Nada disso teria sido possível sem o apoio de Nasser Rusan. Gostaria de agradecer a H. Doug Morris, Danielle Donahue e Brenda Klaunberg do NIH Mouse Imaging Facility e Ben Ache da Micro Fotônica pelo treinamento e discussão útil. Agradeço também a Mansoureh Norouzi Rad de Zeiss por escanear amostras de abdômen no Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith e Rachel Ng também ajudaram na varredura. Mike Marsh, da Object Research Systems, forneceu suporte técnico dragonfly. Também sou grato pelo apoio do National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) e start up funds da Universidade de Wyoming. Agradeço também aos revisores anônimos por suas sugestões e comentários úteis.

1. Seleção de amostras e preparação de cutículas
<ol><li>Escolha o ponto de tempo de desenvolvimento adequado (embrião, larva, pupa ou adulto) para imagem.<ol>
<li>Para os estágios embrionários, as fêmeas da gaiola em pratos de ágar de suco de uva manchados com pasta de levedura e coletam ovos a cada 30-60 min. Deixe esses embriões se desenvolverem a 25 °C até que o estágio adequado seja alcançado.</li>
		<li>Para estágios larvais, colete primeiro e segundo instars de experimentos cronometrados de coleta de embriões. Escolha diretamente 3estrelas errantes do lado do frasco de comida em condições não lotadas.</li>
		<li>Para o tempo pupal, colete pré-pupas brancas (espirros invertidos) e anote o momento em que a cutícula começa a dourar. Os animais progredirão através de 15 estágios de desenvolvimento pupal em momentos definidos após o browning da cutícula e podem ser coletados emconformidade com 42.</li>
		<li>Coletar adultos como virgens após o fechamento e permitir envelhecer em um frasco de alimentos por um período necessário de tempo (por exemplo, 5 dias para o desenvolvimento completo do intestino).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira 5-50 animais para um tubo de microcentrifus de 1,5 mL contendo 1 mL de 0,5% Triton X-100 em 1x Salina Tamponada fosfato (0,5% PBST). Enquanto toca o tubo periodicamente no topo do banco, incuba por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) para auxiliar na remoção do revestimento hidrofóbico e permitir que os animais fiquem totalmente submersos.<ol>
<li>Para estágios embrionários, larvais e pupais, prendam o desenvolvimento adicionais colocando o tubo em um bloco de calor definido para 100 °C para 20 s seguido de resfriamento em RT por 5 min. NOTA: Os animais também podem ser congelados em nitrogênio líquido37.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fixação e coloração
<ol><li>Remova 0,5% PBST e adicione 1 mL da Solução bouin. Tubo de torneira para garantir que os animais estejam totalmente submersos. ATENÇÃO: A Solução de Bouin contém formaldeído. Pode causar toxicidade aguda à pele e aos olhos se derramado e pode ser fatal se engolido. Use luvas, óculos de segurança e um jaleco ao manusear. NOTA: Técnicas adicionais de fixação também podem ser empregadas, como o uso de etanol. Os méritos de outros fixativos são descritos detalhadamente no ref.1,30.<ol>
<li>Para embriões e amostras adultas, incubar no banco por 16-20 h na RT.</li>
		<li>Para amostras de larvas e pupal, fixar animais por 2 h na RT. Descarte a solução de Bouin e lave com 1x PBS por 5 minutos três vezes. Transfira para um prato de dissecação multi-bem contendo 1x PBS e use um pequeno pino minutien preso a um suporte para fazer um orifício na cutícula anterior e posterior, tomando cuidado para não interromper nenhum tecido mole subjacente.</li>
		<li>Transfira amostras de larvas e pupal de volta para um tubo de microfuge e adicione 1 mL de solução fresca de Bouin. Incubar no banco por 24 h na RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova a solução de Bouin e lave a amostra por 30 min com 1 mL de tampão de lavagem μ-CT (0,1 M Na2HPO4, 1,8% sacarose) ou 1x PBS três vezes.</li>
	<li>Adicione 1 mL da solução de coloração apropriada e incubar no banco por 2-7 dias. NOTA: A escolha da mancha dependerá de muitos fatores, mas geralmente é um equilíbrio entre penetração, tempo de incubação e resolução. Em geral, o ácido fosfotungstic (PTA) fornece contraste superior e resolução de tecido mole, mas requer interrupção mecânica da cutícula e tempos de incubação mais longos. Os méritos de diferentes tipos de manchas são descritos detalhadamente no ref.1.<ol>
<li>Para coloração de iodo, use 1 mL de 0,1 N I2KI (Solução Lugol). Incubar por 2 dias. Não é necessário mais interrupções da cutícula adulta.</li>
		<li>Para coloração de ácido fosfotungstic (PTA), utilize 1 mL de uma solução de 0,5% (w/v) diluída em água. Interrompa a cutícula adulta, seja removendo as partes bucais ou furando o tórax ou cutícula abdominal com um pequeno pino minutien preso a um suporte. Incubar por 5-7 dias, ou mais se a coloração do tecido parecer não homogênea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave com 1 mL de água ultrauso ou 1x PBS por 30 min. Repita o passo de lavagem. Armazene animais na RT em água ultrauso ou 1x PBS por até um mês.</li>
	<li>Se os animais forem escaneados enquanto hidratados, proceda diretamente à seção 4. Se for necessária uma preservação mais longa da amostra, proceda à seção 3 do protocolo.</li>
</ol>3. Secagem de pontos críticos (Opcional)
<ol><li>Realizar uma série de desidratação de etanol (EtOH) na amostra: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Adicione 1 mL da solução EtOH e incubar no banco por 1h para cada concentração na ordem indicada.</li>
	<li>Após o último mergulho 100% EtOH, substitua por etoh fresco 100% e deixe a amostra incubar no banco durante a noite.</li>
	<li>Realize a secagem de pontos críticos das amostras seguindo as instruções do fabricante. NOTA: As instalações de microscopia eletrônica geralmente possuem uma máquina de secagem de ponto crítico (ver Tabela de Materiais) que realizará a secagem da amostra após a desidratação do EtOH.</li>
</ol>4. Montagem da amostra
<ol><li>Para amostras secas de ponto crítico, amostras de cola quente em um pino de inseto ou outro suporte projetado para caber dentro do mandril do estágio rotativo ou colocá-lo em um tubo capilar de plástico ou vidro (~1,0-1,25 mm de diâmetro interno).</li>
	<li>Para amostras hidratadas, encha uma ponta de pipeta P10 com água e fixe a extremidade estreita por vedação térmica ou filme de parafina para evitar vazamentos. ATENÇÃO: Certifique-se de embrulhar as conexões com força para que a água não vaze no scanner e cause danos.<ol>
<li>Transfira um único espécime para a ponta da pipeta usando fórceps. Usando um objeto longo e esguio, como uma agulha de 20 G embotada ou outra ponta de pipeta, empurre cuidadosamente o espécime pela ponta até que ele apenas entre em contato com a parede da ponta da tubulação para mantê-lo no lugar.</li>
		<li>Cubra a abertura da ponta da pipeta com filme de parafina para evitar a evaporação da água durante longos exames.</li>
		<li>Monte a pipeta P10 usando um suporte projetado para caber dentro do mandril do estágio rotativo(Figura 1A-C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Digitalização
<ol><li>Realize todas as calibrações necessárias da máquina antes da imagem durante o dia. NOTA: Estes variam de acordo com o fabricante e é recomendável consultar um especialista em aplicação para determinar as etapas adequadas. Consulte a Tabela de Materiais para obter informações específicas sobre a configuração e o software utilizados neste protocolo. Geralmente, calibrações como um alinhamento do eixo de estágio para remover qualquer 'oscilação' associada ao mandril estar fora do eixo em relação ao estágio rotativo e realizar correções de campo plano para garantir intensidades uniformes de pixel de fundo na câmera fornecem condições ideais de imagem para a melhor resolução e conjuntos de dados que são comparáveis em várias varreduras.</li>
	<li>Abra a porta do scanner para ter acesso ao mandril do estágio rotativo clicando no ícone 'Open Door' no canto superior esquerdo do software. Fixar a amostra apertando a coleira ao redor da base do suporte da amostra. NOTA: Use pressão suave ao anexar a amostra ao mandril rotativo para manter o alinhamento do scanner.</li>
	<li>Defina parâmetros de digitalização no software que controla o scanner para uma resolução e contraste ideais. NOTA: Estes precisarão ser determinados empiricamente, pois a fonte de raios-X, a câmera/detector e a geometria de cada scanner variam de acordo com o fabricante. Informações adicionais para a seleção dos melhores parâmetros também podem ser encontradas aqui43,bem como do especialista em aplicação do fabricante.<ol>
<li>Abra o controle de energia de fonte de raios-X (Opções | Fonte de raio-X). Use as barras de controle deslizante para definir tensão de raios-X a 30-40 kV e corrente de 100-110 μA para produzir um feixe de raios-X com 3-4W de potência e um pequeno tamanho de ponto para maior resolução.</li>
		<li>Use a caixa de diálogo Modos de Aquisição (Opções | Modos de aquisição) para definir o tempo de exposição da câmera para 500-800 ms.</li>
		<li>Use a barra de controle deslizante localizada ao lado do ícone da lupa na parte inferior do software para definir o tamanho do pixel de imagem desejado (~700 nm a 4 μm), dependendo das configurações da câmera e da posição. Isso determina o número de imagens de projeção adquiridas durante a varredura, com mais projeções levando a uma resolução aprimorada, mas tempos de varredura mais longos (ver Resultados Representativos).</li>
		<li>Clique e arraste a barra de controle deslizante localizada ao lado da seta giratória na parte inferior do software para mover a amostra ao longo de seu caminho de rotação de 360°. Certifique-se de que a amostra permaneça dentro do campo de visão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clique no ícone'Iniciar aquisição'(ícone de seta de círculo azul) na parte superior do software. Uma caixa de diálogo aparece que permite que parâmetros adicionais de digitalização sejam definidos e a pasta de arquivo e saída onde a digitalização será salva para ser nomeada.<ol>
<li>Defina o movimento aleatório para 10 e média de 4-6 quadros. A etapa de rotação é calculada automaticamente dependendo das configurações da câmera utilizadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Comece a digitalizar clicando em 'OK' na caixa de diálogo Aquisição. Uma segunda caixa de diálogo da barra de progresso aparece que mostra o tempo de varredura. O scanner agora adquirirá uma série de imagens de projeção (Figura 1D) da amostra ao longo do caminho de rotação e não precisa ser monitorado.</li>
</ol>6. Reconstrução
<ol><li>Para gerar os tomogramas, realize a reconstrução da imagem usando as imagens de projeção. NOTA: Enquanto quase toda a reconstrução de imagens dos scanners de geometria do feixe de cone depende do algoritmo Feldkamp16,os parâmetros individuais variam dependendo da implementação do software e devem ser determinados empiricamente. As seguintes configurações, específicas para um software comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais)podem ser usadas como guia. Parâmetros como compensação de desalinhamento, redução de artefatos de anel e correção de endurecimento de feixe (0% para a maioria das amostras de mosca) são realizados de forma iterativa para escolher os melhores valores para a reconstrução final. Para usuários avançados que gostariam de mais controle sobre o processo de reconstrução, consulte a interface MATLAB aqui44.</li>
	<li>Realize um alinhamento inicial de imagem utilizando um algoritmo de correção de turno baseado em varreduras de referência45 (Ações | Alinhamento x/Y com uma varredura de referência).
</li>
	<li>Ajuste fino cada parâmetro de reconstrução(Iniciar | Ajuste fino). Isso ativa uma caixa de diálogo 'Ajuste fino do parâmetro'.<ol>
<li>Ajuste bem o alinhamento clicando em 'Next' to 'Post-Alignment'. Defina o número de iterações para cinco e o parâmetro passo para 1.0. Clique no botão Iniciar para gerar uma série de visualizações. Selecione a imagem que está corretamente alinhada. NOTA: Uma imagem adequadamente alinhada não será embaçada ou exibirá artefatos de "cisalhamento" onde uma estrutura contínua (como a cutícula) aparece dividida.</li>
		<li>Ajuste bem a redução do artefato do anel clicando ao lado dele. Defina o número de iterações para cinco e o parâmetro passo para 1.0. Clique no botão Iniciar para gerar uma série de visualizações. Selecione a imagem que contém o menor número de anéis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez otimizados os parâmetros acima para dar a melhor imagem, certifique-se de que os valores selecionados estejam devidamente representados na guia Configurações(Configurações).
</li>
	<li>Ajuste qualquer brilho final e valores de contraste usando o histograma, parâmetros de arquivo, como profundidade e tipo de bit, e utilize uma Região de Interesse (ROI) abrangendo apenas as estruturas de interesse (por exemplo, somente mosca ou cabeça inteira) para reduzir o tempo computacional(Saída).</li>
	<li>Comece a reconstrução (Comece | Comece). Se forem necessárias várias reconstruções, adicione a imagem atual ao gerenciador de lotes(Iniciar | Adicione ao lote) e repita as etapas 6.2-6.5 para as demais imagens.</li>
</ol>7. Análise de imagem
<ol><li>Visualize os tomogramas em duas e três dimensões e realize uma análise morfométrica adicional com freeware ou software comercial. NOTA: Os detalhes do software utilizado neste protocolo estão disponíveis na Tabela de Materiais. Outros pacotes de software capazes de avaliar conjuntos de dados μ-CT incluem opções de freeware como FIJI46,Seg3D (www.seg3D.org)47e ITK-SNAP48, além de software comercial (por exemplo, AMIRA). Outras aplicações que empregam algoritmos baseados em aprendizado de máquina para semi automatizar o processo de segmentação podem ajudar a acelerar os fluxos de trabalho e reduzir o viés humano (por exemplo, Biomedisa49).</li>
	<li>Importar o arquivo tomograma para o software (Arquivo | Importar arquivos de imagem). Os metadados associados ao arquivo devem ser carregados automaticamente na janela, mas também podem ser definidos manualmente para corresponder às propriedades da imagem.</li>
	<li>Para segmentar uma estrutura de interesse, clique na guia Segmento no lado esquerdo da tela. Criar uma nova Região de Interesse (ROI) (| Básica Novo), dê-lhe um nome e selecione uma cor apropriada.</li>
	<li>Defina o intervalo de limiar que engloba a estrutura de interesse (Range | Definir intervalo) usando a barra de controle deslizante.</li>
	<li>Selecione um modo de ferramenta de pintor de ROI 2D ou 3D apropriado(ROI Painter | Opção paintbrush).
</li>
	<li>Pintar uma área definida pelo limiar; pressione e segure a tecla Ctrl enquanto segura a tecla do mouse esquerdo. Para remover uma área, pressione e segure a tecla Shift enquanto segura a chave do mouse esquerdo. NOTA: Para alterar o tamanho do pincel circular ou quadrado, basta rolar a roda do mouse enquanto segura as teclas Ctrl ou Shift.</li>
	<li>Continue a pintar a estrutura de interesse durante todo o seu volume Z.</li>
	<li>Converta o ROI em uma malha(exportação | Para um | de malha Normal).
</li>
	<li>Destaque a sobreposição de malha clicando nela no painel Propriedades e Configurações de Dados no canto superior direito.</li>
	<li>Suavize a malha usando um número apropriado de iterações(Malha Lisa | Iterações). NOTA: Use o mesmo valor de iteração de suavização da malha para todas as imagens a serem comparadas.</li>
	<li>Certifique-se de que as medidas do ROI de malha (Superfície, Volume e Diâmetro do Feret) sejam exibidas no painel Informações no lado direito da tela para análise morfométrica básica. Análises adicionais podem ser realizadas utilizando o Módulo de Análise de Objetos.</li>
	<li>Renderize o objeto de malha e toda a imagem do tomograma e visualize em 3D. Use o Movie Maker embutido para gerar um vídeo do objeto (Mouse Direito Clique | Show Movie Maker) usando quadros individuais do espectador(Adicionar chave). NOTA: Vários aprimoramentos visuais também podem ser aplicados ao filme usando a guia de efeitos visuais no painel direito para destacar certas características, etc.</li>
	<li>Exporte o vídeo para visualização usando o botão Animação de Exportação no Criador de Filmes.</li>
</ol>

O autor declara não ter interesses concorrentes ou financeiros.

A visualização intacta de melanogaster de Drosophila intacta em todas as fases de desenvolvimento tem permanecido um desafio, principalmente devido à incompatibilidade da microscopia leve com a cutícula espessa e pigmentada encontrada neste animal. Enquanto outros métodos inteiros de imagem animal, como ressonância magnética (RM), Tomografia de Coerência Óptica (OUT) e ultramicroscopia aliada à limpeza tecidual, juntamente com a limpeza de tecidos, têm sido utilizados com sucesso em moscas50,51,52,53,54, μ-CT apresenta uma série de vantagens que o tornam ideal para toda a imagem animal deste organismo13,15,30 . Raios-X penetram facilmente na cutícula pigmentada e seu pequeno comprimento de onda permite imagens submicinas. A rotulagem requer investimento mínimo em produtos químicos amplamente disponíveis e sem habilidades de banco especializadas13. μ-CT scanners também estão disponíveis comercialmente, e os custos são comparáveis às plataformas de microscopia leve, ao mesmo tempo em que são mais atraentes para uma ampla gama de disciplinas (Geologia, Paleontologia, Engenharia, etc.) que também podem se beneficiar de sua disponibilidade em uma instituição. As fontes de raios-X síncrotrons também podem ser usadas para imagens de μ-CT de alta resolução de insetos fixos e vivos31,55,56, mas são menos acessíveis do que os scanners comerciais de bancada.
Este protocolo fornece uma maneira eficiente de obter imagens μ-CT de adultos voadores, pupas, larvas e embriões celularizados. Observe que para muitas das etapas descritas acima, métodos alternativos também podem ser aplicados para preparar amostras para imagens. Outros estudos têm proporcionado uma comparação detalhada das diferentes etapas de fixação, rotulagem e secagem para uso em insetos e os interessados em adotar essa técnica são incentivados a avaliar os méritos de cada abordagem1,4,13,29,30,57. Embora este protocolo seja relativamente simples, algumas sugestões úteis são apresentadas.
Em primeiro lugar, deve-se tomar cuidado ao interromper a cutícula de espécimes intactos, de tal forma que os tecidos moles subjacentes não são significativamente interrompidos. É importante deixar que as fases larval e pupal precoces sejam fixação por 2 horas na solução de Bouin antes de cutucar. Isso endurecerá o tecido e limitará a quantidade de hemoglifo que vai escorrer dos orifícios de cutícula, o que pode alterar a arquitetura dos órgãos. Segmentos corporais individuais (cabeça, tórax e abdômen) do adulto podem ser separados se a estrutura de interesse estiver localizada lá. Recomenda-se usar um bisturi para cortar limpamente esses segmentos em vez de separá-los com fórceps, o que poderia interromper a arquitetura 3D do intestino ou do sistema nervoso central, por exemplo. Quanto ao tempo, os adultos geralmente precisam de apenas 16 horas. para fixação completa, enquanto os estágios larval e pupal precisam de 24 h. Além disso, se a coloração de iodo ou PTA parecer desigual, a amostra pode ser colocada de volta em solução para incubar por mais tempo até que até mesmo a coloração seja alcançada. Por fim, as amostras hidratadas não devem ser colocadas a 4 °C, pois isso parece induzir a formação de bolhas de ar dentro da cavidade corporal após o aquecimento à temperatura ambiente.
Em segundo lugar, a montagem da amostra variará de acordo com o instrumento, o tipo de estágio e se a amostra precisa permanecer hidratada ou foi um ponto crítico seco. Se hidratado, certifique-se de que a amostra não vaze e possivelmente destrua o scanner. Ao montar a amostra dentro de uma ponta de pipeta, certifique-se de empurrar suavemente com um objeto embotado até que os espécimes encontrem leve resistência e não possam se mover. Empurrar muito forte pode levar à deformação da cutícula e defeitos estruturais subjacentes. Além disso, certifique-se de que a amostra está alinhada no suporte o mais próximo possível do eixo de rotação. Qualquer oscilação aumentará os tempos de varredura devido ao campo de visão maior e reduzirá a resolução do tomograma final após a reconstrução.
Em terceiro lugar, as configurações do scanner para aquisição de imagens de projeção também variam de acordo com o instrumento. Para maximizar as capacidades de resolução do scanner, o tamanho da mancha do feixe de raios-X deve ser o menor possível (5-10 μm). Isso pode ser alcançado equilibrando as configurações de tensão de raios-X e correntes de tal forma que a potência total seja de 3-4 W. Com essas configurações e o tempo de exposição adequado na câmera, pode-se alcançar a atenuação adequada do feixe de raios-X pela amostra e o contraste de imagem ideal. O uso de filtros de alumínio ou cobre entre o objeto e a fonte de raios-X pode ser usado para ajustar as configurações ideais de energia de raios-X para o melhor contraste de imagem ou atenuar o feixe suficientemente para fontes mais altas de energia a serem usadas. Quanto à resolução da imagem, isso dependerá de muitas variáveis diferentes, incluindo tipo de mancha, número de imagens de projeção, tamanho do pixel da imagem, posição da câmera, movimento da amostra, vibrações do scanner e parâmetros de reconstrução. Um fantasma padrão de barra (QRM GmbH) contendo marcadores de tamanho conhecidos pode ajudar a avaliar a resolução espacial para um determinado scanner e configuração da câmera.
Também vale a pena avaliar os méritos da imagem de amostras de ponto crítico seco ou hidratado. Sombke et al. realizaram uma avaliação comparativa dos dois métodos e encontraram a secagem de pontos críticos como superior às aplicações μ-CT envolvendo artrópodes30. No entanto, os benefícios das amostras hidratadas são que os animais são submetidos a menos exposição química e mecânica que poderia levar a artefatos quantitativos e morfológicos. Isso também tende a preservar tecidos delicados melhor do que o CPD. No entanto, as amostras hidratadas têm uma vida útil muito menor e devem ser imagens no máximo um mês após a fixação, uma vez que a degradação do tecido e a qualidade da imagem reduzida se tornam óbvias nesse ponto. Além disso, a resolução das amostras hidratadas será ligeiramente menor que uma amostra seca de ponto crítico, pois os raios-X também devem penetrar tanto através de uma ponta de pipeta plástica quanto do líquido circundante (água ou tampão). Ponto Crítico As amostras secas podem ser preservadas por períodos muito mais longos de tempo, especialmente quando mantidas em Drierite. Eles também podem ser colocados diretamente no caminho do raio-X, simplesmente colando as asas ou pernas a um pino de inseto e colocando-o no mandril de palco, simplificando o processo de montagem. No entanto, a extensa desidratação do etanol dessas amostras pode levar ao encolhimento tecidual e à perda de arquitetura de tecido delicado, razão pela qual é importante realizar uma série de concentrações crescentes de EtOH para minimizar esses efeitos. No entanto, deve-se notar que todas as formas de tratamento químico, incluindo a fixação de paraformaldeído e até mesmo a coloração de iodo podem causar encolhimento tecidual58,59. Embora nenhum dos métodos forneça medições do "tamanho real do órgão" em uma mosca viva, as medidas morfométricas ainda são válidas quando comparamos animais mutantes e selvagens, desde que as etapas de fixação, coloração e secagem sejam realizadas de forma idêntica para ambos os conjuntos de amostras — de preferência em paralelo.
Em conclusão, μ-CT fornece uma ferramenta de imagem animal útil para Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Muitos outros estudos mostraram o poder dessa tecnologia para entender vários aspectos da taxonomia de insetos, ecologia, fisiologia, desenvolvimento e anatomia que podem ajudar a informar estudos futuros em moscas1,28,30,31,32,55,56,57 . Combinada com as ferramentas de microscopia genética e leve já amplamente utilizadas neste organismo, μ-CT pode se posicionar dentro de um pipeline experimental que permite uma compreensão mais profunda entre genótipo e fenótipo.

Métodos de imagem que permitem a investigação detalhada das estruturas interiores de um objeto sem destruir sua arquitetura 3D global provaram ser amplamente benéficos para uma série de disciplinas diferentes, incluindo física, engenharia, ciência dos materiais, arqueologia, paleontologia, geologia e biologia1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Entre esses métodos de imagem não destrutivos, as plataformas baseadas em raios-X são especialmente úteis devido à capacidade de raios-X de alta energia penetrar em muitos tipos e materiais de amostra diferentes com dispersão mínima em comparação com ondas de luz visíveis. Tomografia computadorizada (TC), Tomografia Microcomputada (μ-CT), Tomografia Nanocomputada (Nano-CT) e Microtomografia Síncrotron surgiram, portanto, como as principais tecnologias para imagens baseadas em raios-X de amostras que variam de medidores a mícrons, com recursos de resolução de milímetros a subcron10,11,12,13,14.
Embora essas plataformas diferem em seu design, geometria de raios-X e componentes para equilibrar o tamanho e a resolução da amostra, todas elas dependem do mesmo princípio básico para captura de imagem: uma fonte de raios-X que viajam através do objeto e são capturados por um detector. Atenuação diferencial do feixe de raios-X à medida que passa por densidades variadas dentro do objeto gera contraste de imagem. Os dados 3D são obtidos girando a amostra ou o detector, coletando uma série de imagens de projeção 2D que são então reconstruídas usando algoritmos em tomogramas contendo informações 3D cuja resolução é isotropic em x,y,z15. Para muitos scanners de μ-CT que utilizam uma geometria de raios-X de feixe de cone para projetar raios-X no objeto que está sendo imageado, o algoritmo Feldkamp é usado para reconstruir o objeto com erros mínimos16.
A resolução de uma determinada plataforma é determinada principalmente por parâmetros do sistema, como o tamanho do feixe de raios-X (tamanho da mancha), geometria do scanner (distância do objeto à fonte de raios-X), tamanho dos pixels no detector e o algoritmo de reconstrução empregado. Fatores adicionais, como vibrações de scanner, flutuações de raios-X, movimento da amostra e tipo de material ou mancha química usada para visualizar o objeto também podem influenciar significativamente a resolução espacial sob condições de imagem do mundo real15.
Para aplicações biomédicas, a Tomografia E μ-CT têm desempenhado um papel fundamental no avanço da compreensão dos mecanismos de anatomia, fisiologia, desenvolvimento e doenças, servindo como ferramenta tanto para diagnósticos de pacientes humanos quanto como plataforma de imagem pré-clínica para organismos modelo17,18. Por exemplo, o Mouse International Phenotyping Consortium, cujo objetivo é identificar a função de cada gene no genoma do camundongo, utiliza μ-CT como parte de seu oleoduto fenotipado19. Seus resultados têm sido fundamentais para a compreensão dos genes envolvidos no desenvolvimento e nos processos de doenças, ao mesmo tempo em que servem como um atlas para anatomia e desenvolvimentode camundongos 20. Outros organismos modelo, como zebrafish e ratos, também adotaram totalmente o uso de μ-CT para a realização de fenotipagem animal inteira de um número de mutantes genéticos17,21,22,23.
A vantagem de combinar imagens animais inteiras com organismos modelo é que uma compreensão mecanicista da função genética para um determinado processo biológico pode ser totalmente explorada. Isso é possível devido aos genomas bem caracterizados e muitas ferramentas genéticas disponíveis em organismos modelo que permitem a manipulação precisa da função genética em pontos de tempo distintos do desenvolvimento, tecidos específicos, células individuais e até organelas subcelulares. Estes incluem sistemas de expressão binária, como o sistema UAS/GAL4 (e seus muitos derivados), CRISPR/Cas9 e RNAi24,25,26. Quando essas ferramentas genéticas são usadas em conjunto com um poderoso pipeline de imagem composto por microscopia eletrônica, microscopia leve (fluorescente e não fluorescente), e imagens animais inteiras como μ-CT, uma avaliação completa de moléculas, células, tecidos, órgãos e todo o organismo pode ser alcançada, permitindo uma compreensão muito mais profunda da função genética.
Este protocolo se concentra no uso de μ-CT no organismo modelo não-mamífero Drosophila melanogaster, cuja miríade de ferramentas genéticas ajudaram a elucidar numerosos mecanismos moleculares26,27. Foi adotado a partir de protocolos anteriores em insetos não-modelo1,28,29,30,31,32, e constrói-se de estudos anteriores μ-CT em Drosophila para estabelecer um protocolo padronizado para seu uso neste animal 33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. As etapas para a preparação, imagem e análise bem-sucedidas dos conjuntos de dados fly μ-CT usando scanners disponíveis comercialmente são delineadas. Com este protocolo, todos os estágios de desenvolvimento da mosca podem ser visualizados em alta resolução para estudos descritivos e testes de hipóteses, incluindo taxonomia, anatomia, desenvolvimento, fisiologia e doença27. Este protocolo também será útil para a imagem de praticamente qualquer inseto e até mesmo materiais não vivos que requerem coloração química para contraste de imagem para melhorar a visualização por μ-CT.

<table><tbody><tr><td>100% Ethanol</td><td></td><td></td><td>For critical point drying</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td>For animal fixation</td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td></td><td></td><td>Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)</td></tr><tr><td>Dragonfly Software</td><td>Object Research Systems</td><td></td><td>For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>For microfuge tubes</td></tr><tr><td>Image Analysis Workstation</td><td></td><td></td><td>Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering</td></tr><tr><td>Iodine Solution (I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;KI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SI86-1</td><td>For staining</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1172</td><td>Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 &amp;micro;m pixel size.</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td>For poking hole in cuticle</td></tr><tr><td>NRecon Image Reconstruction Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry</td></tr><tr><td>P10 pipet tips</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-120</td><td>Sample mounting</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Resarch Products International</td><td>P32060-4000.0</td><td>Dilute to 1X with water before use</td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25g</td><td>For staining</td></tr><tr><td>Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>For Minutien Pins</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Research Products International</td><td>111036</td><td>To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)</td></tr><tr><td>X-Ray Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 Versa</td><td>Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD&amp;trade;)</td></tr></tbody></table>

whole animal imaging of drosophila melanogaster using microcomputed tomography

Ferramentas biomédicas de imagem permitem a investigação de mecanismos moleculares em escalas espaciais, de genes a organismos. Drosophila melanogaster, um organismo modelo bem caracterizado, beneficiou-se do uso de microscopia de luz e elétrons para entender a função genética ao nível das células e tecidos. A aplicação de plataformas de imagem que permitem a compreensão da função genética ao nível de todo o organismo intacto aumentaria ainda mais nosso conhecimento sobre mecanismos genéticos. Aqui é apresentado todo um método de imagem animal que delineia os passos necessários para visualizar a Drosophila em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada (μ-CT). As vantagens do μ-CT incluem instrumentação comercialmente disponível e tempo mínimo de hands-on para produzir informações 3D precisas na resolução de nível de micron sem a necessidade de dissecção ou métodos de compensação de tecidos. Emparelhado com softwares que aceleram a análise de imagem e a renderização 3D, a análise morfométrica detalhada de qualquer tecido ou sistema de órgãos pode ser realizada para entender melhor os mecanismos de desenvolvimento, fisiologia e anatomia para estudos descritivos e testes de hipóteses. Utilizando um fluxo de trabalho de imagem que incorpora o uso de microscopia eletrônica, microscopia leve e μ-CT, uma avaliação minuciosa da função genética pode ser realizada, promovendo assim a utilidade deste poderoso organismo modelo.

A Figura 2 mostra imagens de um embrião, 3ª larva instar, pupae no estágio adulto pharate (P7), e uma mosca fêmea adulta manchada com iodo e imagem hidratada na água usando um scanner de bancada comercial. A excelente preservação e até mesmo a coloração de tecido delicado são aparentes, permitindo que todos os órgãos principais sejam prontamente identificados e utilizados para análise morfométrica e visualização 3D.
Normalmente, varreduras que adquirem menos imagens de projeção da amostra fornecem resolução menor do que as varreduras que adquirem mais imagens de projeção, com o tempo de troca sendo gasto na varredura. Embora os tempos de varredura variem de acordo com o instrumento e outros parâmetros de digitalização, as varreduras que adquirem algumas centenas de projeções (~3 μm tamanho do pixel de imagem) leva cerca de 30 minutos por espécime, enquanto as varreduras que consistem em milhares de imagens de projeção (700 nm-1,25 μm tamanho de pixel de imagem) podem levar de 8-16 h. Uma comparação do mesmo caso de cabeça de mosca adulto tomado tanto no modo de varredura 'lento' (milhares de projeções) quanto "rápido" (centenas de projeções) é mostrado na Figura 3. É importante ressaltar que as análises morfométricas não diferem entre varreduras 'lentas' e 'rápidas'(Figura 3C)40. Nosso pipeline de imagem, portanto, utiliza varreduras rápidas para gerar um tamanho amostral suficientemente grande para análise morfométrica, e varreduras lentas para visualizar quaisquer defeitos morfológicos ou anatômicos em maior resolução. Utilizando o software (Passo 7), qualquer tecido ou sistema de órgão de interesse pode ser segmentado e usado para análise morfométrica e visualizado em 3D usando o cineasta(Filme 1).
A Figura 4 mostra um exemplo do abdômen de mosca manchado com PTA e hidratado (água) ou seguindo a secagem de ponto crítico (CPD) em um microscópio de raios-X (Tabela de Materiais). O detalhe proporcionado por uma combinação do PTA e as capacidades desta plataforma é facilmente evidente nessas imagens, de tal forma que as células epitélios individuais dos feixes de midgut e esperma dentro dos testículos são facilmente resolvidas. Enquanto a imagem do CPD mostra uma resolução marginalmente aumentada em relação à amostra hidratada, uma melhor preservação da ultraestrutura de tecidos delicados (como as células de gordura próximas à cutícula) é alcançada com amostras hidratadas(Filme 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do design do scanner e montagem da amostra para μ-CT. (A) Um scanner comercial de bancada μ-CT. (B) Veja dentro do scanner. A fonte de raios-X (à direita) emite raios-X que passam pela amostra localizada em um estágio rotativo (seta amarela). Atenuação desses raios-X geram contraste de imagem à medida que passam pela amostra e pelo detector, que consiste em uma tela de cintilação que converte raios-X em fótons e uma câmera CCD padrão (esquerda). (C) Montagem de uma mosca de fruta adulta para imagem hidratada na água. Os pontos de conexão entre a ponta da pipeta e o suporte de latão são embrulhados em filme de parafina para evitar vazamentos e danos potenciais ao scanner. O mandril de palco também é destacado. Note que a ponta da pipeta foi posicionada ligeiramente fora do eixo, o que levou a um tempo de varredura mais longo e redução da resolução na reconstrução final. (D) Uma única imagem de projeção 2D de uma mosca fêmea adulta; centenas a milhares dessas projeções são adquiridas durante uma varredura ao longo do eixo de rotação e são usadas para reconstrução para gerar tomogramas contendo resolução isotrópica e informações 3D precisas. Barras de escala (C) = 2 mm. P, Posterior; V, Ventral. Este valor foi modificado de Schoborg et al.40. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> Figura 2: Todos os estágios do ciclo de vida de Drosophila melanogaster, imagens por μ-CT. Amostras manchadas com iodo e imagens hidratadas em água. Mostrado é uma única fatia 2D. (A) Um embrião que completou os estágios iniciais da gastrulação (asterisco). (B) Uma terceira larva instar. (C) Um adulto de pharate P7 durante a metamorfose. (D) Uma fêmea adulta. Vários órgãos são destacados: BWM, músculos da parede corporal; Br, cérebro; Cd, cardíaco; Cr, colheita; DLMs, músculos longitudinais dorsais; DVM, músculos ventral dorsal; E-AD, disco antena dos olhos; Em, embrião; FB, corpos gordos; FBCs, células do corpo de gordura; H, coração; Hg, hindgut; La, lamina; L, perna; Mg, midgut; OL, lobo óptico cerebral; Ov, ovipositor; PC, cutícula pupal; SG, glândulas salivares; VNC, cabo de nervo ventral; W, asa; WD, disco de asa. Barras de escala (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, esquerda. Parâmetros de varredura: Distância da Fonte à Amostra (mm): (A, D) 36,5, (B) 48,8, (C) 40,3. Fonte para Distância da Câmera (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Tamanho do Pixel da câmera (μm): (A-D) 11.6. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> Figura 3: Os parâmetros de varredura e a resolução da imagem não alteram as análises morfométricas. Uma cabeça adulta digitalizou usando as configurações do scanner'A, A' ( A, A') (centenas de projeções) e(B, B)configurações de scanner 'lentas' (milhares de projeções). O cérebro está delineado em amarelo. (C) Medições de volume cerebral a partir de varreduras lentas e rápidas. Estruturas destacadas: AL; lóbulo antenal; CB, cérebro central; FB, corpo em forma de ventilador; FCs, células de gordura; La, lamina; Lo, lobula; LoP, placa de lobula; Eu, medulla; Re, retina. n = 5, teste t de Welch. ns = não significativo. Barras de escala = 100 μm. Parâmetros de varredura: Distância da fonte à amostra (mm): (A) 44,4, (B) 36,5. Fonte à Distância da Câmera (mm): (A) 348 (B) 350. Tamanho do Pixel da câmera (μm): (A-B) 11.6. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A) 2,95, (B) 1.2. Este valor foi modificado de Schoborg et al.40. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> Figura 4: Abdômen de melanogaster de Drosophila, retratado por Microscopia de Raio-X. Os abdômens foram manchados com 0,5% de PTA e hidratado (água) ou seguindo a secagem de ponto crítico (DPC). (A) Ponto Crítico Abdômen seco, mostrado a partir da perspectiva YZ e (A') perspectiva XZ. (B) Abdômen hidratado, mostrado a partir da perspectiva YZ e (B') perspectiva XZ. Vários órgãos são destacados: FC, células de gordura; Hg, hindgut; Mg, Midgut; SP, Bomba de Esperma; Te, Testes. Barras de Escala (A) = 250 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, esquerda. Parâmetros de varredura: Distância da fonte para amostra (mm): (A) 6,7, (B) 7. Fonte à Distância da Câmera (mm): (A) 28 (B) 29,5. Objetivo: (A-B) 4X. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Filme 1: Uma terceira larva instar, renderizada em 3D usando o Cineasta em Dragonfly. Os órgãos destacados incluem o cérebro (amarelo), os discos imagináveis de antena dos olhos (vermelho), o corpo gordo (azul) e os músculos da parede corporal (verde). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este filme.</a>
Filme 2: Comparação de amostras imagens em água ou seguir a secagem de ponto crítico. Abdômens manchados com 0,5% de PTA são mostrados. Ambos os abdômens foram escaneados com configurações idênticas do tamanho do pixel de imagem (0,65 μm). Uma série de fatias 2D são mostradas em um formato 'Z-stack' (YZ) começando na superfície dorsal e terminando na superfície ventral do abdômen. Órgãos destacados: FC, células de gordura; Mg, Midgut; SP, Bomba de Esperma; Te, Testes. Parâmetros de varredura: Distância da fonte para amostra (mm): (A) 6,7, (B) 7. Fonte à Distância da Câmera (mm): (A) 28 (B) 29,5. Objetivo: (A-B) 4X. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este filme.</a>

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Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

É apresentado um protocolo que permite a visualização de melanogaster de Drosophila intacto em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada.

Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

4.8K visualizações.  University of Wyoming. É apresentado um protocolo que permite a visualização de melanogaster de Drosophila intacto em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada.

Vídeo: Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Biologia

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Biologia do Desenvolvimento

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Bioengenharia

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Neurociência

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Preparação e imagem longitudinal do coração Função In Vivo Usando Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto Drosophila revelada pela série-seção elétron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

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