Biz teşekkür ederiz ve Dr Peter Nelson ve Sonya Anderson tüm insan beyin doku örnekleri sağlamak için UK-ADC beyin doku Bankası kabul (NIH izni numarası: P30 AG028383 yaşlanma Ulusal Enstitüsü). Matt Hazzard ve Tom Dolan, bilgi teknoloji hizmetleri, akademik teknoloji ve fakülte nişan, Kentucky Üniversitesi grafik yardım için teşekkür ederiz. Bu proje (BB için) hibe numara 1R01NS079507 sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur ve grant numara 1R01AG039621 yaşlanma Ulusal Enstitüsünden (için A.M.S.H.) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur veya Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini yaşlanma temsil etmiyor. Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Aşağıdaki bilgileri geçerli güvenlik ve Kentucky Üniversitesi, Lexington, KY, ABD düzenleyici standartlara dayanmaktadır. Bir güvenlik önlemi olarak, kurumun biyolojik güvenliği programı ve en güncel yönetmelik ve öneriler için insan dokusu ile çalışmaya başlamadan önce bakın.
Dikkat: İnsan dokusu insan immün yetmezlik virüsü (HIV), Hepatit B virüsü (HBV), Hepatit C virüsü (HCV) ve diğerleri de dahil olmak üzere, kan yoluyla bulaşan patojenler bir kaynağı olabilir. İnsan dokusu ile çalışma patojenler kan yoluyla enfeksiyon riski. Bu nedenle, belirli bir düzenleyici ve güvenlik uygulaması insan dokusu ile laboratuar personeli korumaya çalışırken zorunludur. ABD insan dokusu ile çalışma bir Biyogüvenlik seviye 2 Laboratuvar yanı sıra güvenlik önlemleri ve NIH Bölüm IV-B-7, OSHA 1970 yan tümce 5(a)(1) ve kullanıcının kurumsal biyolojik güvenliği programı yasası uyarınca eğitim gerektirir. Genel olarak, kurumsal Biyogüvenlik kurulu ve/veya kurumsal İnceleme Kurulu onayı insan malzemeleri (doku, vücut sıvıları) içeren herhangi bir araştırma önce alınmalıdır. Eğitim insan malzeme ile çalışan tüm personel için gereklidir ve temel laboratuvar güvenlik eğitimi, Örneğin, kimyasal hijyen ve laboratuvar güvenliği, hem de biyolojik güvenlik, tehlikeli atık ve insan üzerinde özel eğitim içerir kan kaynaklı patojenler. İnsan malzeme ile çalışan tüm personelin hepatit B aşıları, önce insan malzeme ile çalışan almak için kesinlikle önerilir. Personel insan malzemelerle, e.gçalışırken belirli kişisel koruyucu donanımları gereklidir., kelepçeli bir önlük ve kalkan ve her zaman eldiven giymek bir yüz. İçinde bir Biyogüvenlik kabini (sınıf 2) gerçekleştirilmiş tüm işleri. İnsan malzemeler ile temas ve herhangi bir atık insan malzemelerden gelir tüm ekipman kirlenme ve/veya personel enfeksiyonu önlemek için uygun şekilde ele alınır. Tüm ekipman ve yüzeyler ile % 10 çamaşır suyu ve % 75 etanol insan malzemeler içeren her yordam aşağıdaki temizlenir. Bir sızıntı insan malzeme ile hemen temizlenmesi gerekir. Züccaciye Mağazaları her kullanımdan sonra autoclaved. Sabitlenmemiş insan dokusu, dahil olmak üzere atık, etiketli biohazard atık çantaya toplanan ve autoclaved. "Sharps" olarak biyolojik etiketli bir delik ve sızıntı geçirmez kap içinde toplanır. İnsan malzemelerden tüm atık kurumun biyolojik güvenlik yönetmeliklerine göre atıldı.
Not: Bizim laboratuvar taze frontal korteks örnekleri yaşlanma Sanders-kahverengi Merkezi aracılığıyla vefat eden bireyler elde eder (IRB #B15-2602-M). Dahil ölçütlerdir: kayıt UK-ADC boyuna otopsi kohort çalışma ve bir Post-Mortem aralığı (PMI) ≤4 s64. Otopsi standart bir protokol izleyin ve tüm yordamları NIH Biospecimen en iyi pratik kurallar65için uygun. Az 4 h kısa bir PMI yalıtım sonra kapiller canlılığı sağlamak için yüksek önem taşımaktadır. Dondurulmuş ve taze doku kullanılabilir. Donma gerekli ise, taze elde edilen insan beyin dokusu şok sıvı azot içinde donmuş olmalı ve-80 ° C'de depolanan Taze veya çözdürülen doku içinde yalıtım tampon (aşağıya bakınız) depolanabilir ve hızlı bir şekilde işlenebilir. Biz o 10 g taze insan dokusu verimleri yaklaşık 100 mg beyin kapiller (ıslak ağırlık) bulabilirsiniz.
1. Kurulum
<ol><li>
Arabellek hazırlık Not: Gerekli arabellek hacmi doku miktarına bağlıdır. Tüm arabellek güç aşağıdaki protokol içinde insan beyin korteksi doku 10 g üzerinde temel alır.<ol>
<li>L izolasyon arabellek: 1, 5 L Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS; 2.7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 0.9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) kullanın ve ek 5 mM D-glikoz (1.35 g ) ve 1 mM sodyum pyruvate (0,165 g). Glikoz ve pyruvate ekledikten sonra sodyum hidroksit ile pH 7.4 için ayarlayın. Serin ve 4 ° C kullanmadan önce arabelleğe saklayın.</li>
		<li>Sığır Serum Albumin (BSA): yalıtım arabelleği bir son BSA konsantrasyonu % 1 1 L 10 g BSA tozu ekleyin. Bubbles kaçınmak, pH 7.4 ayarlamak ve gecede 4 ° C'de depolamak için yavaş yavaş ilave edin. Hemen kullanmadan önce hafifçe karıştırın; albümin denatürasyon önlemek için kabarcıklar oluşturan kaçının.</li>
		<li>Yoğunluk gradient Orta: bir cam şişe içine yoğunluk gradient orta 18 g tartmak ve manyetik heyecan çubuğu ekleme. Yalıtım arabellek 60 mL ekleyin ve tüm toz askıya kadar 5 dk şiddetle çalkalanır. Mağaza gecede 4 ° C'de geçiyoruz yoğunluk degrade orta izin vermek için. Kullanmadan önce 10 dakika karıştırın.</li>
		<li>4 ° C'de tüm arabellekleri depolar; Tüm araçlar ve buz arabellekleri tüm yalıtım işlem sırasında tutmak. Kullanmadan önce tüm arabellekleri karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deneysel Kur
	<ol>
<li>Potter-Elvehjem doku değirmeni elektronik havai karıştırıcı üzerine havaneli bağlayın. Potter-Elvehjem doku değirmeni ve Dounce homogenizer başlık altında buzda havaneli ile yerleştirin. 300 µm filtre mesh (5 x 5 cm2) hazırlamak, bir koni katlayın ve eklemek ve 50 mL Falcon tüp bandı (Şekil 1A) ile ekleyin.</li>
		<li>Bağlantı halkaları yerleştirin ve zorlanma filtreleri hücre (gözenek boyutu: 30 µm) 50 mL Falcon tüpler üzerinde. Biyolojik atık torbaları hazırlayın. Gerekli tüm ekipman Biyogüvenlik kabini yerleştirin (bkz. Tablo malzeme).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. beyin numune hazırlama
Not: Şekil 1A aşağıda açıklanan tüm yalıtım yordamı iş akışı grafiğini gösterir. İnsan beyin dokusu korteks herhangi bir yerinden kök olabilir ve taze veya dondurulmuş kullanılabilir. Donmuş beyin dokusu oda sıcaklığında (arabellek yok; ~ 30 dk 10 g için) çözülmüş. Benzer sonuçlar elde etmek için beyin dokusu her deneme için aynı beyin bölgesinden alınmalıdır. Bu iletişim kuralı için taze optimize edilmiştir (PMI < 4 h) değil donmuş halde insan beyin korteksi.
<ol><li>İnsan beyin dokusunun hazırlanması: beyin dokusunun ağırlık belge. Aşağıdaki iletişim kuralı tüm numaraları 10 g taze insan beyin doku için uygundur. Beyin dokusu bir 100 mm Petri kabına yerleştirin. Dikkatli bir şekilde tüm meninkslerde forseps ile çıkarın. Bir neşter beyaz madde kesmek için kullanın.</li>
	<li>İnsan beyin dokusunun kıyma: dikkatle beyin dokusu kadar kesin ve neşterle kıyma. Yaklaşık 5 dk (2-3 mm adet) kıyma. Beyin dokusu Potter-Elvehjem doku değirmeni aktarın. Yalıtım arabellek 30 mL ekleyin. Not: Kıyılmış doku parçaları lapa kıyma sürecinde beyin dokusu dönüşüyor beri görmek zordur.</li>
</ol>3. homojenizasyon
<ol><li>Potter-Elvehjem doku değirmeni (izni: 150-230 µm): her örnek, 50 rpm homogenizer hızında 100 darbeleri ile homojenize. Zaman her 25 konturlar ve 100 vuruş için gereken toplam süreyi belge. Tablo 1 için önerilen homojenizasyon Protokolü Bkz:; insan frontal korteks 10 g homojenizasyon için toplam 22 dk zamanı. Hava kabarcıkları önlemek için heyecan değil.</li>
	<li>Dounce homogenizer (izni: 80-130 µm): homogenate Dounce homogenizer buzda Transfer. 20 vuruş (~ 6 s/kontur, ~ 2 dk toplam) ile süspansiyon lunaparkçı. Bubbles kaçınmak.</li>
</ol>4. Santrifüjü
<ol><li>Beyin homogenate dört 50 mL aralıklarla tüpler ve belge homogenate hacmi eşit olarak dağıtın. Yoğunluk gradient arabelleği 50 mL aralıklarla tüpler (12,5 mL tüp başına) içine dağıtmak. Yalıtım arabellek 10 mL Havan tokmağı ve homogenizer durulama ve dört Santrifüjü tüpler (~2.5 mL tüp başına) içine dağıtmak için kullanın.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri kapakları sıkıca kapatın. Homogenate, yoğunluk gradient orta ve arabellek şiddetle tüpler sallayarak karıştırın. Vasıl 5,800 x g 4 ° c (sabit açılı rotor); 15 dakika santrifüj kapasitesi Tüp bağlı Pelet tutmak için bir orta yavaşlama hızı seçin. Süpernatant atın ve her Pelet 2 mL % 1 BSA resuspend.</li>
</ol>5. filtrasyon
Not: kırmızı kan hücreleri ve diğer hücre artıkları kılcal ayırt etmek birkaç filtrasyon adımlar gereklidir.
<ol><li>300 µm kafes: Pelet yeniden askıya sonra süspansiyon 300 µm kafes aracılığıyla filtre. Daha büyük gemiler ve daha büyük beyin enkaz mesh kalır, ancak kılcal ağ, filtre uygulanır. Dikkatle mesh ilâ 50 mL % 1 BSA ile yıkayın. Mesh atmak. Not: Bu filtrasyon adım kapiller süspansiyon herhangi bir büyük damarları ya da beyin enkaz parçalarını temizler.</li>
	<li>
30 µM hücre zorlanma filtre Not: Bu filtrasyon adım kılcal kırmızı kan hücreleri ve diğer beyin enkaz ayırır.<ol>
<li>Adım 6.1 beş 30 µm hücre zorlanma süzgeçleri (kapiller filtrate hücre zorlanma filtre başına yaklaşık 10 mL) üzerindeki kapiller filtrate dağıtın. Oysa kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreleri ve küçük beyin enkaz filtreden geçmek ve filtrate içinde toplanan kılcal geri Bu filtre tarafından tutulur.</li>
		<li>Her filtre 25 mL % 1 BSA ile yıkayın. Daha sonra tüm filtrates verimi artırmak için altıncı filtre dökün. Her filtre 50 mL % 1 BSA ile yıkayın; zorlanma filtreleri ile kılcal içeren hücreyi tutmak ve filtrate atın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. kılcal koleksiyonu
<ol><li>Filtreler ters çevirin ve 50 mL tüpler içine kılcal 50 mL her filtre için % 1 BSA ile yıkayın. Yavaşça pipettor 5 mL damlalıklı ucu ile basınç uygulayın ve beyin kılcal yıkamak için filtre arasında taşıyın.</li>
	<li>Özellikle filtre RIM tüm beyin kılcal kapalı yıkayın emin olun. Kabarcıklar kaçının beri bu filtrasyon işlemi daha zor hale getirir ve kapiller kaybı olasılığı artar.</li>
</ol>7. çamaşır
<ol><li>Kılcal topladıktan sonra 1.500 x g (kova rotor sallanan) 4 ° C'de 3 min için tüm örnekler santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak ve Pelet yalıtım arabellek yaklaşık 3 mL yeniden askıya alma. 15 mL konik tüp içinde bir örnek tüm resuspended çökeltilerini birleştirmek ve yalıtım arabellek ile doldurun. Yine 1500 x g 4 ° C'de 3 dk de santrifüj kapasitesi ve iki kez daha yıkayın.</li>
	<li>Kapiller saflık ile mikroskop (100 X büyütme) ve fotoğraf makinesi (Şekil 1B) belge. Not: Beyin kapiller insan beyin dokusunun 10 g den genellikle yaklaşık 100 mg verimidir. İzole beyin kılcal şimdi işlenen deneyler için kullanılabilir (Örn., lysate, membran izolasyon), veya flash donmuş ve-80 ° c en az 6-12 ay (birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek) için cryotubes içinde saklı.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut protokolünü sağlam ve kalıcı insan beyin kapiller taze dokusundan yalıtım açıklar. Bu bölümde, biz aşağıda ayrıntılı olarak ele: 1) değişiklikleri protokolü, 2) yaygın hataları giderme, 3) Teknik sınırlamaları, 4) modeli ile ilgili mevcut ve alternatif kan - beyin bariyerini modelleri, önemi ve 5). izole insan beyin kılcal damarlar için potansiyel uygulamalar.
Burada açıklanan protokol 10 g taze insan frontal korteks doku için optimize edilmiştir. Ancak, bu yordam için değiştirmek oldukça basittir: 1) aşağı yukarı 10 g doku, 2) donmuş beyin dokusu veya 3) beyin dokusundan frontal korteks dışında bir beyin bölgesi daha. İlk olarak, ile daha fazla veya az 10 g beyin dokusunun arabellekleri gerekli hacmi sadece yukarı veya aşağı doku kullanılabilir miktarı ölçeklendirilebilir. Sadece beyin dokusunun 5 g varsa, böylece, arabellekleri hacmi yarı yarıya azaltılacak. İkincisi, biz taze beyin dokusu kullanılan bir kılcal yalıtım açıklar, ancak donmuş doku taze doku kullanılamaz38ise kullanılabilir. Üçüncü olarak, frontal korteks alınan taze beyin dokusu kullanılmış, ama eğer yeterli kullanılabilir doku kılcal diğer kortikal beyin bölgelerden izole olabilir. Kılcal kortikal beyin bölgelerden izole etmek mümkündür (Örn., beyaz madde), ama bu bölgeler bir farklı hücre kompozisyon ve kapiller yoğunluk 66,67,68. Böylece, farklı beyin bölgesinden doku kullanarak büyük olasılıkla olmak Protokolü gerektirecektir ayarlanır (Örneğin, arabellek birim, degrade Orta yoğunluk, Santrifüjü hız, ve/veya filtrasyon adımları sayısı).
Kapiller yalıtım yordam değil karmaşık iken başına, küçük tedirginlikler veya protokolünde değişiklik duyarlıdır. Değişiklikleri bir azalmış kapiller verim veya azaltılmış kapiller canlılığı neden olabilir. Tablo 2 en yaygın hata ve yalıtım sırasında karşılaşılan sorunlar açıklanır ve bu hataları ve çözümleri durumunda sorun giderme için kaçınmak için ipuçları listeler. Yordamı ile ilişkili en yaygın sorun düşük kapiller verimidir. Kılcal kaybı genellikle küçük kayıp her adımda kümülatif toplamı ve küçük sapmalar nedeniyle bir yöntemdir. Önemli bir adım olan yoğunluğu Santrifüjü kılcal büyük miktarda kaybolabilir. Kılcal kapiller Pelet hacmi azaltır hücresel enkazı ayırmak için yanlış bir yoğunluk arabelleği hatalı bir konsantrasyon sonuçlanır. Şekil 3 Santrifüjü adım beyin homogenate göre çok az ya da çok fazla yoğunluk gradient orta sonuçlarını gösterir. Doğru için konsantrasyon ayarlama bu sorunu çözebilir. Santrifüj hızlanma ve yavaşlama hızı da beyin kapiller Pelet oluşumu etkileyebilir unutmayın. Pipet ipuçları kapiller malzemenin bir parçası sopa kılcal damarlar da adımları sırasında 6-7 kayıp olur. Bu sorunu iyice değiştirmeden önce her damlalıklı ucu durulama tarafından ele alınması. 7. adımı, kılcal hücre zorlanma filtresinin dışında kapalı yıkama tamamlanmamış olabilir ve/veya kılcal filtre azına kadar yapışabilir. Bu filtre tarafından ek yıkama adımları takip mikroskop altında kontrol ederek önlenebilir. Kılcal yalıtım yordamı her adımında kaybetme ihmal edilebilir bir kılcal Pelet veya kapiller yeterli malzeme daha fazla işleme ve deneme için neden olabilir.
Beyin kılcal taze insan dokusundan izole vivo içinde durum çok benzeyen bir benzersiz kan - beyin bariyerini modeli temsil eder. Ancak, tekniğin bazı sınırlamaları vardır. Taze insan dokusu kullanılabilirliğini bir mücadeledir. En iyi PMI ≤4 h olduğundan, beyin dokusu önemli ölçüde uzun bir PMI toplanan aşağı akım bazı uygulamalar için taze olmayacaktır. Bazı durumlarda, böylece aşağı akım uygulamaları sınırlama birden çok deneysel grupları için yeterince büyük olan doku tutarlar elde etmek zor olabilir. Böylece, taze kılcal kemirgen19, köpek69, sığır42veya domuz70 beyin dokusundan izole kan - beyin bariyerini modellemek daha uygun olabilir. İnsan beyin dokusu gibi yaş, cinsiyet, etnik köken, hastalık durumu, ilaç Geçmiş değişkenlik belirleyen faktörlerden, beyin bölgesi örnek ve PMI yorumlama ve veri yayımlama dikkate alınmalıdır. Bir deneysel düzeyde izole kılcal perisitlerden içermeye devam edecektir, ama astrositik endfeet yordam44tarafından kaldırılır unutmamak gerekir. Burada sunulan modeli kan - beyin bariyerini (yani, kapiller endotel hücreleri) bir ex vivo model olarak ancak nörovasküler biriminin bir model olarak hizmet veren dikkate alınması gerekir.
Herhangi bir insan dokusu ile çalışma, her zaman bir doğal güvenlik riski sunar ve araştırmacılar bulaşmasını önlemek için yalıtım işlem sırasında uygun önlemleri almanız gerekir. Özellikle, ABD, BSL 2 sertifikalı ve Biyogüvenlik kabini (sınıf A2) içeren belirtilen laboratuvar alanı insan dokusu ile çalışma gerektirir. Ayrıca, personel kişisel koruyucu ekipman kullanmanız gerekir (i.e., önlük, eldiven ve yüz kalkan) ve iş ile insan dokusu ve alet biyolojik atık işleme donatımı belirlenmiş. Bu güvenlik önlemlerini uygulamak zaman alan, maliyet-yoğun ve özellikle de deneyimsiz laboratuar personeli için yordamı, zorluk artırır.
Kan - beyin bariyerini son derece iyi tanımlanmış bir CNS71ile organizmalar arasında korunmuş. Çünkü karmaşık nörovasküler nörovasküler birim hücreler arasında kaplin insan kan - beyin bariyerini modelleme zordur. Yetişkin bir insan beyni ortalama yaklaşık 86 milyar nöronlarda olduğu tahmin ve hemen hemen her nöron kendi kılcal oksijen ve besin72,73ile uygun kaynağı sağlamak için çevresinde var düşünülmektedir. Kapiller endotel hücreleri kan-beyin arabiriminin (12-18 m2 için sağlıklı bir yetişkin insan) en büyük yüzey alanı oluşturmaktadır. Sıkı kavşak solutes paracellular difüzyon engelleyerek pharmacotherapeutics geniş bir dizi için engel temsil eder. Ayrıca, çok sayıda çalışma bariyer disfonksiyonu nörodejeneratif hastalıklarda, e.gaçıklamaktadır., Alzheimer hastalığı74, kontur75, epilepsi38,76, multipl skleroz77, ve travmatik beyin hasarı28,78. Böylece, yakından insan kan - beyin bariyerini simgeleyen ve daha iyi sağlık ve hastalığında bariyer fonksiyonu anlamak için izin modeller kurmak için zorunludur.
Çok sayıda vitro hücre kültür modellerinin kan - beyin bariyerini yok; konuyla ilgili uzman değerlendirmeler için bkz: 41,49,51,69,79,80. Kısaca, her ikisi de taze beyin kapiller endotel hücreleri birincil kültür için izole ve ölümsüzleştirdi beyin kapiller endotel hücre hatları kullanılabilir. Birincil beyin microvessel endotel hücre kültürleri, fare, fare, domuz ve inek çoğunlukla kullanılır. Ancak, hücre taze izole olması gerektiğinden birincil hücre kültürleri emek yoğun. Ölümsüzleştirdi beyin kapiller endotel hücre hatları fare, sıçan ve insan kullanılabilir ve daha uzun vadeli kullanım için passaged çünkü daha az emek yoğun. Ancak, hatta ölümsüzleştirdi hücre hatları ne sıklıkla onlar endotel özellikleri kaybetmeden evvel passaged bir sınırı var. Hem primer hücre hem de ölümsüzleştirdi hücre hatları genellikle beyin kapiller endotel modellemek ve böylece kan beyin taşıma41 taklit eden hücre monolayer arasında bariyer geçirgenliği ve uyuşturucu taşıma ölçmek için plakaları kültürlü ,81,82. Bu modeller kültür medyada da değiştirilebilir veya astrocytes, perisitlerden veya kamp41,83,84gibi fizyolojik ilgili diğer faktörler ile desteklenmiştir.
Ölümsüzleştirdi hücre hatları onların nispeten kolay erişim ve kullanılabilirlik avantajdır. Kültürlü endotel hücreleri izdiham ulaşabilirsiniz iken, yan yana büyüdükçe endotel hücre özelliklerini kaybederler bir monolayer içinde. Örneğin, kültürlü hCMECs taşıyıcılar P-gp, sıkı kavşak proteinler ve görüntü değişken geçirgenliği gibi azaltılmış ifade xenobiotics41olarak görüntüler. Şekil 4 P-gp protein ifade için bir Western blot taze izole insan kılcal damarlar için karşılaştırıldığında hCMEC/D3 hücreleri gösterir. Bir 10 kat daha düşük toplam protein miktarı rağmen P-gp sinyali izole insan kılcal hCMEC/D3 hücrelere göre güçlüdür. Bu hCMEC/D3 hücreleri P-gp protein ifade kültüründe önemli miktarda kaybetti gösterir. Ayrıca, Kültür medya, çevre ve ekipman farklılıkları anahtar ölçü bariyer bütünlüğünü, yani, Transwell plaka deneyleri ölçümlerde aylarının etkiler. Bu konulardan bazıları daha yakından insan kan - beyin bariyerini vivo içindegösteren izole beyin kapiller modeli kullanarak üstesinden gelebilir.
İzole beyin kılcal çalışmaları, genomik, proteomik, fonksiyonel proteomik ve cellomics çalışmaları (Şekil 5) de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede için kullanılmıştır. Buna ek olarak, birçok teknikleri ve yöntemleri izole beyin kılcal bu alanların her biri içinde çözümlenecek adlı biri yok. Özellikle, Şekil 5 ' te gösterilen deneysel teknikleri bir dizi kaynaktan translasyonel araştırma kolaylaştırabilir, kemirgen, sığır ve domuz insan doku dahil olmak üzere, izole beyin kılcal damarlar üzerinde kullanılabilir. Örneğin, Li vd. 85 sıçan beyin kılcal izole mRNA arındırıcı tarafından bastırma Eksiltici hibridizasyon kullanarak kan - beyin bariyerini genomik okudu. Ayrıca, Ott vd. 86 RT-PCR ve qRT-PCR P-gp PXR tarafından düzenlenmesi çalışırdım. Birçok proteomik çalışma Western blot3, Dot Blot Analizi87, basit Western deneyleri3,38, ELISA88,89, immunoprecipitation3, kullanmak ve immunostaining3,90,91. Beyin endotel, McCaffrey vd kaçakçılığı ışınlama ayırt etmek 92 izole beyin kapiller hücre altı ayırma kullanılır. Sánchez del Pino ve ark. 93izole sığır endotel membran veziküller ışınlama konumu ve ulaşım yön kan - beyin bariyerini arasında ayırt eskiden. Diğer proteomik çalışmalarda araştırmacılar sıvı kromatografi ve tandem kütle spektrometresi taşıyıcı proteinler94,95,96ölçmek için kullanılır. Fonksiyonel proteomik çalışmalar ışınlama kullanılmaktadır ve2,38kaçak deneyi. Hartz vd. 2 zymography izole beyin kılcal enzim etkinliğini belirlemek için kullanılır. Buna ek olarak, büyük cellomic araştırma hücre kültürü kullanarak çok sayıda endotel hücre satırları ve kan - beyin bariyerini82,83,84modelleri üretti. Bu modellerde kullanılan ortak deneyleri geçiş deneyleri97,98, canlılık ve toksisite deneyleri99ve anjiogenezi deneyleri98içerir.
İzole beyin kapiller protein ifade ve aktivite doğru karakterizasyonu ve yollar, kan - beyin bariyerini sinyal bir açıklama sağlar. Bu, kısmen, hangi sadece yaklaşık % 1 (v/v) beynin kılcal içerik kaynaklanmaktadır. Böylece, saflaştırılmış kapiller endotel hücreleri için bir yedek olarak tüm beyin homogenate ya da beyin dilimleri kullanarak büyük olasılıkla bir zavallı sinyal-gürültü oranı24saat içinde neden olur. Ayrıca, yalıtım sonra beyin kılcal en az 6 çalışmaları belirli sinyal yolları ayırt sağlayan h için fare ve sıçan (yayınlanmamış veri), uygulanabilir. Bu aynı hazırlık kontrol grubundan eklemeniz önerilir.
Bu raporda, tartışılan izole kapiller modeli gibi kan - beyin bariyerini temsilcisi ve çevirim modellerinin bariyer fonksiyonu sağlık ve hastalığında çalışmaya ihtiyaç vardır. Burada izole insan beyin kılcal bir iyi verim ve kan - beyin bariyerini bir ex vivo model olarak hizmet verebilir yüksek kalite elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut. İzole kılcal onların özgün yapısı ve işlevi, onları sonrası yalıtım moleküler, biyokimyasal bir dizi için kullanarak sağlayan ve fizyolojik deneyleri korur. Ne zaman insan dokusu işleme, tercihen bir BSL 2 veya daha yüksek ayar örnekleri özen gösterilmelidir.

Kan - beyin bariyerini kan ve ne gider ve beyin dışarı geliyor belirler beyin arasındaki sıkı şekilde denetlenen bir arabirimdir. Anatomik olarak, endotel hücreleri kan - beyin bariyerini oluşturmak ve karmaşık, sürekli kılcal ağ oluşturur. Fizyolojik açıdan, bu kılcal ağ aynı anda karbon dioksit ve metabolik atık ürünlerin atılması sırasında beyin oksijen ve besin sağlar. Önemlisi, kanıt bariyer değişikliklere Alzheimer hastalığı, epilepsi ve kontur1,2,3,4,5 de dahil olmak üzere çok sayıda patolojiler için katkıda destekler , 6 , 7. endotel hücreleri de hizmet tedavi için bir engel olarak beyne, Örneğinilaç alımı bloke ederek beyin., kemoterapi glioblastoma multiforme Tümör rezeksiyonu8,9, takip 10. Bu bağlamda, izole insan beyin kılcal damarlar çok bariyer fonksiyonu ve sağlıkta disfonksiyon eğitim veren bariyer özellikleri içinde vivo benzeyen bir benzersiz ex vivo kan - beyin bariyerini modeli temsil ve hastalık. Bu makalede, biz--dan sürekli yüksek kapiller kalitede insan beyin beyin kılcal yalıtmak ve kan - beyin bariyerini çalışmaya verim için bir protokol sağlar.
1969 yılında, Siakotos ve ark. 11 ilk beyin kapiller yoğunluk gradient Santrifüjü ve cam boncuk sütun ayrımı yöntemi kullanılarak sığır ve insan beyin dokusundan yalıtım rapor edildi. Daha sonra Goldstein vd. 12 bu yöntem doku sıçanlarından emir, glikoz taşıma metabolik aktivite koruyarak izole beyin kılcal çalışma için gerekli azaltmak için birden fazla filtrasyon adımları ekleyerek geliştirilmiş. O zamandan beri araştırmacılar çok kez, yöntemi ve beyin kapiller modeli her yineleme13,14,15ile iyileştirilmesi kapiller yalıtım yordamı optimize edilmiştir. Örneğin, Pardridge ve ark. 16 sığır kılcal mekanik homojenizasyon yerine enzimatik sindirim kullanarak izole ve sonra daha sonra 210 µm gözenekli filtre ve cam boncuk sütun kılcal bir süspansiyon geçti. Bu değişiklikler trypan mavi dışlama leke izole beyin kapiller geliştirilmiş ve böylece, endotel hücre canlılığı arttı. 1990'ların başında Dallaire ve ark. 17 nöronal kirlenme açıktı ve γ-glutamil transpeptidase (γ-GTase) ve alkalen fosfataz metabolik aktivite yapılmaktadır sığır ve sıçan kılcal izole. 2000'de, Miller ve ark. 18, izole sıçan ve domuz beyin kılcal confocal mikroskobu ile birlikte taşıma yüzeylerde birikimi kılcal lümen içine göstermek için kullanılır. Daha sonra bizim laboratuvar beyin kapiller yalıtım yordamı optimize etmek devam etmiştir ve P-glikoprotein (P-gp)19,20,21, meme kanseri belirlemek için taşıma deneyleri kurduk direnç protein (BCRP)22,23ve çoklu ilaç direnci protein 2 (Mrp2)24 taşıma etkinlik. 2004 yılında, biz nereye biz izole sıçan beyin kılcal çeşitli sinyal yolları araştırmak için kullanılan iki raporlar yayınlandı. Hartz ve ark. 21, peptid endotelin-1 P-gp taşıma işlevinde beyin kılcal (PKC) endotelin reseptör B (ETB) reseptör, nitrik oksit sentaz (NOS) ve protein kinaz C üzerinden hareket ederek hızla ve geri dönülebilir olarak azaltılmış bulduk. Bauer vd. 19, nükleer reseptör pregnane X reseptör (PXR) ifade ve P-gp ifade ve taşıma fonksiyonunu kullanabilirsiniz beyin kılcal gösterdi PXR modülasyon gösterdi. Deneylerde transgenik insanlaşmış PXR fareler ile bu satırı araştırma, genişletilmiş ve in vivo etkinleşmiş P-gp ile hPXR harekete geçirmek25tarafından bariyer sıkma gösterdi. 2010 yılında, Hartz ve ark. P-gp protein ifade geri yüklemek ve etkinlik mutlu overexpress transgenik insan amiloid precursor protein (mutlu) farelerde taşımak için bu yaklaşım 26 ' yı kullandık. Ayrıca, P-gp mutlu içinde geri fareler amiloid beta (Aβ)40ve Aβ42beyin düzeyleri azaltılacağını.
Sinyal yolları eğitim ek olarak, izole beyin kılcal biz kapiler kaçak başvuran kapiller permeabilite değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir. Özellikle, Texas kırmızı sızıntı tahlil zaman ve bu veriler üzerinde kılcal lümen Texas kırmızıdan sonra kaçak oranları analiz etmek için kullanılan floresan boya kaçağı değerlendirmek için kullanılır. Bu denetim kılcal kıyasla artmış kapiller sızıntı kan - beyin bariyerini2fiziksel bütünlüğünü değişimler gösterir. Çok sayıda hastalık durumlarında bariyer bozulma, e.gile ilişkili olduğundan bu değerlidir., epilepsi, multipl skleroz, Alzheimer hastalığı ve travmatik beyin hasarı27,28,29, 30. Diğer grupları da protein ifade ve proteinler31,32,33,34taşıma faaliyetleri düzenleyen sinyal yolları ayırt etmek izole kılcal kullanılmıştır, 35,36,37. Son olarak, bu yöntem insan beyin kapiller yalıtım için optimize etmek devam etmiştir ve son zamanlarda, biz artan P-gp ifade insan kan - beyin bariyerini hastalarda, epilepsi nöbet ücretsiz kontrol bireylere38 karşılaştırıldığında ile gösterdi . Birlikte ele alındığında, bu gelişmeler izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu eğitim için çok yönlü bir model olarak hizmet verebilir göstermektedir.
Çeşitli içinde vivo, ex vivove in vitro kan - beyin bariyerini modelleri temel araştırma ve endüstriyel uyuşturucu tarama, esas olarak ilaç dağıtım beyin39,40,41 test amacı ile kullanılmıştır ,42,43,44. İzole ex vivo beyin kılcal yanı sıra, geçerli kan - beyin bariyerini modelleri dahil silico modelleri, vitro hücre kültürü izole beyin kapiller endotel hücreleri veya çeşitli ölümsüzleştirdi hücre satırlarından türler, vitro kültür insan pluripotent kök beyin kapiller endotel hücreleri ve mikrosıvısal modelleri bir yonga üzerinde içine hücre (hPSC).
Silico modelleri tahmin edilen emme, dağıtım, metabolizması ve atılımı (ADME) özellikleri dayalı ilaç adaylarının seçmek için ilaç geliştirme içinde en yaygın olarak kullanılır. Niceliksel yapısı-özelliği ilişki (QSPR) modelleri ve niceliksel yapısı-etkinlik ilişkisi (QSAR) modelleri gibi yöntemleri kütüphanelerin yüksek üretilen iş tarama beyin penetrasyon ilaç adaylarının tahmin etmek için kullanılan popüler yöntem vardır 45 , 46. bu modeller ekran moleküllere bariyer penetrasyonu özellikleri için yararlıdır.
Betz vd. 47 monolayers kültürlü beyin kapiller endotel hücrelerinin bir vitro kan - beyin bariyerini modeli kurulmuş. Vitro hücre kültür modelleri taze doku veya ölümsüzleştirdi endotel hücre hatları gibi insan beyin microvessel endotel hücreleri (hCMECs) kullanarak beyin penetrasyon veya mekanik çalışmaları için başka bir yüksek üretilen iş tarama aracı olabilir. Ancak, beyin kapiller endotel hücre kültür modelleri fizyolojik kesme stres kan akımı kapiller lümen içinde eksikliği, genel olarak biyolojik karmaşıklığı sınırlıdır ve değişiklikleri ifade ve yerelleştirme önemli bariyer bileşenlerinin meydana sıkı kavşak proteinler gibi yüzey reseptörlerinin, ışınlayıcılar, enzimler ve iyon kanalları48,49,50. Diğer taraftan, endotel monolayers hPSCs türetilmiş, hCMEC/D3 kültürlere göre düşük sükroz geçirgenliği var ve bazı kan - beyin bariyerini taşıyıcılar, adezyon molekülleri ve sıkı kavşak51, polarize ifade içeren 52. ancak, bu hücreler aynı zamanda kültür özellikleri değiştirme tabi, ve sistem içinde vivo bariyer özellikleri52onun tekrarlama için doğrulanması gerekir.
Kan - beyin bariyerini araştırma daha yeni eğilimler mikrosıvısal cihazlar üretmek için organ-on-chip teknolojisini kullanarak veya içi boş fiber teknolojisi53, kullanan yapay kılcal damarlar, oluşturmak için 3D doku kültürü sistemleri kullanan dahil 54 , 55. yapay kılcal damarlar, ancak, önemli ölçüde daha büyük çaplarda (100 – 200 µm) beyin kılcal damarlar (3-7 µm) daha vardır. Bu nedenle, kesme kuvvetleri vitro değil tamamen benzer vivo içinde durum. Bu "blood-brain-barrier-on-a-chip" mikrosıvısal cihazlar, Yapay membran formu "kan" ve "beyin" bölmeleri ve sıvıları mikrosıvısal kesme kuvvetleri bu cihazlar aracılığıyla nerede pompalanır ele olduğunu. Benzer şekilde, astrocytes ile çeşitli kombinasyonlarda endotel hücreleri ve vasküler düz kas hücreleri ortak kültürleri de hollow fiber teknolojisi ile rheological parametreleri vivo içinde koşullar56 altında mevcut yeniden oluşturmak için kullanılmıştır , 57 , 58. ancak, ne kadar iyi bu modeli kan - beyin bariyerini taşıma, metabolizma, sinyal ve diğerleri gibi diğer özelliklerini yansıtır belli değildir. Bu yapay kılcal ve chip modelleri ilaçların yüksek üretilen iş tarama için uygundur, ancak bu modeller oluşturmak için kullanılan hücrelere de kültür sırasında değiştirilebilir.
Dondurulmuş ve sabit beyin dilimler veya birincil beyin kapiller endotel hücre kültürlerindeinsan microvasculature çalışma5,59,60,61için kullanılabilecek ek modellerdir. Örneğin, immünhistokimya sabit beyin dokusunun protein yerelleştirme belirlemek için kullanılır ve sağlıklı ifadede hastalıklı dokusu ile karşılaştırıldığında.
Dokusu dilimlerin ve vitro modelleri yanı sıra yukarıda açıklanan, taze izole beyin kılcal kan - beyin bariyerini işlev eğitim için yararlı olabilir. Bu izole kapiller modelin sınırlamaları içerir taze insan beyin dokusu, elde etmek için zorluk olmaması astrocytes ve nöronlar ve nispeten zaman alan ayırma işlemi. Bir avantajdır izole beyin kapiller modeli bu modeli çok benzeyen vivo içinde durum ve bu nedenle, bariyer fonksiyonu ve fonksiyon bozukluğu karakterize etmek için kullanılabilir. Önemlisi, bu da sinyal mekanizmalarını deneyleri ve moleküler teknikleri3,19,62,63çok sayıda kullanma ayırt için kullanılabilir.
Bizim Laboratuvar her iki taze ve donmuş insan beyin dokusu yaşlanma Sanders-kahverengi Merkezi aracılığıyla erişebilir (IRB #B15-2602-M)64. Bu bağlamda, standart bir protokol otopsi izle, beyin içinde elde edilen < 4 h ve tüm yordamları uygun NIH Biospecimen en iyi pratik kurallar65için. Bu benzersiz erişim insan beyin dokusu ile göz önüne alındığında, biz kurulan ve beyin kılcal sağlam, uygun insan beyin kılcal yüksek bir verim içinde sonuçları insan beyin dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş. Protein ifade ve etkinliğini belirlemek için iki ortak bitiş noktası ilgi vardır. Bu bağlamda, biz ve diğerleri ile izole beyin kapiller protein ifade ve aktivite düzeyleri kullanılabilir çeşitli deneyleri kurduk. Bu deneyleri Western blot, basit Western tahlil, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), zymography, taşıma faaliyet deneyleri, içerir ve Kapiler kaçak deneyleri. Bu deneyleri araştırmacılar bariyer fonksiyonu insan patolojik koşullarında değişimler çalışma, protein ifade ve etkinlik düzenleyen yolları belirlemek ve kan - beyin bariyerini ilişkili tedavisi için farmakolojik hedefleri belirlemek izin hastalıklar.
Alınan birlikte, taze izole beyin kılcal kan - beyin bariyerini sağlam ve tekrarlanabilir model olarak hizmet verebilir. Özellikle, bu model bir yelpazeye bariyer fonksiyonu çalışma için bitiş noktaları belirlemek için birçok farklı deneyleri ile kombine edilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Personal Protective Equipment (PPE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>32916-636</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Protective Labcoats</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>470146-214</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield, disposable</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>19460102</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>01-815-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versi Dry Bench Paper 18&#34; x 20&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>14-206-32</td>
			<td>to cover working areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Sharps Container Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75800-272</td>
			<td>for used scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz</td>
			<td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td>
			<td>323775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C Refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>13-986-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>AB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph RZR 2102 Control</td>
			<td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td>
			<td>501-21024-01-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica L2 Dissecting Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td>
			<td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td>
			<td>9158168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale P-403</td>
			<td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td>
			<td>0191392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard mini Stir</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>1151050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td>
			<td>11-670-4C</td>
			<td>used to freeze the tissue?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voyager Pro Analytical Balance</td>
			<td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td>
			<td>VP214CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axiovert Microcope</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to check isolated capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 1-5mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377823T1</td>
			<td>wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377821T1</td>
			<td>resuspend pellet in BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Boy</td>
			<td>Integra, Hudson, NH, USA</td>
			<td>739658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EISCO Scalpel Blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>S95938C</td>
			<td>to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>to cover beaker and volumetric flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21-377-304</td>
			<td>to wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 ml syringe with Luer-Lok</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>BD309653</td>
			<td>used with connector ring to filter capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10060-13</td>
			<td>used for mincing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td>
			<td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td>
			<td>3431E25</td>
			<td>50 ml volume, clearance: 150-230 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogenizer</td>
			<td>VWR, Radnor PA USA</td>
			<td>62400-642</td>
			<td>15 ml volume, clearance: 80-130 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &#181;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td>
			<td>146424</td>
			<td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainers (pore size: 30 &#181;m)</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>43-50030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector Ring</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>41-50000-03</td>
			<td>reuse multiple time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Volumetric Flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Bottle (60 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep everything cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mincing of brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Cell Scraper</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89260-222</td>
			<td>to remove supernatant after centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Fraction V, A-9647</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647-500g</td>
			<td>prepare in DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30264.FS</td>
			<td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll PM400</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F4375</td>
			<td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>71474</td>
			<td>to adjust pH of the DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Concentration: 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

Anlayış kan - beyin bariyerini işlevi fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında beyin ilaç dağıtım geliştirmek için beyin korumasını geliştirmek ve beyin tedavi sözü tutun yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemlidir bozuklukları. Ancak, insan kan - beyin bariyerini işlev eğitim meydan okuyor. Böylece, uygun modelleri için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu bağlamda, beyin kılcal insan beyin dokusundan izole bariyer fonksiyonu olarak insan vivo içinde durum mümkün olduğunca yakın çalışma için eşsiz bir araç temsil eder. Burada, kılcal bir yüksek verimli ve tutarlı kalite ve saflık insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir protokolü açıklar. Kılcal mekanik homojenizasyon, yoğunluğu-gradient Santrifüjü ve filtrasyon kullanma taze insan beyin dokusundan izole edilmiştir. Yalıtım sonra insan beyin kapiller protein ifade ve işlev, enzim aktivitesi veya hücre içi sinyal çalışmaya sızıntı deneyleri, canlı hücre görüntüleme ve bağışıklık tabanlı deneyleri gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. İzole insan beyin kılcal insan kan - beyin bariyerini işlevi Yönetmeliği aydınlatmak için benzersiz bir model vardır. Bu model CNS hastalıkları tedavisi için tedavi edici stratejiler geliştirilmesine yardımcı olacak merkezi sinir sistemi (MSS) patogenezinde kazandırabileceğini.

İnsan beyin dokusundan izolasyonların insan beyin kılcal (Şekil 1B) zenginleştirilmiş bir süspansiyon daha büyük gemiler, kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreleri ve bazı hücre artıkları küçük miktarlarda verim. Bazı kılcal dallı ve bazı, kırmızı kan hücreleri kılcal lümen entrapped. Tipik kılcal bir 3-7 µm çapı ve yaklaşık 100-200 µm uzun ile açık lümen; çoğu kapiller biter daraltılır. Confocal mikroskobu kullanılarak, izole insan beyin kılcal borulu, sağlam yapısı ve morfoloji ortaya koyuyor. Şekil 2A bir temsilcisi insan beyninin kapiller ekli bir pericyte ve alyuvar lümen içinde ışık görüntü aktarılan gösterir. Uygun olarak izole beyin kılcal12,17,18yapısını önceki raporlarda çap, boyut ve morfolojisi ile ilgili bulgular vardır. İzole insan beyni Şekil 2B kapiller C219 birincil antikor (1 µg/mL); kullanma immunostained P-gp (yeşil) olduğunu çekirdeklerin DAPI ile counterstained (1 µg/mL).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57346/57346fig1.jpg"> Şekil 1: akış kapiller yalıtım için. (A) piktogram prosedürünün beyin kılcal taze insan dokusundan izole etmek için başlıca adımları göstermektedir. (B) resmi doğrudan yalıtım (100 X büyütme) sonra izole insan beyin kılcal hafif bir mikroskop altında gösterir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57346/57346fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57346/57346fig2.jpg"> Şekil 2: izole insan beyin kapiller. (A) A ışık aktarılan görüntü izole bir insan beyninin kılcal. (B) confocal mikroskop görüntü izole insan beyin kapiller immunostained P-gp için (yeşil; gösterir C219 1 µg/mL); çekirdeklerin DAPI (mavi; 1 µg/mL) ile counterstained. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57346/57346fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57346/57346fig3.jpg"> Şekil 3: yoğunluk Santrifüjü sorun giderme. Piktogram yoğunluk gradient Santrifüjü sonra hazırlık gösterir. Bu çok fazla ve çok az yoğunluk gradient orta ve bu ayrılık ve ortaya çıkan kılcal Pelet etkilemesi etkilerini vurgular. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57346/57346fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57346/57346fig4.jpg"> Şekil 4: P-gp protein ifade izole insan beyin kılcal. Western blot güçlü grupların P-gp için gösterir (1 µg/mL) hCMEC\D3 hücrelere kıyasla izole insan kılcal damarlar içinde. Β-aktin yükleme denetimi (1 µg/µL) olarak kullanılmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57346/57346fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57346/57346fig5.jpg"> Şekil 5: uygulamaları yalıtılmış insan beyin kılcal damarlar için. En yaygın uygulamaları yalıtılmış beyin kılcal damarlar için genel bir bakış literatürde yayınlandı. İzole kılcal damarlar için kullanılmıştır: 1) genomik85,86, 2) proteomik3,38,87,88,89,90, 91,92,94,95,96, 3) fonksiyonel proteomik2,38ve 4) Cellomics82, 83,84,97,98,99. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57346/57346fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Vuruş</td>
			<td>Zaman [dakika]</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 – 25</td>
			<td>7-7.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>26-50</td>
			<td>5-5,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>51-75</td>
			<td>5-5,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>76-100</td>
			<td>5-5,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam süre:</td>
			<td>22 – 24 dk</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: homojenizasyon protokolü. Potter-Elvehjem doku değirmeni insan frontal korteks, 50 rpm homojenizasyon hızında 10 g homojenize homojenizasyon protokol. Not ilk birkaç vuruş kıyılmış doku homojenize için ek saat gerektirir. Bu ilk homojenizasyon sonra her konturun 12 yaşında s süresi (6 s aşağı doğru hareket, 6 için yukarı doğru hareket için s). Böylece, ilk homojenizasyon sonra 5 vuruş 1 dk veya 25 vuruş 5 min içinde gerçekleştirilebilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sorun</td>
			<td>Olası neden</td>
			<td>Çözüm</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Kılcal damar yok Pelet</td>
			<td>1) yanlış Ficoll konsantrasyonu</td>
			<td>1) ayarlamak Ficoll konsantrasyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>2) yanlış Santrifüjü hız</td>
			<td>2) Santrifüjü hızını ayarlama</td>
		</tr>
<tr>
<td>3) yanlış ivme ve/veya yavaşlama hızı</td>
			<td>3) ivme ve/veya yavaşlama hızı ayarlayın</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Düşük kapiller verim</td>
			<td>1) meninkslerde filtrasyon adımları engelleme</td>
			<td>1) filtrasyon önce tüm meninkslerde kaldırmak</td>
		</tr>
<tr>
<td>2) çok fazla kılcal yalıtım işlem sırasında kaybetti</td>
			<td>2) arabellek konsantrasyon doğru hesaplama, pipet ipuçları durulama</td>
		</tr>
<tr>
<td>3) yıkama kılcal PluriStrainer filtreler kapalı yetersiz</td>
			<td>3) filtreler ters çevirin ve dikkatle incelemek için kılcal damarlar (kullanma mikroskop)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4) resuspensions sırasında aşırı kabarcıklar</td>
			<td>4) yavaş yavaş kabarcıklar önlemek için pipet</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Uygun olmayan kılcal</td>
			<td>1) genişletilmiş öldükten sonra aralığı</td>
			<td>1) mümkünse aralığı azaltmak veya ek donmuş beyin kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yalıtım için doku dondurulmuş 2) kullanma</td>
			<td>2) kullanım taze doku</td>
		</tr>
<tr>
<td>3) yalıtım yordam çok uzun zaman</td>
			<td>3) iş akışı en iyi duruma getirme</td>
		</tr>
<tr>
<td>4) ekipman/arabellekleri buza yalıtım işlem sırasında tutuldu değil</td>
			<td>4) sırasında yalıtım ekipman ve arabellekleri buz üstünde tutmak</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: ortak sorunların giderilmesi. En yaygın hataları ve yalıtım yordam ve onlar nasıl çözülebilir sırasında oluşan sorunları listesi.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

İnsan beyin dokusundan izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında çalışmaya preklinik model olarak kullanılabilir. Burada, beynin kılcal taze insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

isolation-of-cerebral-capillaries-from-fresh-human-brain-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Görüntüleme.  University of Kentucky. İnsan beyin dokusundan izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında çalışmaya preklinik model olarak kullanılabilir. Burada, beynin kılcal taze insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Nörobilim

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Beyin Dokusu Kronik Optogenetic uyarılması için Fiber-optik İmplantasyon

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

Dissected Serebral Kortikal Eksplantlarından ile kullanım için Kemirgen Embriyolar arasından Beyin Omurilik Sıvısı İzolasyonu

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

İzolasyon ve Serebral Parankimal arteriollerin kanülasyonu

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Microcoil stenoz ile hafif intrauterin hipoperfüzyon fare modeli

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...