Bu çalışma NIH hibeleri tarafından finanse edildi: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & T32 Eğitim Hibesi 5T32GM081740

Tüm hayvan protokolleri Güney Carolina Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından incelendi ve onaylandı.
1. Stok çözeltisi hazırlama
<ol><li>Çözelti 1 (1 L): 900 mL'ye deiyonize H2O, 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ve 2 mL Triton X-100 ekleyin.</li>
	<li>Çözüm 2 (1 L): 900 mL deiyonize H2O'ya, 10x PBS'nin 100 mL'si, 2mL Ara-20 ve 1 mL'lik 10 mg/mL Heparin stok çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Çözelti 3 (500 mL): 400 mL Çözelti 1'e 11,5 g glisin ve 100 mL dimetilsüllfoksit (DMSO) ekleyin.</li>
	<li>Çözelti 4 (50 mL): 42 mL Çözelti 1'e, karşılık gelen serumun 3 mL'si ve 5 mL DMSO ekleyin.</li>
	<li>Primer antikor çözeltisi (50 mL): Çözelti 2'nin 46 mL'sine 2,5 mL DMSO ve karşılık gelen serumun 1,5 mL'si ekleyin.</li>
	<li>İkincil antikor çözeltisi (50 mL): Çözelti 2'nin 48,5 mL'sine karşılık gelen serumun 1,5 mL'sini ekleyin. NOT: Çözüm 4, birincil çözelti ve ikincil çözelti için ikincil antikora karşılık gelen bir serum kullanın (örneğin, keçi, at, sığır).</li>
</ol>2. Numune hazırlama
NOT: PFA'ya maruz kalmayı sınırlamak için duman kaputunda 2.1 ile 2.7 arasında adımlar uygulayın.
<ol><li>Sevoflurane kullanarak genç (3-6 hafta) sıçanı derinden uyuşturmak; sıçan yanıt vermediğinde ve parmak ve kuyruk kıskacına yanıt vermediğinde 2.2'ye geçin.</li>
	<li>Sıçanı sırtüstü bir konuma getirin ve bir çift İris makası kullanarak karın duvarından bir kesi yapın.</li>
	<li>Mayo makası kullanarak göğüs kafesinin dibinden göğüs kafesinin her iki tarafındaki köprücük kemiğine kadar kesin.</li>
	<li>Sternumu ve kaburgaları kalpten ve akciğerlerden hemostatla yapıştırın.</li>
	<li>Sol ventrikülü perfüzyon pompasına bağlı 23 G'lik bir iğneyle delin ve sağ kulakçığı Iris makasıyla kesin.</li>
	<li>Yaklaşık 75 mL 100 mM (1x) PBS ile transkardiyal perfüzyon gerçekleştirin.</li>
	<li>1x PBS'de tamponlanmış yaklaşık %4 paraformaldehit (PFA) 100 mL ile transkardiyal perfüzyona devam edin.</li>
	<li>Beyni kafatasından çıkardık.</li>
	<li>Beyni sagittal konuma getirin ve bir jilet ve sıçan beyin matrisi kullanarak 4 eşit bölüme (yaklaşık 3 mm genişlik) dilimleyin.</li>
	<li>Her bölümü 1x PBS'de %4 PFA'da, bir çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de gece boyunca kapalı, 5mL plastik bir tüpte sabitleyin.</li>
	<li>1 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında (RT) 1x PBS'de% 4 PFA'da sabitlemeye devam edin.</li>
	<li>Her bölümü RT'de 1x PBS ile 30 dakika, 3 kez yıkayın.</li>
</ol>3. Dehidrasyon ve depigmentasyon
<ol><li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %20 metanol/%80 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %40 metanol/%60 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %60 metanol/%40 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %80 metanol/%20 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca %100 metanolde numuneyi kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Numuneyi yaklaşık 10 dakika boyunca 4° C'de% 100 metanolde soğutun.</li>
	<li>%66 diklorometan (DCM)/%33 metanol çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Rt'deki DCM/metanol çözeltisinde numuneyi bir gecede sallanarak kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>RT'de metanol ile 30 dakika, 2 kez yıkayın.</li>
	<li>Numuneyi yaklaşık 10 dakika boyunca 4° C'de% 100 metanolde soğutun.</li>
	<li>4° C'de bir gecede metanolde soğutulmuş, taze hazırlanmış% 5 hidrojen peroksit içinde çamaşır suyu.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %80 metanol/%20 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %60 metanol/%40 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %40 metanol/%60 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %20 metanol/%80 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi 1x PBS'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Çözüm 1'de RT'de 1 saat, 2 kez yıkayın.</li>
</ol>4. Kolera Toksin Alt Üni B etiketleme
<ol><li>Çekirdek akumbens bölgesine 1 mL şırınga iğne ucu yerleştirin.</li>
	<li>Yavaşça 20 sn'nin üzerine% 1 biyotin-CTB'nin 2,5 μL'sini enjekte edin.</li>
	<li>İğne ucunu 1 dakika yerinde bırakın ve sızıntıyı önlemek için 10 sn'nin üzerinde yavaşça çıkarın.</li>
</ol>5. Antikor uygulaması
<ol><li>Numuneyi Çözelti 3'te bir su banyosunda 37 °C'de 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Numuneyi Çözelti 4'te bir su banyosunda 37 °C'de 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Bir su banyosunda 37 °C'de 7 gün boyunca birincil antikor ile kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Çözelti 2'de 5 kez yıkayın, yıkama başına 1 saat inkübe edin. Çözüm 2'de rt'de bir gecede saklayın.</li>
	<li>Su banyosunda 37 °C'de 7 gün boyunca ikincil antikor ile kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Çözelti 2'de 5 kez yıkayın, yıkama başına 1 saat inkübe edin; Çözüm 2'de rt bir gecede saklayın. NOT: Son depolama dahil 5,6'dan itibaren tüm adımlar düşük ışıkta gerçekleşmelidir. Numune tüpleri alüminyum folyo ile korunabilir. Bu protokoldeki antikorlar için kullanılan konsantrasyonlar şöyleydi: TH 1:100'de, Iba1 1:200'de ve ikincil antikor 1:100'de. Tüplerin tamamen doldurulmasını sağlamak için 5.1-5.6 adımlarına ek Çözüm 2 ekleyin.</li>
</ol>6. Doku temizleme
<ol><li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %20 metanol/%80 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %40 metanol/%60 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %60 metanol/%40 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %80 metanol/%20 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %100 metanolde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>RT'de bir gecede taze %100 metanol içinde kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Oda sıcaklığında sallanarak 3 saat boyunca% 66 DCM / 33% metanol içinde kuluçkalayın.</li>
	<li>Dibenzyl eterde (DBE) titremeden kuluçkaya yatır. Numuneyi temizleyene kadar DBE'de bırakın ve görüntülemeye kadar DBE'de saklayın.</li>
</ol>7. Montaj
<ol><li>Visijet M3 Crystal reçineden yapılmış 3D baskılı bir oda edinin (idisco.info web sitesinde bulunan şablonlar).</li>
	<li>Hazneyi bir epoksi kullanarak mikroskop kaydırana sabitleyin.</li>
	<li>Örneği odanın ortasındaki kare alana yerleştirin.</li>
	<li>Odayı tamamen DBE ile doldurun.</li>
	<li>Odanın üzerine 0,17 mm kalınlığında bir kapak kılıfı yerleştirin ve kapak kapağı oda duvarlarıyla tam temas edene kadar basınç uygulayın.</li>
	<li>Kapak kapağının kenarlarını epoksi kullanarak odaya kapatın.</li>
	<li>Hava kabarcıklarının dolum girişinden kaçmasına izin vermek için odayı döndürün.</li>
	<li>Odayı ek DBE ile doldurun.</li>
	<li>Dolgu girişini epoksi ile kapatın ve kürlemesine izin verin. NOT: Montaj sırasında fazla DBE dökülür.</li>
</ol>8. Görüntüleme
<ol><li>4x büyütmede z taraması yapmak için bir konfokal mikroskop sistemi kullanın (ekli 3D videoyabakın).</li>
	<li>İkincil antikor tarafından belirtilen dalga boylarına benzer bir dalga boyunda yayacak bir lazer seti kullanarak numunenin floresan eksitasyonunu elde edin. TH ekscitasyon, 632 nm'de yayılması için bir HeNe lazer seti kullanılarak elde edildi.</li>
	<li>Dedektörü lazer emisyonu için yakın bir dalga boylarına ayarlayın. Mevcut protokol için, TH dedektörü 650 nm olarak ayarlandı.</li>
	<li>Görünür bir sinyal olana kadar dedektörün kazancını artırın. Görüntüler için 650LP kazancı 7.50 B olarak belirlendi.</li>
	<li>Konfokal görüntüleme yazılımındaki Tarama seçeneğini kullanarak, numune netleme getirilene kadar mikroskop aşamasını hareket ettinin.</li>
	<li>Tüm düzlüklerde dokunun etrafında gezinin ve konfokal görüntüleme yazılımını kullanarak tek görüntüler veya z yığını görüntüler elde edin.</li>
	<li>Görüntüleme tamamlandıktan sonra, numuneyi odadan çıkarın. Tamamen DBE ile dolu bir tüpe geri yerleştirin ve RT'de tercihen alüminyum folyo ile kaplı karanlık bir yerde saklayın. NOT: Floresan sinyali hala güçlü olduğu sürece numuneler yeniden monte edilebilir ve görüntülenebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

Yazarların hiçbirinin beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Doku temizleme, geleneksel IHC protokolünün sınırlamalarına bir çözüm sunar. Şeffaf olan bir örnek, sağlam dokulara hücresel düzeyde optik erişim sağlayan ışığın saçılmasını ve emilimini en aza indirir18,19. Doku temizleme teknikleri, çözücülerin yönetimi ile delipidasyon, dekolorizasyon ve kireçten arındırma yoluyla bir dokuyu şeffaf hale gelir. Doku örneğinin kırılma indeksi seçilen görüntüleme ortamının kırılma indeksiyle eşleştiğinde, örnek tamamen şeffaf görünecek ve düzgün bir şekilde görüntülenebilir3. Mevcut hidrofobik protokol, ilk dehidrasyon adımlarında dokudaki suyu temizler, böylece hafif dağılımını azaltır. Doku, derin antikor penetrasyonunu sağlamak için ön işlem sırasında permeabilize edilir. Protokolden geçen doku kolayca işlenebilir ve birkaç kez görüntülenebilir. Düzgün bir şekilde saklanırsa, dokular ilk işlemden sonra bir yıla kadar görüntü sağlayabilir.
Mevcut protokolde, F344/N ve HIV-1 Tg sıçan beyin dokusu örneklerine TH, Iba1 ve CTB için lekeleme için hidrofobik doku temizleme tekniği uyguluyoruz. Temizlemeden sonra doku örnekleri konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi. Mevcut protokol, iDISCO4gibi diğer hidrofobik protokollere göre çeşitli avantajlara sahiptir. İlk olarak, orijinal iDISCO protokolü fare dokusunda kullanım için doğrulanırken, mevcut protokol sıçan beyin dokusunda uygulanabilir. İkinci olarak, her adımda ayarlanan kuluçka süresi, tekniğin daha büyük doku bölümleri için kullanılmasını sağlar. Üçüncüsü, antikor inkübasyonu sırasında karşılık gelen serum da dahil olmak üzere (genel bir serum kullanımının aksine) analiz için daha net görüntüler sağlar.
Mevcut protokol bireysel araştırma sorularının ihtiyaçlarına göre kolayca uyarlanabilir olsa da, birkaç önemli husus vardır. Protokol, en az 26 gün üst üste baştan sona sürer. Numuneyi yukarıda belirtilenden daha uzun süre bir çözeltide bırakmayın. Bununla birlikte, örnek, protokolün sonunda DBE'de görüntülemeye kadar en az 6 ay boyunca güvenli bir şekilde saklanabilir, ancak mümkün olan en kısa sürede görüntülenmesi önerilir. Mikroskop kaydırağı ve kapak kılıfı arasına numuneyi sıkıca sığdıracak bir 3D baskılı oda sipariş edin. Çözüm 1 dışında tüm stok çözümleri, o günün kullanımına uygun miktarda karışık bir gündü. Çapraz kontaminasyonu önlemek için yeni bir çözelti getirildiğinde numune yeni bir tüpe taşınmalıdır. Mikrobiyal büyüme söz konusuysa, sodyum azit Çözelti 2, Çözelti 3, Çözelti 4, birincil antikor çözeltisi ve ikincil antikor çözeltisine toplam çözeltide% 0.02 konsantrasyonda eklenebilir.
Genel olarak, mevcut teknik birçok antikorla uyumlu son derece çok yönlü, uygulanması kolay ve düşük maliyetli bir prosedürdür. Hem F344/N kontrolünde hem de HIV-1 Tg sıçanlarında çalışmak üzere onaylanan bu protokol ile birçok yeni araştırma sorusu cevaplanabilir.

Beyinde kullanım için çeşitli doku temizleme teknikleri doğrulanmıştır: hidrojel, hidrofilik ve hidrofobik. Bu teknikler, çözücülerin yönetimi yoluyla bir dokuyu delipidasyon, dekolorizasyon ve kireçten arındırma yoluyla şeffaf hale getirmeyi amaçlamaktadır. Doku örneğinin kırılma indeksi seçilen görüntüleme ortamının kırılma indisiyle eşleştiğinde, numunenin net bir görüntüsü elde edilebilir. CLARITY gibi hidrojel bazlı teknikler, dokudaki biyomolekülleri akril bazlı hidrojellere bağlayarak güvence altına almakta, bu da yapısal hasarı ve protein kaybını önler1. Bununla birlikte, hidrojel teknikleri daha kırılgan dokulara zarar verme potansiyeline sahip olandan daha sert kimyasallar kullanır ve daha yoğun doku örnekleri hidrojel protokolü ile uyumlu olmayabilir. Bazı hidrojel teknikleri pahalı ekipman gerektirebilir veya doku genişlemesine yol açabilir. CUBIC gibi hidrofilik teknikler, doku içinde hidrojen bağları oluşumu yoluyla 3D yapıyı korur2. Doku genişlemesi bazı hidrofilik protokollerde de ortaya çıkabilir. Hidrofilik tekniklerin temizleme yeteneği genellikle daha yoğun ve kalın dokular için önemli olan hidrofobik tekniklerin sahip olduğu yetenekle eşleşmez3.
Hidrofobik teknikler genellikle hızlıdır, özel ekipman gerektirmez ve kullanımı ve depolaması kolay bir örnek üretir. iDISCO, diğer hidrofobik protokollerde meydana gelebilecek büzülmeleri ortadan kaldıran bir hidrofobik tekniktir. Başlangıçta, iDISCO doku temizleme tekniği, farelerin embriyoları ve yoğun, yetişkin organları için Renier ve ark.4 tarafından tanımlanmıştır. Bu teknik, ilk dehidrasyon adımında dokudaki suyu temizler, böylece ışık saçılmasını azaltır. Doku, derin antikor penetrasyonunu sağlamak için ön işlem sırasında permeabilize edilir. Uzak kırmızı spektrumdaki Alexa Fluor boyaları, alt dalga boylarında dokunun otoflüoresansını önlemek için immünolabeling için kullanılır5. Hidrofobik temizleme protokollerinden geçen doku kolayca işlenebilir ve Alexa Fluor boyalarının uzun ömürlü olması nedeniyle birkaç kez görüntülenebilir. Düzgün bir şekilde saklanırsa, dokular ilk işlemden sonra aylarca ila bir yıl boyunca görüntü sağlayabilir.
Mevcut protokolde hem erkek hem de kadın kontrolünde ve HIV-1 transgenik (Tg) sıçan beyinlerinde tirozin hidroksilaz (TH) antikoru, Iba1 antikoru ve Kolera Toksini Alt Ünlem B (CTB) kullanılmıştır. HIV-1 Tg sıçanı, HIV-1 viral genomu oluşturan dokuz genden yedisine sahiptir, bu da uzun süreli HIV-1 protein maruziyetinin bulaşıcı olmayan bir modeline yol açar6,7,8. Dopaminerjik değişiklikler daha önce HIV-1 Tg sıçanında gösterilmiştir ve HIV-1'in kendisi enflamatuar bir hastalıktır, bu nedenle antikor seçimi deneysel tasarım 9 , 10,11,12ile ilişkiliydi. CTB, ganglioside bağlama yoluyla nöronlara bağlanan ve beyindeki farklı projeksiyonları izlemek için kullanılabilen bir izleyicidir. CTB daha önce çekirdek akumbens'ten substantia nigra bölgesine, beynin dopaminerjik yollar13 , 14,15ile yoğun olarak ilgili iki bölgesine kadar projeksiyonları incelemek için kullanılmıştır.
Bu protokolde, TH dopamin üretimi için bir işaretleyici olarak hizmet edecek ve Iba1 aktif mikrogliayı işaretleyecek. Kullanılan TH antikor, tirozin hidroksilaz'a karşılık gelen yaklaşık 62 kDa'da tek bir bandı seçici olarak etiketler. Iba1 antikorı Iba1 karboksi-terminal dizisine karşılık gelir. Her iki antikor da tavşanda bulundu ve poliklonaldi. CTB, nöronların çekirdek akumbens bölgesinden substantia nigra bölgesine retrograd izlenmesi için kullanılacaktır. Mevcut protokol ayrıca orijinal iDISCO protokolünün iki farklı şekilde ayarlanması için bir kılavuz sunar: 1) engelleme adımlarındaki serum reaktiflerini değiştirerek arka plan boyamanın genel olarak azaltılması ve 2) kuluçka süresinin daha büyük doku örnekleri için uygun olacak şekilde ölçeklendirilmesi. Genel olarak, mevcut protokol, hidrofobik temizleme tekniklerinin sıçanın beyin dokularında mümkün olduğuna, HIV-1 viral proteinlerle ayırt edilebilir zararlı etkileşimleri olmadığına ve TH antikor, Iba1 antikor ve CTB ile uyumlu olduğuna dair sürekli kanıtlar sunmaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41121-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 primary antibody</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-sil epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1l-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td>mini pump variable flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

Hidrofobik doku temizleme yöntemleri, değiştirilmemiş doku örneklerinde ilgi molekülünün incelenmesini sağlayan kolayca ayarlanabilir, hızlı ve düşük maliyetli prosedürlerdir. Geleneksel immünolabeling prosedürleri, numunenin sağlam yapıları etiketleme ve inceleme yeteneğini kısıtlayan ince bölümlere kesilmesini gerektirir. Ancak, işlem sırasında beyin dokusu bozulmadan kalabiliyorsa, analiz için yapılar ve devreler bozulmadan kalabilir. Daha önce kurulan temizleme yöntemleri dokuyu tamamen temizlemek için önemli zaman alır ve sert kimyasallar genellikle hassas antikorlara zarar verebilir. iDISCO yöntemi dokuyu hızlı ve tamamen temizler, birçok antikorla uyumludur ve özel bir laboratuvar ekipmanı gerektirmez. Bu teknik başlangıçta fare dokusunda kullanım için doğrulandı, ancak mevcut protokol bu yöntemi kontrol ve transgenik sıçan beyinlerinin görüntü yarımkürelerine uyarlıyor. Buna ek olarak, mevcut protokol, daha az arka plan boyama ile daha net görüntüler sağlamak için önceden var olan protokolde birkaç ayarlama yapar. Iba-1 ve tirozin hidroksilaz antikorları HIV-1 transgenik sıçanda ve F344/N kontrol sıçanlarında mevcut hidrofobik doku temizleme yöntemi kullanılarak doğrulandı. Beyin, yapıların birbirinden ayrı olarak daha sık birlikte çalıştığı iç içe geçmiş bir ağdır. Beyni tek tek parçaların bir kombinasyonunun aksine bütün bir sistem olarak analiz etmek, tüm bu beyin temizleme yönteminin en büyük yararıdır.

Bu modifiye hidrofobik doku temizleme protokolü kullanılarak hem F344/N hem de HIV-1 sıçan beyin dokusunun geniş bölümlerinin tam olarak temizlenmesi sağlandı. Şekil 1, substantia nigra bölgesinde TH için tipik bir konfokal görüntü görüntüler. Şekil 1A yoğun, pozitif lekeleri temsil eder. Bu gibi yoğun alanlar pozitif lekeleme ve uygun hücre morfolojisini doğrulamak için "Z" düzlemine odaklanarak ayrıştırılabilir. Şekil 1B, TH nöronlarının farklı morfolojisi ile tanımlanabilen seyrek pozitif lekelenmeyi temsil eder. Şekil 1C, pozitif olarak lekeli olmayan ancak arka plan sinyali nedeniyle hala koyudan açık maviye koyu olan dokuyu temsil eder. Görüntünün tamamen siyah görünen bölgeleri, o bölgede doku olmadığını gösterir. Görüntüdeki tamamen siyah alanlar, numunenin kenarında, numunede bulunan bir delik veya odak dışında olan dokudan kaynaklanabilir.
Şekil 2A, 20x büyütmede TH pozitif nöronunun tipik morfolojilerini göstermektedir. Düzgün boyanmış ve odaklanmış konfokal görüntüler, karanlık bir arka plana karşı parlak ve net floresan gösterecektir. Bir TH pozitif nöron büyük bir soma (hücre gövdesi) ve birkaç dallanma işlemine sahiptir16. Şekil 2B, küçük hücre gövdeleri ve daha kısa uzatma işlemleri17olan Iba1 lekeli mikroglia'yı göstermektedir. Uygun boyama ve beklenen hücre morfolojisinin doğrulanması görüntülemenin ilk adımıdır.
Şekil 3 ideal bir görüntüyü (Şekil 3A) üç istenmeyen görüntüyle karşılaştırır (Şekil 3B-D). Şekil 3A, net ve koyu bir arka plana karşı pozitif, parlak lekeler göstermektedir. Pozitif boyama arka plandan kolayca ayırt edilebilir. Şekil 3B, çok fazla floresan kazancı olan yanlış odaklanmış bir görüntünün bir örneğidir. Şekil 3C yanlış pozitif sinyal gösteriyor. Dokunun geri kalanıyla odaklanmayan parlak noktalar eserlerdir ve olumlu bir sinyal olarak düşünülmemelidir. Şekil 3D, orijinal iDISCO protokolü4'teönerildikçe ikincil antikorla eşleşmeyen bir bloke serumu kullanmanın bir örneğidir. Bu görüntüde, keçide yapılan ikincil bir antikor için eşek serumu kullanımı, pozitif lekeyi düzgün bir şekilde tanımlama yeteneğini gizleyen yüksek arka plan lekelemeli bir görüntü üretti.
Şekil 4A sıçan beyninde pozitif CTB lekesi göstermektedir. Uzun, ince lifler dopaminerjik yol boyunca farklı projeksiyonlardır. Şekil 4B ve Şekil 4C, TH ve CTB'nin kolokalizasyonunu göstermektedir. Şekil 4B'deenjeksiyon, yoğun floresan yeşil bir daire olarak görünen çekirdek akumbens bölgesinde görülebilir. Şekil 4C, substantia nigra alanında TH ve CTB'nin kolokalizasyonunu görüntüler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61821/61821fig01.jpg"> Şekil 1: Hidrofobik olarak temizlenmiş bir doku örneğinin işaretleyicilerle konfokal görüntüsü, 4x büyütme. (A) Substantia nigra bölgesinde yoğun TH lekeleme. (B) Substantia nigra'ya bitişik seyrek TH nöronları. (C) Pozitif TH nöronları olmayan doku. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61821/61821fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61821/61821fig02.jpg"> Şekil 2: Floresan etiketli TH pozitif nöronların (20x büyütme) ve Iba1 pozitif mikrogliasının (10x büyütme) tipik morfolojisi. (A) İki temsili TH pozitif nöron. (B) Iba1 pozitif mikroglia. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61821/61821fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61821/61821fig03.jpg"> Şekil 3: Hidrofobik olarak temizlenmiş dokunun ideal ve zayıf konfokal görüntüleri, 4x büyütme. (A) Substantia nigra bölgesinde yoğun TH lekeleme, uygun bir floresan kazancı ile uygun şekilde odaklanır. (B) Yanlış odaklanmış ve aşırı maruz kalan bir görüntü. (C) Yanlış pozitif lekeleme. (D) Değiştirilmemiş iDISCO protokolünün takipi sonucu yüksek arka plan boyama. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61821/61821fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61821/61821fig04.jpg"> Şekil 4: Dopaminerjik yol boyunca kolera Toksini B etiketlemesi, 4x büyütme. (A) Pozitif CTB boyama konfokal görüntü. (B) TH ve CTB ve çekirdek akumbens enjeksiyon bölgesinin çakışmış görüntüsü. (C) Substantia nigra bölgesinde TH ve CTB'nin kolokalizasyonu. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61821/61821fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Film 1: 4x büyütmede numunenin z taramasının 3D filmi. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61821/3_D_video.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız. </a>

Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Burada, hedef moleküllerin sağlam beyin yapılarının bir parçası olarak görüntülenmesini sağlayan hidrofobik bir doku temizleme yöntemi sunuyoruz. Bu teknik artık F344/N kontrolü ve her iki cinsiyetten HIV-1 transgenik sıçanlar için onaylanmıştır.

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.9K Görüntüleme.  University of South Carolina. Burada, hedef moleküllerin sağlam beyin yapılarının bir parçası olarak görüntülenmesini sağlayan hidrofobik bir doku temizleme yöntemi sunuyoruz. Bu teknik artık F344/N kontrolü ve her iki cinsiyetten HIV-1 transgenik sıçanlar için onaylanmıştır.

Video: A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Nörobilim

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Beyin-implante Microdevices ve Çevresi Doku Bozulmamış Histolojik Karakterizasyonu

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Microcoil stenoz ile hafif intrauterin hipoperfüzyon fare modeli

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...