Nasser Rusan'ın desteği olmasaydı bunların hiçbiri mümkün olmazdı. Nih Fare Görüntüleme Tesisi'nden H. Doug Morris, Danielle Donahue ve Brenda Klaunberg'e ve Micro Photonics'den Ben Ache'ye eğitim ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca Zeiss'li Mansoureh Norouzi Rad'e Xradia 520 Versa'daki karın örneklerini taradığınız için teşekkür ederim. Lauren Smith, Samantha Smith ve Rachel Ng de taramaya yardımcı oldu. Nesne Araştırma Sistemleri'nden Mike Marsh, Dragonfly teknik desteği sağladı. Ayrıca Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (1K22HL137902-01) ve Wyoming Üniversitesi'nden Start Up Fonları desteği için minnettarım. Ayrıca anonim yorumculara yararlı önerileri ve yorumları için teşekkür ederim.

1. Örnek seçimi ve manikül hazırlığı
<ol><li>Görüntüleme için uygun gelişimsel zaman noktasını (embriyo, larva, pupa veya yetişkin) seçin.<ol>
<li>Embriyonik aşamalar için, maya ezmesi ile bulaşmış üzüm suyu agar tabaklarındaki kafes dişileri ve her 30-60 dakikada bir yumurta toplayın. Uygun aşamaya gelene kadar bu embriyoları 25 °C'de gelişmeye bırakın.</li>
		<li>Larva aşamaları için, zamanlanmış embriyo toplama deneylerinden birinci ve ikinci instarları toplayın. Kalabalık olmayan koşullar altında yiyecek şişesinin yanından doğrudan 3rd instars seçin.</li>
		<li>Pupal zamanlama için, beyaz pupa öncesi (ters spiracles) toplayın ve kıtikalenin kahverengi olmaya başladığı zamanı not edin. Hayvanlar, tiktik kahverengimsi takiben tanımlanmış zaman noktalarında pupal gelişiminin 15 aşamasında ilerleyecek ve buna göre toplanabilir42.</li>
		<li>Yetişkinleri eklozyonu takiben bakire olarak toplayın ve gerekli bir süre boyunca bir gıda şişesinde yaşlanmaya izin verin (örneğin, tam bağırsak gelişimi için 5 gün).</li>
	</ol>
</li>
	<li>5-50 hayvanı 1x Fosfat Tamponlu Salin 'de (%0,5 PBST) %0,5 Triton X-100'ün 1 mL'sini içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tezgahta periyodik olarak tüpe dokunurken, hidrofobik kaplamanın çıkarılmasına yardımcı olmak ve hayvanların tamamen suya batmasına izin vermek için oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın.<ol>
<li>Embriyonik, larva ve pupal aşamaları için, tüpü 20 s için 100 ° C'ye ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirerek ve ardından RT'de 5 dakika soğutarak daha fazla gelişmeyi kesin. NOT: Hayvanlar sıvı nitrojen37'deflaş dondurulabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fiksasyon ve boyama
<ol><li>%0,5 PBST'yi çıkarın ve Bouin'in Çözümünden 1 mL ekleyin. Hayvanların tamamen su altında kalmasını sağlamak için tüpe dokunun. DİkKAT: Bouin'in Çözümü formaldehit içerir. Dökülürse cilt ve gözlere akut toksisiteye neden olabilir ve yutulabilirse ölümcül olabilir. Kullanırken eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. NOT: Etanol kullanımı gibi ek fiksasyon teknikleri de kullanılabilir. Diğer fiksatiflerin yararlarıref. 1,30.<ol>
<li>Embriyo ve yetişkin örnekleri için RT'de 16-20 saat boyunca tezgahta kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Larva ve pupal örnekleri için, RT'de hayvanları 2 saat sabitle. 1x PBS içeren çok iyi bir diseksiyon kabına aktarın ve ön ve arka kütiküldeki bir deliği dürtmek için bir tutucuya bağlı küçük bir minutien pim kullanın.</li>
		<li>Larva ve pupal örneklerini bir mikrofuge tüpüne geri aktarın ve 1 mL taze Bouin çözeltisi ekleyin. RT'de 24 saat boyunca tezgahta kuluçkaya yaslanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bouin'in Çözeltisi'ni çıkarın ve numuneyi 1 mL μ-CT Yıkama Tamponu (0,1 M Na 2 HPO4,%1,8Sakkaroz) veya 1x PBS üç kez ile 30 dakika yıkayın.</li>
	<li>Uygun boyama çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin ve 2-7 gün boyunca tezgahta kuluçkaya yatırın. NOT: Leke seçimi birçok faktöre bağlı olacaktır, ancak genellikle penetrasyon, kuluçka süresi ve çözünürlük arasındaki bir dengedir. Genel olarak, fosforungstik asit (PTA) yumuşak dokunun üstün kontrastını ve çözünürlüğünü sağlar, ancak kütikülün mekanik bozulmasını ve daha uzun kuluçka sürelerini gerektirir. Farklı leke tiplerinin yararları ref.1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.<ol>
<li>İyot boyama için 1 mL 0.1 N I2KI (Lugol Çözeltisi) kullanın. 2 gün kuluçkaya yatır. Yetişkin manikülde daha fazla bozulmaya gerek yoktur.</li>
		<li>Fosfoungstik asit (PTA) boyama için, suda seyreltilmiş% 0,5 (w / v) çözeltinin 1 mL'sini kullanın. Bir tutucuya bağlı küçük bir minutien pim ile toraks veya abdominal kütiküldeki ağız partilerini veya delikleri dürterek yetişkin kütiküllerini bozun. Doku lekesi homojen değilse 5-7 gün veya daha uzun süre kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 dakika boyunca 1 mL ultra saf su veya 1x PBS ile yıkayın. Yıkama adımlarını tekrarlayın. Rt'de hayvanları ultra saf suda veya 1x PBS'de bir aya kadar saklayın.</li>
	<li>Hayvanlar nemlendirilirken taranacaksa, doğrudan bölüm 4'e geçin. Numunenin daha uzun süre korunması gerekiyorsa, protokolün bölüm 3'üne geçin.</li>
</ol>3. Kritik nokta kurutma (İsteğe bağlı)
<ol><li>Numune üzerinde bir etanol (EtOH) dehidrasyon serisi gerçekleştirin: %10, %25, %50, %75, %100, %100. EtOH çözeltisinin 1 mL'lik kısmını ekleyin ve belirtilen sırayla her konsantrasyon için 1 saat boyunca tezgahta kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Son % 100 EtOH ıslatıldıktan sonra, taze% 100 EtOH ile değiştirin ve numunenin tezgahta bir gecede kuluçkaya yatmasına izin verin.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uyarak numunelerin kritik nokta kurutmasını gerçekleştirin. NOT: Elektron mikroskopi tesisleri genellikle EtOH dehidratasyonunu takiben numuneninkurumasını gerçekleştirecek kritik bir nokta kurutma makinesine (bkz. Malzeme Tablosu) sahiptir.</li>
</ol>4. Numune montajı
<ol><li>Kritik nokta kurutulmuş numuneler için, dönen aşamanın aynasına sığacak şekilde tasarlanmış bir böcek pimine veya başka bir tutucuya sıcak tutkal örnekleri veya plastik veya cam kılcal boruya (~1,0-1,25 mm iç çap) yerleştirin.</li>
	<li>Hidratlı numuneler için, bir P10 pipet ucunu suyla doldurun ve sızıntıyı önlemek için dar ucunu ısı sızdırmazlık veya parafin filmi ile sabitleyin. DİkKAT: Suyun tarayıcıya sızmaması ve hasara yol açmaması için bağlantıları sıkıca sardığınızdan emin olun.<ol>
<li>Tek bir örneği tokmak kullanarak pipet ucuna aktarın. Körelmiş 20 G iğne veya başka bir pipet ucu gibi uzun, ince bir nesne kullanarak, numuneyi yerinde tutmak için pipet ucunun duvarına temas edene kadar dikkatlice uçtan aşağı itin.</li>
		<li>Uzun taramalar sırasında suyun buharlaşmasını önlemek için pipet ucunun açılmasını parafin filmi ile örtün.</li>
		<li>P10 pipetini döner sahnenin aynasına sığacak şekilde tasarlanmış bir tutucu kullanarak monte edin (Şekil 1A-C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Tarama
<ol><li>Gün için görüntülemeden önce makinenin gerekli kalibrasyonlarını gerçekleştirin. NOT: Bunlar üreticiye göre değişecektir ve uygun adımları belirlemek için bir uygulama uzmanına danışmanız önerilir. Bu protokolde kullanılan kurulum ve yazılım hakkında özel bilgi için lütfen Malzeme Tablosu'na bakın. Genellikle, mandrenin dönen aşamaya göre eksen dışında olmasıyla ilişkili herhangi bir 'sallantıyı' kaldırmak ve kameradaki tekdüze arka plan piksel yoğunluklarını sağlamak için düz alan düzeltmeleri yapmak için sahne ekseni hizalaması gibi kalibrasyonlar, birden fazla taramada karşılaştırılabilir en iyi çözünürlük ve veri kümeleri için en uygun görüntüleme koşullarını sağlar.</li>
	<li>Yazılımın sol üst köşesindeki 'Kapıyı Aç' simgesine tıklayarak dönen sahne aynasına erişmek için tarayıcı kapısını açın. Yakayı numune tutucunun tabanına sıkarak numuneyi takın. NOT: Tarayıcı hizalamasını korumak için numuneyi dönen aynaya taktırırken hafif basınç kullanın.</li>
	<li>Tarayıcıyı en iyi çözünürlük ve kontrast için kontrol eden yazılımda tarama parametrelerini ayarlayın. NOT: Her tarayıcının X-ışını kaynağı, kamerası/dedektörü ve geometrisi üreticiye göre değişeceğinden bunların ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir. En iyi parametreleri seçmek için ek bilgileri burada da bulabilirsiniz43, ayrıca üreticinin uygulama uzmanından.<ol>
<li>X-Ray kaynak güç kontrolünü açma (Seçenekler | X-ray Kaynağı). X-ışını voltajını 30-40 kV'a ve akımı 100-110 μA'ya ayarlamak için kaydırıcı çubuklarını kullanın ve gelişmiş çözünürlük için 3-4W güce ve küçük bir spot boyutuna sahip bir X-ışını ışını üretin.</li>
		<li>Edinme Modları iletişim kutusunu kullanma (Seçenekler | Alma Modları) kamera pozlama süresini 500-800 ms olarak ayarlamak için.</li>
		<li>Kamera ayarlarına ve konumuna bağlı olarak istenen görüntü piksel boyutunu (~700 nm ila 4 μm) ayarlamak için yazılımın altındaki büyüteç simgesinin yanında bulunan kaydırıcı çubuğunu kullanın. Bu, tarama sırasında elde edilen projeksiyon görüntülerinin sayısını belirler ve daha fazla projeksiyon gelişmiş çözünürlüğe ancak daha uzun tarama sürelerine yol sağlar (bkz. Temsili Sonuçlar).</li>
		<li>Örneği 360° döndürme yolu boyunca taşımak için yazılımın altındaki dönen okun yanında bulunan kaydırıcı çubuğunu tıklatıp sürükleyin. Örneğin görüş alanında kaldığından emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yazılımın üst kısmındaki 'Edinmeye Başla' simgesine (mavi daire ok simgesi) tıklayın. Ek tarama parametrelerinin ayarlanıp taramanın kaydedileceği dosya ve çıktı klasörünün adlandırılmasına izin veren bir iletişim kutusu görüntülenir.<ol>
<li>Rastgele hareketi 10 ve ortalama 4-6 kareye ayarlayın. Döndürme adımı, kullanılan kamera ayarlarına bağlı olarak otomatik olarak hesaplanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Edinme iletişim kutusunda'Tamam'ı tıklatarak taramaya başlayın. Tarama süresini gösteren ikinci bir ilerleme çubuğu iletişim kutusu görüntülenir. Tarayıcı artık dönüş yolu boyunca numunenin bir dizi projeksiyon görüntüsü(Şekil 1D)elde edecek ve izlenmesine gerek yok.</li>
</ol>6. Yeniden Yapılanma
<ol><li>Tomogramları oluşturmak için projeksiyon görüntülerini kullanarak görüntü yeniden yapılandırma gerçekleştirin. NOT: Koni ışını geometri tarayıcılarından gelen görüntülerin hemen hemen tüm rekonstrüksiyonu Feldkampalgoritması 16'ya dayanırken, bireysel parametreler yazılım uygulamasına bağlı olarak değişecektir ve ampirik olarak belirlenmelidir. Ticari olarak kullanılabilen bir yazılıma özgü aşağıdaki ayarlar (bkz. Malzeme Tablosu)kılavuz olarak kullanılabilir. Yanlış hizalama telafisi, halka yapıt azaltma ve ışın sertleştirme düzeltmesi (çoğu sinek örneği için%0) gibi parametreler, son rekonstrüksiyon için en iyi değerleri seçmek için yinelemeli bir şekilde gerçekleştirilir. Yeniden yapılandırma süreci üzerinde daha fazla kontrol sahibi olmak isteyen ileri düzey kullanıcılar için, matlab arayüzüne bakın44.</li>
	<li>Başvuru taramalarına dayalı bir vardiya düzeltme algoritması kullanarak ilk görüntü hizalamasını gerçekleştirme45 (Eylemler | Referans taramasıyla X/Y hizalaması).
</li>
	<li>Her yeniden yapılandırma parametresine ince ayar yapın (Başlangıç | İnce ayar). Bu, bir 'Parametre ince ayarı' iletişim kutusunu etkinleştirir.<ol>
<li>'İleri' ile 'Hizalama Sonrası'nı tıklatarak hizalamaya ince ayar yapın. Yineleme sayısını beşe ve parametre adımını 1,0 olarak ayarlayın. Bir dizi önizleme oluşturmak için Başlat düğmesini tıklatın. Düzgün hizalanmış görüntüyü seçin. NOT: Düzgün hizalanmış bir görüntü bulanık olmayacak veya aksi halde sürekli bir yapının (nikle gibi) bölünmüş göründüğü 'yamumlu' yapıları görüntülemeyecektir.</li>
		<li>Yanındaki halka yapıt azaltmayı tıklayarak ince ayar yapın. Yineleme sayısını beşe ve parametre adımını 1,0 olarak ayarlayın. Bir dizi önizleme oluşturmak için Başlat düğmesini tıklatın. En az sayıda halka içeren resmi seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yukarıdaki parametreler en iyi görüntüyü verecek şekilde optimize edildikten sonra, seçilen değerlerin Ayarlar sekmesinde(Ayarlar) düzgün bir şekilde temsil edildiğinden emin olun.
</li>
	<li>Histogramı, bit derinliği ve türü gibi dosya parametrelerini kullanarak son parlaklık ve kontrast değerlerini ayarlayın ve hesaplama süresini(Çıktı)azaltmak için yalnızca ilgi alanlarını (örneğin, yalnızca tüm sinek veya kafa) kapsayan bir İlgi Alanı (ROI) kullanın.</li>
	<li>Yeniden yapılandırmaya başlayın (| başlayın Başlat). Birden çok yeniden yapılandırma gerekiyorsa, geçerli görüntüyü toplu iş yöneticisine ekleyin (Başlangıç | Toplu işleme ekle) ve kalan görüntüler için 6.2-6.5 adımlarını yineleyin.</li>
</ol>7. Görüntü analizi
<ol><li>Tomogramları iki ve üç boyutta görselleştirin ve ücretsiz veya ticari yazılımlarla daha fazla morfometrik analiz gerçekleştirin. NOT: Bu protokolde kullanılan yazılımın ayrıntıları Malzeme Tablosu'nda mevcuttur. μ-CT veri kümelerini değerlendirebilen diğer yazılım paketleri arasında FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47ve ITK-SNAP48gibi ücretsiz seçeneklerin yanı sıra ticari yazılımlar (örneğin, AMIRA) bulunur. Segmentasyon sürecini yarı otomatikleştirmek için makine öğrenimi tabanlı algoritmalar kullanan diğer uygulamalar, iş akışlarını hızlandırmaya ve insan önyargısını azaltmaya yardımcı olabilir (örneğin, Biomedisa49).</li>
	<li>Tomogram dosyasını yazılıma içe aktarma (Dosya | Görüntü Dosyalarını İçeri Aktar). Dosyayla ilişkili meta veriler otomatik olarak pencereye yüklenmelidir, ancak görüntü özellikleriyle eşleşecek şekilde el ile de ayarlanabilir.</li>
	<li>İlgi çekici bir yapıyı segmentlere ayırmak için ekranın sol tarafındaki Segment sekmesini tıklatın. Yeni bir İlgi Alanı (YATıRıMGK) Oluşturma (Temel | Yeni), ona bir ad verin ve uygun bir renk seçin.</li>
	<li>İlgi yapısını kapsayan eşik aralığını tanımlama (Aralık | Aralığı Tanımla) kaydırıcı çubuğunu kullanarak.</li>
	<li>Uygun bir 2D veya 3D YATıRıM GETIRIsi boyacı araç modu seçin (YATıRıM GETIRI'sine | Boya fırçası seçeneği).
</li>
	<li>Eşik tarafından tanımlanan bir alanı boyamak için; sol fare tuşunu basılı tutarken Ctrl tuşunu basılı tutun. Bir alanı kaldırmak için, sol fare tuşunu basılı tutarken Shift tuşunu basılı tutun. NOT: Dairesel veya kare boya fırçasının boyutunu değiştirmek için, Ctrl veya Shift tuşlarını basılı tutarken fare tekerleğini kaydırmanız yeterlidir.</li>
	<li>Tüm Z hacmi boyunca ilgi yapısını boyamaya devam edin.</li>
	<li>Yatırım Getirisini Mesh'e Dönüştürme (Dışa Aktarma | Mesh | Normal).
</li>
	<li>Sağ üst köşedeki Veri Özellikleri ve Ayarları panelinde üzerine tıklayarak kafes kaplamasını vurgulayın.</li>
	<li>Uygun sayıda yineleme kullanarak ağı düzleştirin(Düz Mesh | Yinelemeler). NOT: Karşılaştırılacak tüm görüntüler için aynı mesh yumuşatma yineleme değerini kullanın.</li>
	<li>Temel morfometrik analiz için ekranın sağ tarafındaki Bilgi panelinde ağ yatırım getirisinin(Yüzey Alanı, Hacim ve Feret Çapı)ölçümlerinin görüntülendiğinden emin olun. Nesne Çözümleme Modülükullanılarak ek analiz yapılabilir.</li>
	<li>Kafes nesnesini ve tüm tomogram görüntüsünü işle ve 3B olarak görselleştir. Nesnenin videosunu oluşturmak için yerleşik Movie Maker'ı kullanma (Sağ Fare Tıklatmasını | Movie Maker'ı görüntüleyiciden tek tek kareler kullanarak göster (Anahtar Ekle). NOT: Belirli özellikleri vurgulamak için sağ paneldeki görsel efektler sekmesi kullanılarak filme çeşitli görsel geliştirmeler de uygulanabilir.</li>
	<li>Movie Maker'daki Animasyonu Dışa Aktar düğmesini kullanarak videoyu görüntülemek üzere dışa aktar.</li>
</ol>

Yazar hiçbir rekabet veya finansal çıkar beyan etmemektedir.

Tüm gelişim aşamalarında bozulmamış Drosophila melanogaster'ı görselleştirmek, öncelikle ışık mikroskopisinin bu hayvanda bulunan kalın, pigmentli kütikülle uyumsuzluğu nedeniyle bir zorluk olmaya devam etti. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG), Optik Koherens Tomografi (OCT) ve ultramikroskop doku temizleme ile birleştiğinde diğer tüm hayvan görüntüleme yöntemleri sineklerde başarı ile kullanılmıştır50,51,52,53,54, μ-CT bu organizmanın tüm hayvan görüntülemesi için ideal kılan bir dizi avantajsunarken 13 , 15,30 . X ışınları pigmentli kütiküllere kolayca nüfuz eder ve küçük dalga boyları mikron altı görüntülemeye izin verir. Etiketleme, yaygın olarak bulunan kimyasallara minimum yatırım gerektirir ve özel tezgah becerileri yoktur13. μ-CT tarayıcılar da ticari olarak mevcuttur ve maliyetler hafif mikroskopi platformlarıyla karşılaştırılabilirken, aynı zamanda bir kurumda kullanılabilirliğinden de yararlanabilecek daha geniş disiplinler (Jeoloji, Paleontoloji, Mühendislik vb.) için daha çekicidir. Senkrotron X-Ray kaynakları, sabit ve canlı böceklerin31,55,56,ancak ticari tezgah üstü tarayıcılardan daha az erişilebilir olan yüksek çözünürlüklü μ-CT görüntülemesi için de kullanılabilir.
Bu protokol, sinek yetişkinleri, pupa, larva ve hücreselleştirilmiş embriyoların μ-CT görüntülerini elde etmenin etkili bir yolunu sağlar. Yukarıda özetlenen adımların çoğu için, görüntüleme için örnekler hazırlamak için alternatif yöntemlerin de uygulanabileceğini unutmayın. Diğer çalışmalar, böceklerde kullanılmak üzere farklı sabitleme, etiketleme ve kurutma adımlarının ayrıntılı bir karşılaştırmasını sağlamıştır ve bu tekniği benimsemek isteyenler, her yaklaşımın yararlarını değerlendirmeye teşvik edilir 1 ,4,13,29,30,57. Bu protokol nispeten basit olsa da, birkaç yararlı öneri sunulmaktadır.
İlk olarak, alttaki yumuşak dokuların önemli ölçüde bozulmaması için sağlam örneklerin seklisini bozarken dikkatli olunmalıdır. Larva ve erken pupal aşamalarının dürtmeden önce Bouin'in çözeltisinde 2 saat boyunca sabitlenmesine izin vermek önemlidir. Bu, dokuyu sertleştirecek ve organ mimarisini değiştirebilecek lütikül deliklerinden sızacak hemolimf miktarını sınırlayacaktır. İlgi çekici yapı (lar) orada bulunuyorsa, yetişkinin bireysel vücut segmentleri (baş, toraks ve karın) ayrılabilir. Bu segmentleri forsepsle ayırmak yerine temiz bir şekilde dilimlemek için bir neşter kullanılması önerilir, bu da örneğin bağırsak veya merkezi sinir sisteminin 3D mimarisini bozabilir. Zamanlama gelince, yetişkinler genellikle sadece 16 saat gerekir. tam fiksasyon için larva ve pupal aşamaları 24 saat gerekir. Ayrıca, iyot veya PTA lekesi düzensiz görünüyorsa, numune lekeleme bile elde edilene kadar daha uzun süre kuluçkaya yatmak için çözeltiye geri yerlenebilir. Son olarak, nemlendirilmiş numuneler 4 ° C'ye yerlendirilmemelidir, çünkü bu, oda sıcaklığına ısındıktan sonra vücut boşluğu içinde hava kabarcıklarının oluşumunu teşvik ediyor gibi görünmektedir.
İkinci olarak, numune montajı alete, sahne tipine ve numunenin hidratlı kalması gerekip gerekmediğine veya kritik noktanın kurutulup kurutulmadığına göre değişir. Nemlendirilmişse, numunenin sızmadığından emin olun ve muhtemelen tarayıcıyı yok edin. Numuneyi bir pipet ucunun içine monte ederken, numuneler hafif bir dirençle karşılaşana ve hareket edemeyinceye kadar körelmiş bir nesneyle hafifçe itdiğinizden emin olun. Çok fazla itmek oksikül deformasyonuna ve alttaki yapısal kusurlara yol açabilir. Ayrıca, numunenin tutucuda dönme eksenine mümkün olduğunca yakın hizalı olduğundan emin olun. Herhangi bir yalpalama, daha geniş görüş alanı nedeniyle tarama sürelerini artıracak ve yeniden yapılanma sonrasında son tomogramın çözünürlüğünü azaltacaktır.
Üçüncü olarak, projeksiyon görüntülerini elde etmek için tarayıcı ayarları da enstrümana göre değişir. Tarayıcının çözünürlük yeteneklerini en üst düzeye çıkarmak için, X-ışını ışını nokta boyutu mümkün olduğunca küçük olmalıdır (5-10 μm). Bu, X-Ray voltajı ve akım ayarlarının toplam gücü 3-4 W olacak şekilde dengelenmesiyle elde edilebilir. Bu ayarlar ve kameradaki uygun pozlama süresi ile numune ile uygun X-ışını ışını zayıflaması ve optimum görüntü kontrastı elde edilebilir. Nesne ile X-ışını kaynağı arasındaki alüminyum veya bakır filtrelerin kullanımı, en iyi görüntü kontrastı için en uygun X-ışını enerjisi ayarlarında ince ayar yapmak veya daha yüksek güçlü kaynakların kullanılması için kirişi yeterince zayıflamak için kullanılabilir. Görüntü çözünürlüğüne gelince, bu leke türü, projeksiyon görüntüsü sayısı, görüntü piksel boyutu, kamera konumu, numune hareketi, tarayıcı titreşimleri ve yeniden yapılandırma parametreleri dahil olmak üzere birçok farklı değişkene bağlı olacaktır. Bilinen boyut işaretçilerini içeren bir çubuk desen hayaleti (QRM GmbH), belirli bir tarayıcı ve kamera ayarı için uzamsal çözünürlüğü değerlendirmeye yardımcı olabilir.
Ayrıca kritik nokta kurutulmuş veya hidratlı örnekleri görüntülemenin yararlarını değerlendirmeye değer. Sombke ve ark. iki yöntemin karşılaştırmalı bir değerlendirmesini yaptı ve eklembacaklıları içeren μ-CT uygulamaları için kritik nokta kurutmanın üstün olduğunu buldu30. Bununla birlikte, hidratlı örneklerin yararları, hayvanların hem nicel hem de morfolojik eserlere yol açabilecek daha az kimyasal ve mekanik maruziyete maruz kalmasıdır. Bu aynı zamanda hassas dokuları CPD'den daha iyi koruma eğilimindedir. Bununla birlikte, hidratlı numuneler çok daha kısa bir raf ömrüne sahiptir ve doku bozulması ve düşük görüntü kalitesi bu noktada belirgin hale geldiğinden, fiksasyondan en geç bir ay sonra görüntülenmelidir. Ayrıca, hidratlı numunelerin çözünürlüğü kritik bir nokta kurutulmuş numuneden biraz daha az olacaktır, çünkü X ışınları hem plastik pipet ucuna hem de çevredeki sıvıya (su veya tampon) nüfuz etmelidir. Kritik Nokta Kurutulmuş numuneler, özellikle Drierite'de tutulduğunda çok daha uzun süre korunabilir. Ayrıca, kanatları veya bacakları bir böcek pimine yapıştırarak ve montaj işlemini basitleştirerek sahne aynasına yerleştirerek doğrudan X-ışını ışını yoluna yerlenebilirler. Bununla birlikte, bu örneklerin geniş etanol dehidrasyonu doku büzülmesine ve hassas doku mimarisinin kaybına yol açabilir, bu nedenle bu etkileri en aza indirmek için bir dizi artan EtOH konsantrasyonu yapmak önemlidir. Bununla birlikte, paraformaldehit fiksasyonu ve hatta iyot lekelenmesi de dahil olmak üzere her türlü kimyasal tedavinin doku büzülmesine neden olabileceği belirtilmelidir58,59. Her iki yöntem de canlı bir sinekte 'gerçek organ büyüklüğü' ölçümleri sağlamazken, sabitleme, boyama ve kurutma adımları her iki numune kümesi için de aynı şekilde gerçekleştirildiği sürece mutant ve wildtype hayvanları karşılaştırırken morfometrik ölçümler hala geçerlidir ( tercihen paralel olarak).
Sonuç olarak, μ-CT Drosophila33 , 34 , 35,36,37,38,39,40,41için yararlı bir tüm hayvan görüntüleme aracı sağlar. Diğer birçok çalışma, böcek taksonomisi, ekoloji, fizyoloji, gelişim ve anatominin sineklerde gelecekteki çalışmaları bilgilendirmeye yardımcı olabilecek çeşitli yönlerini anlamak için bu teknolojinin gücünü sergilemiştir1,28,30,31,32,55,56,57 . Bu organizmada zaten yaygın olarak kullanılan genetik ve hafif mikroskopi araçlarıyla birlikte, μ-CT, genotip ve fenotip arasında daha derin bir anlayışa izin veren deneysel bir boru hattı içinde kendini konumlandırabilir.

Bir nesnenin iç yapılarının genel 3D mimarisini tahrip etmeden ayrıntılı olarak araştırılmasına izin veren görüntüleme yöntemlerinin fizik, mühendislik, malzeme bilimi, arkeoloji, paleontoloji, jeoloji ve biyoloji 1 ,2,3, 4 ,5,6,7,8,9 dahil olmak üzere bir dizi farklı disipline yaygın olarak yararlı olduğukanıtlanmıştır. . Bu tahribatsız görüntüleme yöntemleri arasında, X-ışını tabanlı platformlar, özellikle yüksek enerjili X ışınlarının görünür ışık dalgalarına kıyasla çok farklı numune türlerine ve malzemelere minimum saçılma ile nüfuz edebilmesi nedeniyle yararlıdır. Bilgisayarlı Tomografi (BT), Mikro bilgisayarlı Tomografi (μ-CT), Nanocomputed Tomografi (Nano-CT) ve Synchrotron Mikrotomografisi, milimetreden mikrona kadar değişen örneklerin X-ışını tabanlı görüntüleme için birincil teknolojiler olarak ortaya çıkmıştır, milimetre ila mikron altı çözünürlük yetenekleri10,11,12,13,14.
Bu platformlar, numune boyutunu ve çözünürlüğünü dengelemek için tasarımlarında, X-ışını geometrilerinde ve bileşenlerinde farklılık gösterse de, hepsi görüntü yakalama için aynı temel ilkeye dayanır: nesnenin içinden geçen ve bir dedektör tarafından yakalanan bir X-ışın kaynağı. Nesne içindeki farklı yoğunluklardan geçerken X-ışını ışınının diferansiyel zayıflaması görüntü kontrastı oluşturur. 3B veriler, numune veya dedektör döndürülerek, daha sonra algoritmalar kullanılarak yeniden yapılandırılan bir dizi 2B projeksiyon görüntüsü toplanarak x,y,z15'teçözünürlüğü izotropik olan 3B bilgileri içeren tomogramlara toplanır. Görüntülenmekte olan nesneye X ışınları yansıtmak için koni ışını X-ışını geometrisi kullanan birçok tezgah üstü μ-CT tarayıcı için, Feldkamp algoritması nesneyi en az hatayla doğru bir şekilde yeniden oluşturmak için kullanılır16.
Belirli bir platformun çözünürlüğü öncelikle X-ışını ışınının boyutu (spot boyutu), tarayıcı geometrisi (nesneden X-ışını kaynağına uzaklık), dedektördeki piksellerin boyutu ve kullanılan yeniden yapılandırma algoritması gibi sistem parametrelerine göre belirlenir. Tarayıcı titreşimleri, X-ışını ışını dalgalanmaları, numune hareketi ve malzeme tipi veya nesneyi görselleştirmek için kullanılan kimyasal leke gibi ek faktörler de gerçek dünya görüntüleme çeşnileri altında mekansal çözünürlüğü önemli ölçüde etkileyebilir15.
Biyomedikal uygulamalar için BT ve μ-CT anatomi, fizyoloji, gelişim ve hastalık mekanizmaları anlayışımızı geliştirmede kilit rol oynamış, hem insan hasta tanıları için bir araç hem de model organizmalar için preklinik görüntüleme platformu olarak hizmet vermektedir17,18. Örneğin, amacı fare genomundaki her genin işlevini tanımlamak olan Mouse International Phenotyping Konsorsiyumu, fenotipleme boru hattı19'unbir parçası olarak μ-CT kullanır. Sonuçları, gelişim ve hastalık süreçlerinde yer alan genleri anlamak için kritik öneme sahipken, fare anatomisi ve gelişimi için bir atlas görevi degörür 20. Zebra balıkları ve sıçanlar gibi diğer model organizmalar da, bir dizi gen mutantının tüm hayvan fenotiplemesini gerçekleştirmek için μ-CT kullanımını tamamen benimsemiş17,21,22,23.
Tüm hayvan görüntülemeyi model organizmalarla birleştirmenin avantajı, belirli bir biyolojik süreç için gen fonksiyonunun mekanistik bir anlayışının tam olarak araştırılabilmesidir. Bu, iyi karakterize edilmiş genomlar ve farklı gelişimsel zaman noktalarında, belirli dokularda, bireysel hücrelerde ve hatta hücre altı organellerde gen fonksiyonunun hassas bir şekilde manipüle olmasına izin veren model organizmalarda bulunan birçok genetik araç nedeniyle mümkündür. Bunlar UAS/GAL4 sistemi (ve birçok türevi), CRISPR/Cas9 ve RNAi24 , 25,26gibi ikili ifade sistemlerini içerir. Bu genetik araçlar elektron mikroskopisi, ışık mikroskopisi (floresan ve floresan olmayan) ve μ-CT gibi tüm hayvan görüntülemeden oluşan güçlü bir görüntüleme boru hattı ile birlikte kullanıldığında, moleküllerin, hücrelerin, dokuların, organların ve tüm organizmanın kapsamlı bir değerlendirmesi elde edilebilir ve bu da gen fonksiyonunun çok daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Bu protokol, sayısız genetik aracı çok sayıda moleküler mekanizmanın aydınlatılmasına yardımcı olan memeli olmayan model organizma Drosophila melanogaster'da μ-CT kullanımına odaklanmaktadır26,27. Model olmayan böcekler1 , 28 ,29,30,31,32'deki önceki protokollerden benimsendi ve bu hayvanda kullanımı için standartlaştırılmış bir protokol oluşturmak için Drosophila'daki önceki μ-CT çalışmalarından yola çıktı33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Ticari olarak kullanılabilen tarayıcılar kullanılarak fly μ-CT veri kümelerinin başarılı bir şekilde numune hazırlanması, görüntülenmesi ve analizi için adımlar özetlenmiştir. Bu protokol ile, sineğin tüm gelişim aşamaları taksonomi, anatomi, gelişim, fizyoloji ve hastalık dahil olmak üzere hem tanımlayıcı hem de hipotez testi çalışmaları için yüksek çözünürlükte görselleştirilebilir27. Bu protokol, μ-CT ile görselleştirmeyi geliştirmek için görüntü kontrastı için kimyasal boyama gerektiren hemen hemen her böcek ve hatta canlı olmayan malzemeleri görüntülemek için de yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>100% Ethanol</td><td></td><td></td><td>For critical point drying</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td>For animal fixation</td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td></td><td></td><td>Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)</td></tr><tr><td>Dragonfly Software</td><td>Object Research Systems</td><td></td><td>For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>For microfuge tubes</td></tr><tr><td>Image Analysis Workstation</td><td></td><td></td><td>Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering</td></tr><tr><td>Iodine Solution (I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;KI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SI86-1</td><td>For staining</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1172</td><td>Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 &amp;micro;m pixel size.</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td>For poking hole in cuticle</td></tr><tr><td>NRecon Image Reconstruction Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry</td></tr><tr><td>P10 pipet tips</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-120</td><td>Sample mounting</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Resarch Products International</td><td>P32060-4000.0</td><td>Dilute to 1X with water before use</td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25g</td><td>For staining</td></tr><tr><td>Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>For Minutien Pins</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Research Products International</td><td>111036</td><td>To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)</td></tr><tr><td>X-Ray Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 Versa</td><td>Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD&amp;trade;)</td></tr></tbody></table>

whole animal imaging of drosophila melanogaster using microcomputed tomography

Biyomedikal görüntüleme araçları, genlerden organizmalara kadar mekansal ölçeklerde moleküler mekanizmaların araştırılmasına izin vermektedir. İyi karakterize edilmiş bir model organizma olan Drosophila melanogaster, hücre ve doku düzeyinde gen fonksiyonunu anlamak için ışık ve elektron mikroskopisi kullanımından yararlanmıştır. Tüm bozulmamış organizma düzeyinde gen fonksiyonunun anlaşılmasını sağlayan görüntüleme platformlarının uygulanması, genetik mekanizmalar hakkındaki bilgimizi daha da artıracaktır. Burada, mikro bilgisayarlı tomografi (μ-BT) kullanarak Drosophila'yı herhangi bir gelişim aşamasında görselleştirmek için gereken adımları özetleyen bir hayvan görüntüleme yöntemi sunulmaktadır. μ-CT'nin avantajları arasında, doku diseksiyonu veya temizleme yöntemlerine gerek kalmadan mikron düzeyinde çözünürlükte doğru 3D bilgi üretmek için piyasada bulunan enstrümantasyon ve minimum uygulamalı zaman bulunur. Görüntü analizi ve 3D işlemeyi hızlandıran yazılımlarla eşleştirilmiş, hem tanımlayıcı hem de hipotez test çalışmaları için gelişim, fizyoloji ve anatomi mekanizmalarını daha iyi anlamak için herhangi bir doku veya organ sisteminin ayrıntılı morfometrik analizi yapılabilir. Elektron mikroskopisi, ışık mikroskopisi ve μ-CT kullanımını içeren bir görüntüleme iş akışı kullanılarak, gen fonksiyonunun kapsamlı bir değerlendirmesi yapılabilir, böylece bu güçlü model organizmanın yararlılığı daha da arttırılabilir.

Şekil 2'de bir embriyonun, 3rd instar larvalarının, faz yetişkin aşamasındaki (P7) pupaların ve ticari bir tezgah üstü tarayıcı kullanılarak iyotla boyanmış ve suda nemlendirilmiş yetişkin bir dişi sineğin görüntüleri gösterilmiştir. Hassas dokunun mükemmel korunması ve hatta boyanmaları belirgindir, bu da tüm ana organların kolayca tanımlanmasını ve morfometrik analiz ve 3D görselleştirme için kullanılmasını sağlar.
Tipik olarak, numunenin daha az projeksiyon görüntüsü elde eden taramalar, daha fazla projeksiyon görüntüsü elde eden taramalardan daha düşük çözünürlük sağlar ve takas tarama için harcanan zamandır. Tarama süreleri enstrümana ve diğer tarama parametrelerine göre değişse de, birkaç yüz projeksiyon (~3 μm görüntü piksel boyutu) elde eden taramalar numune başına yaklaşık 30 dakika süre alırken, binlerce projeksiyon görüntüsünden (700 nm-1,25 μm görüntü piksel boyutu) oluşan taramalar 8-16 saat sürebilir. Şekil 3'tehem 'yavaş' (binlerce projeksiyon) hem de 'hızlı' (yüzlerce projeksiyon) tarama modunda çekilen aynı yetişkin sinek başlığının karşılaştırması gösterilmiştir. Daha da önemlisi, morfometrik analizler 'yavaş' ve 'hızlı' taramalar arasında farklılık gösterir (Şekil 3C)40. Bu nedenle görüntüleme boru hattımız, morfometrik analiz için yeterince büyük bir örnek boyutu oluşturmak için hızlı taramalar ve daha yüksek çözünürlükte morfolojik veya anatomik kusurları görselleştirmek için yavaş taramalar kullanır. Yazılımı kullanarak (Adım 7), ilgi çekici herhangi bir doku veya organ sistemi bölümlerek morfometrik analiz için kullanılabilir ve film yapımcısı (Film 1) kullanılarak 3D olarak görselleştirilebilir.
Şekil 4, PTA ile boyanmış sinek karnının bir örneğini gösterir ve görüntülenmiş hidratlı (su) veya bir X-ışını mikroskobundaki (Malzeme Tablosu) kritik nokta kurutmasını (CPD)takip eder. PTA'nın bir kombinasyonu ve bu platformun yetenekleri tarafından sağlanan ayrıntı, bu görüntülerde kolayca belirgindir, böylece testislerdeki midgut ve sperm demetlerinin bireysel epitel hücreleri kolayca çözülür. CPD görüntüsü hidratlı örneğe kıyasla marjinal olarak artmış çözünürlük gösterirken, hassas dokuların (kütikül yakınındaki yağ hücreleri gibi) ultrayapısının daha iyi korunması hydrated örneklerle elde edilir (Film 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> Şekil 1: μ-CT için tarayıcı tasarımına ve örnek montajına genel bakış. (A) Ticari tezgah üstü μ-CT tarayıcı. (B) Tarayıcının içini görüntüleyin. X-ışını kaynağı (sağda), dönen bir aşamada (sarı ok) bulunan numuneden geçen X-Ray'ler yayar. Bu X ışınlarının zayıflaması, numuneden geçerken ve X ışınlarını fotonlara dönüştüren bir scintillation ekranından ve standart bir CCD kameradan (solda) oluşan dedektöre geçerken görüntü kontrastı oluşturur. (C) Suda hidratlı görüntüleme için yetişkin bir meyve sineği monte etmek. Pipet ucu ile pirinç tutucu arasındaki bağlantı noktaları, sızıntıyı ve tarayıcının potansiyel hasarını önlemek için parafin filmine sarılır. Sahne aynası da vurgulanır. Pipet ucunun biraz eksen dışı konumlandırıldığını ve bu da son rekonstrüksiyonda daha uzun bir tarama süresine ve daha az çözünürlüğe yol açtığını unutmayın. (D) Yetişkin bir dişi sineğin tek bir 2D projeksiyon görüntüsü; bu projeksiyonların yüz ila binlercesi dönme ekseni boyunca bir tarama sırasında elde edilir ve izotropik çözünürlük ve doğru 3D bilgiler içeren tomogramlar oluşturmak için yeniden yapılandırma için kullanılır. Ölçek Çubukları (C) = 2 mm. P, Posterior; V, Ventral. Bu rakam Schoborg ve ark.40'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> Şekil 2: Tüm Drosophila melanogaster yaşam döngüsü aşamaları, μ-CT tarafından görüntülenmiştir. İyotla boyanmış ve suda nemlendirilmiş görüntüler. Gösterilen tek bir 2D dilimdir. (A) Gastrülasyonun erken aşamalarını tamamlamış bir embriyo (yıldız). (B) Üçüncü bir başlangıç larvası. (C) Metamorfoz sırasında bir P7 faz yetişkin. (D) Yetişkin bir kadın. Çeşitli organlar vurgulanır: BWM, vücut duvarı kasları; Br, beyin; Cd, cardia; Cr, kırpma; DLM'ler, dorsal boyuna kaslar; DVM, dorsal ventral kaslar; E-AD, göz antenli disk; Em, embriyo; FB, yağ gövdeleri; FBC'ler, yağ vücut hücreleri; H, kalp; Hg, arka ayak; La, lamina; L, bacak; Mg, midgut; OL, beyin optik lob; Ov, ovipositor; PC, pupal manikül; SG, tükürük bezleri; VNC, ventral sinir kordonu; W, kanat; WD, kanat diski. Ölçek Çubukları (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsal; A, Ön; L, sola. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Kamera Piksel Boyutu (μm): (A-D) 11.6. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> Şekil 3: Tarama parametreleri ve görüntü çözünürlüğü morfometrik analizleri değiştirmez. Yetişkin kafası hem (A, A') 'hızlı' tarayıcı ayarları (yüzlerce projeksiyon) ve (B, B') 'yavaş' tarayıcı ayarları (binlerce projeksiyon) kullanılarak tarandı. Beyin sarı ile özetlenmiştir. (C) Yavaş ve hızlı taramalardan beyin hacmi ölçümleri. Vurgulanan yapılar: AL; anten lob; CB, merkezi beyin; FB, fan şeklinde gövde; FCS, yağ hücreleri; La, lamina; Lo, lobula; LoP, lobula plaka; Ben, medulla; Tekrar, retina. n = 5, Welch'in t testi. ns = önemli değil. Ölçek çubukları = 100 μm. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A) 44.4, (B) 36.5. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A) 348 (B) 350. Kamera Piksel Boyutu (μm): (A-B) 11.6. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A) 2.95, (B) 1.2. Bu rakam Schoborg ve ark.40'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> Şekil 4: Drosophila melanogaster karın X-ışını Mikroskopisi ile görüntülenmiştir. Karınlar % 0.5 PTA ile boyandı ve görüntülenmiş hidratlı (su) veya kritik nokta kuruması (CPD) takip edildi. (A) Kritik Nokta Kurutulmuş karın, YZ perspektifinden ve (A') XZ perspektifinden gösterilmiştir. (B) YZ perspektifinden ve (B') XZ perspektifinden gösterilen hidratlı karın. Çeşitli organlar vurgulanır: FC, yağ hücreleri; Hg, arka ayak; Mg, Midgut; SP, Sperm Pompası; Te, Testis. Ölçek Çubukları (A) = 250 μm. D, Dorsal; A, Ön; L, sola. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A) 6.7, (B) 7. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A) 28 (B) 29,5. Amaç: (A-B) 4X. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A-B) 0.65. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Film 1: Dragonfly'daki Movie Maker kullanılarak 3D olarak işlenen üçüncü bir instar larva. Vurgulanan organlar arasında beyin (sarı), göz-antenli imaginal diskler (kırmızı), yağ gövdesi (mavi) ve vücut duvarı kasları (yeşil) bulunur. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Film 2: Suda görüntülenmiş örneklerin karşılaştırılması veya kritik nokta kurutmayı takip edin. %0,5 PTA ile lekelenmiş karınlar gösterilir. Her iki karın da aynı görüntü piksel boyutu ayarlarıyla (0,65 μm) tarandı. Bir dizi 2D dilim, sırt yüzeyinden başlayıp karnın ventral yüzeyinde biten bir 'Z-stack' formatında (YZ) gösterilir. Vurgulanan organlar: FC, yağ hücreleri; Mg, Midgut; SP, Sperm Pompası; Te, Testis. Tarama parametreleri: Kaynaktan Numuneye Mesafe (mm): (A) 6.7, (B) 7. Kaynaktan Kameraya Uzaklık (mm): (A) 28 (B) 29,5. Amaç: (A-B) 4X. Görüntü Piksel Boyutu (μm): (A-B) 0.65. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography at JoVE.com

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak gelişimin herhangi bir aşamasında bozulmamış Drosophila melanogaster'ın görselleştirilmesine izin veren bir protokol sunulmaktadır.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

4.8K Görüntüleme.  University of Wyoming. Mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak gelişimin herhangi bir aşamasında bozulmamış Drosophila melanogaster'ın görselleştirilmesine izin veren bir protokol sunulmaktadır.

Video: Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Biyoloji

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Gelişim Biyolojisi

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Katı, sabit ve lekeli, genel olarak, milimetre ölçekli örnekler için bölüm ücretsiz 3D Histoloji mikro bilgisayarlı tomografi tarafından katıştırma

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Biyomühendislik

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Nörobilim

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler