlu matris deformasyon gösterir. Sınavhücresel süreçleri sırasında protein yerelleştirme ve dinamikleri ination protein fonksiyonları önemli bir fikir verir. Genetik olarak kodlanmış olan floresan etiketleri protein yerelleştirme ve dinamikleri gözlemlemek için benzersiz bir yöntem sağlar. Bu tekniği kullanarak, anahtar hücre içi birikimi analiz edebilir, kuvvet üreten matris yoluyla hücre manevraları gibi gerçek zamanlı sitoskeletal bileşenleri. Buna ek olarak, farklı dalga boylarına sahip birden fazla floresan etiketlerini kullanarak, biz, böylece bize farklı proteinler benzer veya birbirinden farklı rollere sahip olup olmadığını, örneğin, test etmek için izin proteinlerin aynı anda birden fazla lokalizasyonu inceleyebilirsiniz. Ayrıca, floresan tagged proteinleri (sıkı bağlamak) analizi Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak dinamikleri belirlenebilir. Bu ölçüm testleri, protein hareketlilik ve nasıl stably proteinler bağlı iskelet ağ. Canlı hücre görüntüleme protein fonksiyonu inhibitörlerinin tedavi ile birleştirerek,proteinleri ve göç eden hücrelerin morfolojisi dağıtım gerçek zamanlı değişiklikleri inceleyebilirsiniz. Ayrıca, biz de hücre göçü sırasında matris deformasyon görselleştirmek için matris içinde gömülü floresan tracer parçacıkların kullanımı ile canlı hücre görüntüleme birleştirir. Böylece, kuvvet üreten bir göç hücre proteinleri nasıl dağıttığını görselleştirmek, nerede ve çekiş güçleri çevreleyen matriks sarf edilir. Bu teknikler sayesinde, hücre göçü mekanizmaları spesifik proteinlerin ve onların katkılarını rolleri içine değerli bilgiler elde edebilirsiniz.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

live-cell-imaging-migrating-cells-expressing-fluorescently-tagged

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K Görüntüleme.  University of California, Davis. Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Video: Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Gelişim Biyolojisi

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Tıp

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Biyomühendislik

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Kanser Araştırmaları

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using three-dimensional (3D) cell-based invasion and migration assays. In this study, we have optimized these 3D assays for live-cell immunocytochemistry. An Antibody Labeling Reagent was used to detect in real-time the expression of the adhesion molecule CD44, on the plasma membrane of migrating and invading cells of a DMG H3K27M primary patient-derived cell line. CD44 is associated with cancer stem cell phenotype and tumor cell migration and invasion and is involved in the direct interactions with the central nervous system (CNS) extracellular matrix. Neurospheres (NS) from the DMG H3K27M cell line were embedded into the basal membrane matrix (BMM) or placed onto a thin coating layer of BMM, in the presence of an anti-CD44 antibody in conjunction with the antibody labeling reagent (ALR). The live-3D-cell immunocytochemistry image analysis was performed on a live-cell analysis instrument to quantitatively measure the overall CD44 expression, specifically on the migrating and invading cells. The method also allows visualizing in real-time the intermittent expression of CD44 on the plasma membrane of migrating and invading cells. Moreover, the assay also provided new insights into the potential role of CD44 in the mesenchymal to amoeboid transition in DMG H3K27M cells.

This study presents a protocol of live-3D-cell immunocytochemistry applied to a pediatric diffuse midline glioma cell line, useful to study in real-time the expression of proteins on the plasma membrane during dynamic processes like 3D cell invasion and migration.

Pediatrik Diffüz Orta Hat Gliomunun Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Analiz