This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer's Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

Drosophila 16 optik görüntüleme OCM Sistemi 1. Hazırlık <ol><li> Bir spektrometre ve OCM sistemi Drosophila kalp atışı çözmek mümkün olacak, böylece en az 80 kare / sn kare hızı sağlayan yüksek hızlı hat tarama kamerayı seçin. </li><li> Drosophila kalp yapısını belirlemek için 2 um eksenel çözünürlük sağlamak için geniş bant ışık kaynağı kullanın. </li><li> Bir yüksek enine çözünürlük elde etmek için bir 10X objektif kullanarak. </li><li> Referans kol ışık ışınını yansıtacak ve örneklerde odak derinliği genişletmek için dairesel bir örnek kol ışık ışınını üretmek için 45 ° çubuk ayna kullanın. </li><li> OCM sistemini kontrol ve ölçümleri gerçekleştirmek için özel bir bilgisayar programı geliştirmek. </li></ol> 2. Drosophila Kültür <ol><li> Standart Fly Gıda Hazırlama <ol><li> Polistiren şişenin içine ~ 5 ml anlık Drosophila formülü koymakBir kağıt oluk yardımı ile tüp. </li><li> düzgün yemek doyurmak için formüle ~ 8 ml su dökün. </li><li> Farklı deneyler için standart sinek gıda farklı takviyeleri ekleyin. Deney 35 ilerleme hızı optogenetic için all trans -retinal (ATR) yemek için hazırlanırken, 100 mM ATR ayıklamak ve gıda 1 mM ATR konsantrasyonunu elde etmek için mi 8 ~ içine su eritmek için bir pipet kullanın. homojen çözelti karıştırıldıktan sonra, formül içine dökün ve yeterince karıştırın. </li><li> Bir mikrodalga fırında 30 saniye boyunca bir kabı ve ısı 15 mi su ile ~ 10,15 karışımı Drosophila obezite ile ilişkili kalp bozuklukları incelemek için 10 mi formül yüksek yağ diyet hazırlamak. Başka bir fincan bazı organik sızma hindistan cevizi yağı koyun ve mikrodalga fırında 90 saniye boyunca ısıtın. </li><li> yeterince gıda ~ 30/100 ve th Hindistan cevizi yağı ağırlık / hacim oranı yapmak için 7.5 ml hindistan cevizi yağı Özü ve hazırlanan formülü ile karıştırınve gıda karışık özü ~ 2 ml tr tüpün dibine koydu. </li><li> orta iyice doyana kadar 1 dakika bekleyin. Drosophila yaşam koşullarını optimize etmek için düz bir yüzeye dikkatlice gıda kompakt. Hazırlanan formül maya 8 taneleri ve pamuk küme ile tüp fiş - 6 ekleyin. </li></ol></li><li> Meyve Sineği Haçlar ve Kültür <ol><li> Hazırlanan standart sinek gıda ile tüp almak ve takılı pamuk çıkarın. Dikkatle tüp (erkek ve dişi) yetişkin uçar aktarmak ve hemen pamuk ile tüp takın. pamuk ve tüpten kaçan sinek önlemek için tüp duvar arasında boşluk olmadığından emin olmak için pamuk kontrol edin. </li><li> çapraz üreme için 25 ° C&#39;de inkübatör meyve sinekleri tutun. Genlerin en aktif ve hücresel proteinler 25 ° C 36-39 sentezlenirler. </li><li> 8 el transferi bir süre sonra inkübatör tüpü dışarı atınDult deneysel kontrol için benzer yaşta yumurta elde etmek için tüp dışarı uçar. </li><li> 8,5 gün 40,41 geliştirme dönemi ile Drosophila gelişimi için standart sıcaklık 25 ° C, kuvöz yumurta kültüre devam edin. Not: Sıcaklık gelişim sürecini (yetişkin yumurta) ve çeşitli genlerin ekspresyon seviyesini etkiler. </li></ol></li></ol> 3. OCM Optik Görüntüleme Sahne <ol><li> Optik Görüntüleme Mount Fly Larva Not: 22, Drosophila kapakları yumurta - birinci instar larvası (L1) için 25 ° C&#39;de 24 saat süredir. İkinci evre larva başka 24 saat sonra ortaya çıkar. en büyük larva formu yaklaşık 24 saat sonra molts Üçüncü dönem larva, olduğunu. larva Yapısal özellikler onların farklı gelişim aşamalarını ayırt etmek için kullanılabilir. İlk instar ve ikinci dönem arasındaki ağızlarının boyutu farklıdır. Ağızİlk evre larva kancalar çok küçük ve ikinci evre larva ağız kanca daha büyüktür ve yapı net iken, küçük siyah noktalar iki çift gibi görünüyorlar. spiracles genellikle ikinci instar ve üçüncü instar tanımlamak için kullanılır. Üçüncü instar için, ön spiracles dallı ederken, ikinci evre larva, ön spiracles clubbed etti. Bir koyu turuncu halka Üçüncü dönem larva posterior spiracles ucunda görünmeye başlayacaktır. <ol><li> Temiz bir mikroskop cam slayt çift taraflı bant bir parça uygulayın. görüntüleme sırasında hava kabarcıklarının neden yansımaları önlemek için bant altında hava kabarcıkları sınırdışı. </li><li> larva aşamasında inkübatör dışarı kültürlü sinekler tüplerin birini almak. </li><li> , Medyada larva tespit temiz bir doku üzerine yumuşak bir fırça ve yer ile medya çıkarın. ıslak, yumuşak bir fırça ile larva yapışmış herhangi bir yiyecek çıkarıp doku üzerinde kurutun. </li><li> cleane taşıGeniş alan mikroskobu objektif mercek altında bir dokuya sinek d. </li><li> sinek net bir görüş bulmak için mikroskop odağı ayarlayın. mikroskopla yapısal özellikleri ile larva sağ gelişim aşamasını belirlemek. </li><li> yumuşak bir fırça kullanarak sinek yerleştirin. Vücut düz sırt yan cam slayt monte hazırlanmak için yukarı bakacak şekilde dorsal yüzü olduğundan emin olun. Mikroskop altında bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Larva bant üzerine monte etmeden önce tamamen kuru olduğundan emin olun. Aksi takdirde, larva banda uygun olmayacaktır. </li><li> hafif bir baskıyla cam slayt çift taraflı bant konumlandırılmış sinek dorsal yüzü sopa. görüntüleme sırasında hareket uçmak yol açacaktır sinek ve çok az kuvvet öldürebilir çok fazla basınç unutmayın. </li></ol></li><li> OCM ile Larvaların Aşamaları (L2 ve L3) de Drosophila Optik Görüntüleme NOT: kalp tüpü geniş bir lümen fo olabilirund larva aşamasında A8 A5 arasındaki segmentlerinde yer alan (Şekil 1). enine OCM M-mod görüntüleri (2D + zaman) sistolik ve diyastolik analizi kolaylaştırmak için her larva için kalp tüpü A7 segmentinde elde edildi. <ol><li> objektif lens aşağıdan yukarıya bakacak şekilde sırt tarafında ile y-enine yönde OCM sisteminin ayarlanabilir numune aşamasında monte larva yerleştirin. Numune aşamasında küçük bir delik sahne uçağı ile temasını önlemek için larva yerleştirmek için gereklidir. </li><li> meyve kalp tüpü görüntüleme ışının odak düzlemine sinek taşımak için örnek sahne ayarlayın. Kolayca A7 segmenti bulmak için gerçek zamanlı görüntü elde etme yazılımı kesitsel OCM görüntüleri ile kalp tüpü arka bölgesini bulmak. A7 segmenti görünür kadar ileri sahneye taşımak. </li><li> Set B-tarama başına 100 A-taramaları (çerçeve), 100 B-taramalar için görüntü elde etme yazılımı parametreleri ve scanneR gerilimi ~ 0.28 X-enine yönde mm, ve y enine yönde 0 V kapsayacak. Karanlık bir bezle örnek ışın yolunu bloke ederek arka çıkartma için arka plan gürültü verilerini elde etmek için yazılımdaki &quot;start&quot; düğmesine tıklayın. Not: 100 kare 3 geri çıkarma için de kullanılabilir. </li><li> B-tarama başına 128 A-taramaları, 4096 B-taramalar ve tarayıcı gerilimine veri toplama yazılımı Set parametreleri y-enine yönde x-enine yönde ~ 0.28 mm ve 0 V kapsayacak. Yaklaşık 30 saniye boyunca 0.28 x 0.57 mm 2 kapsayan bir bölge üzerinde sinek kalp tüpü A7 segmenti boyunca enine M-mode görüntüleri elde etmek için yazılımdaki &quot;start&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> görüntüleme ışığa sinek kalbin uzun maruz kalmasını önlemek için veri kaydetme işlemi sırasında karanlık bir bez kullanarak görüntüleme ışını engelleyin. </li><li> Kalp eğlenceli güvenilir ölçüm almak için 5 kez tekrarlayın ölçümüction. </li><li> B, tarama başına 400 A taramalar, 800 B tarama ve tarayıcı gerilimine görüntü elde etme yazılım parametrelerinin ayarlanması X-enine doğrultuda ~ 1.7 mm kapak, ve y enine yönde yaklaşık 4 mm. tüm meyve sineği görüntülü olabilir sağlamak için her iki yönde de sahne taşıyın. 3 boyutlu meyve sineği görüntüler elde etmek için bir veri kümesi elde etmek için yazılımdaki &quot;start&quot; düğmesine tıklayın. Not: 3D sinek yapısı Amira 3D yazılımı kullanılarak kılınabilir </li><li> Ölçülen sinek nemlendirin ve yavaşça cam slayt çıkarmak için ıslak yumuşak bir fırça kullanın. Sürekli gelişim için ayrı bir tüp içine taşıyın. Bir sonraki gelişim aşamalarında uzunlamasına çalışma için tüp etiketleyin. </li></ol></li><li> Pupa Aşamaları Image Drosophila NOT: Tüm meyve sinekleri PD1 gelen PD5 için görüntüleme için dışarı alındı. Şekil 1b larva şemada gösterildiği gibi, geniş bir lümen th A8 kesimlerine A5 kalırPD1 kadar e kalp tüpü. PD2 itibaren, bir konik bölme A4 kesimlerine A1 arasında gelişmeye başlar. Tutarlı görüntüler elde ve kalp analizini kolaylaştırmak için, enine M-mod görüntüleri PD1 A7 segmentinden elde edildi ve Şekil 1b işaretli olarak, PD2 sonra A1 segmentten. <ol><li> PD1 Image Drosophila NOT: Drosophila kısa bir süre pencere için bir beyaz puparium olacak - PD1 sırasında (0 1 saat). Bu zaman pencere yüksek şeffaflık OCM görüntüleme için yüksek ışık penetrasyon neden çünkü erken pupa optik görüntüleme gerçekleştirmek için idealdir. <ol><li> Onlar pupa olunca meyve sinekleri tüp duvarında bulunan gibi, ıslak yumuşak bir fırça ile PD1 de görüntüleme için bireysel tüplerden pupa kaldırmak ve vücuda yapışmış gıda varsa fırça ile pupa temizleyin. </li><li> Doğrudan ıslak fırça ile küçük bir cam slayt meyve sineği takın ve yukarı bakacak dorsal yüzü tutmak (Şekil 1a </strong&gt;). cam slayt bu aşamada görüntüleme tamamlandıktan sonra tüpün içine geri sığacak kadar küçük olduğundan emin olun. </li><li> sinek Vücut yandan aşırı su çıkarmak. </li><li> üstünde meyve sineği tutmak, OCM sisteminin örnek sahnede cam slayt koyun. Larva ölçümü açıklanan aynı stratejiyi kullanan sinek kalp A7 segmentinin açık gerçek zamanlı görüntüyü bulun. </li><li> bölüm 3.2 gibi veri toplama yazılımı aynı parametreleri ayarlamak ve görüntü A7 segmentinde kalp atışları enine M-mod ve 3 boyutlu görüntüler elde etmek için. </li><li> görüntüleme sonra sürekli geri kültür tüpüne pupa cam slayt yerleştirmek için bir cımbız kullanın. </li></ol></li><li> PD5 Aşamaları için PD2 Image Drosophila Not: Örnek daha opak pupa aşamalarında olur için, görüntüleme sisteminin nüfuz etme derinliği azalacaktır. <ol><li> dikkatlice cam s kaldırmak için cımbız kullanınlide görüntüleme için tüpten PD2 de sinek ile monte edilebilir. PD2 anda, numune kabuk sararır ve vücut PD1 (Şekil 1) ile karşılaştırıldığında daha az şeffaf hale gelir. </li><li> OCM sisteminin örnek sahnede slayt yerleştirin. </li><li> OCM sisteminin görüntüleme ışınının odak düzlemi sinek taşımak için örnek sahne ayarlayın. Gerçek zamanlı kesit OCM görüntü kalp tüpün anterior ucunu Bul. kalp tüpü A1 segmenti bulmak için geri posterior yönde ~ 50 mikron taşıyın. NOT: Kalp geliştirme (PD2) Bu noktada, konik odası çok küçük olacak ve dayak olmayabilir. </li><li> önceki gelişim evreleri aynı yöntemi kullanarak enine A1 segmentinden M-mode veri setleri yanı sıra 3D veri toplamak. </li><li> Sürekli kültürü için dikkatle tüp geri slayt koydu. NOT: PD3 anda, kabuk numunenin rengi PD2 aşamasında daha koyu. PD4 aşamada, siyah şeritler can örneklerin kabuğun içinde görülmektedir. Diğerleri PD5 dönüşecektir Bazı sinekler, ertesi gün bu aşamada yetişkin dönüşecek. PD5 aşamada, siyah şeritler daha açıkçası meyve sinekleri görülür bulunmaktadır. Bu sinekler ertesi gün yetişkin haline gelecektir. </li></ol></li></ol></li><li> Yetişkin Sahne Image Drosophila NOT: yetişkin aşamada, kadın ve erkek sineklerin vücudun büyüklüğü ve alt karın rengine göre ayırt edilebilir. erkekler daha küçük ve koyu renkli alt karında ise kadın yetişkinden daha büyük bir boyutu var. <ol><li> Meyve sineği bir yetişkin haline geliştiğinde inkübatör tüpü dışarı atın ve yetişkin bir ~ 45 ml boş şişeye sinek aktarın. </li><li> Anestezi içine bir değnek emici ucunu (~ 1 cm uzunluğunda, ~ 3 mm çapında) Dip şişenin içine değnek koymak ve sadece takılı pamuk altında ve anestezik ucunu tutmak için bir pamuk küme ile tüp fiş anes3 dakika boyunca sinek thetize. anestezi süresi anında büyüklüğüne bağlıdır ve en az 3,5-2,5 arasında değişebilir (örneğin: min 3 kadın, en az 2.5 erkek veya 3.5). </li><li> çift ​​taraflı bant parçası ile bir cam slayt hazırlayın. </li><li> sırt tarafı yukarı bakacak şekilde yumuşak bir fırça kullanarak cam slayt üzerine anestezi sinek taşıyın. </li><li> Bir cımbız kullanarak kanatları ayırın ve sinek düzeltmek ve görüntüleme için kalp bölgesini ortaya çıkarmak için bir mikroskop altında kasete kanatları sopa. </li><li> Görüntü sinek kalp A1 segmentinden sinek (Şekil 1). Deneyin sonunda, uçucu feda edilebilir. </li></ol></li></ol> 4. Görüntüleme Analizi 16 <ol><li> görüntü dosyaları görüntü elde etme yazılımı ile toplanan 2D ve 3D ikili dosyaları dönüştürmek için Matlab programlarını geliştirmek. </li><li> creat enine M-mode görüntülerde kalp tüpü bölgesini ve bir sihirli değnek algoritması tanımlamak için ImageJ kullanınHer enine M-mod görüntü için kalp bölgenin ea maskesi. Segment maskeli bölge ve sistolik ve diyastolik yerleri belirlemek için bir zirve bulma algoritması kullanır. enine M-mode görüntülerden zamana bağlı kalp çap değişiklikleri hesaplayın. </li><li> edinilen zamana bağlı kalp çapları dayanarak, İK, kardiyak faaliyet döneminde (CAP), uç Diastol çapı (EDD), uç sistol çapı (ESD), uç Diastol alanda (EDA) gibi kardiyak parametreleri hesaplamak ve (sistol alan son ESA). fraksiyonel kısalma (FS) ile hesaplayın <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/55002/55002eq1.jpg" /></li><li> sinek kalbin yapısal gelişimini görselleştirmek için 3D OCM görüntüleri analiz etmek ImageJ kullanın. </li></ol>

The authors declare no conflicts of interests related to the current study.

Larva ve ergin dönemlerinde 400 bpm civarında maksimum HR Drosophila hızlı kalp atışı, kalp diastoles ve systoles (tecrübelerine dayanarak en az 80 kare / sn) gidermek için yüksek görüntüleme hızı gerektirir. Nedeniyle küçük kalp odası büyüklüğü ve mikron ölçekli kalp duvar kalınlığına (5-10 um), yüksek uzamsal çözünürlük (2 um daha iyi) kalp tüpü yapılarının çözülmesi için gereklidir. Bu çalışmada, yüksek çözünürlüklü ve ultra hızlı OCM sistemi ızgara 600 satır / mm şanzıman ile bir spektrometre ve 2048 piksel hat-tarama kamerası kullanıldı nerede geliştirildi. 20 kHz bir a-tarama hızı satır tarama kamerası tarafından sağlanır. 128 kare kare hızı / sn L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5 ve yetişkin olmak üzere çok sayıda gelişim evreleri, Drosophila kalp atışı yakalamak için yeterince hızlı. ışık kaynağı ~ 800 nm ve merkezi bir dalga boyu ve bant genişliği ile geniş bir bant genişliği supercontinuum ışık kaynağı oldu220 nm, sırasıyla ve dokuda ~ 1.3 um&#39;lik bir eksenel çözünürlük elde edilmiştir. 10X objektif 3.9 um aralığında bir enine çözünürlük elde etmek için Örnek kolu kullanılmıştır. Drosophila kalp tüpü yaklaşık 200 mikron dorsal yüzeyinin altında olduğundan, mikron metre yüzlerce bir görüntüleme derinliği gereklidir. 45 ° çubuğu aynası halka şeklinde bir örnek ışın oluşturur ve numune 44 odak derinliği genişletmek için kullanılabilir. duyarlılık ve 3 dB roll-off ~ 9 mW örnek kol gücü ile sırasıyla 96 dB ve 600 mikron olduğu tespit edilmiştir. Özel bir bilgisayar programı ölçümleri OCM sistemini kontrol etmek ve yürütmek için kullanılmıştır. Kardiyak yapısal görüntüleri ve elde edilen fonksiyonel parametreler kantitatif onun bütün yaşam döngüsü boyunca Drosophila kalp morfolojisi ve fonksiyonunu karakterize etmek OCM kullanarak uygulanabilirliğini göstermek. Günümüzde, bir çok başka teknikler de görüntü küçük için kullanılırhayvan kalp yapısı veya fonksiyon, örneğin bilgisayarlı tomografi (BT), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve ultrason gibi. OCM ince yapıları ve hayvan kalpleri hızlı dinamikleri görselleştirme sağlayan bu tekniklerin daha yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlük sağlar. Mikroskopisi başka yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme tekniğidir, ancak düşük görüntü nüfuz ve görüntüleme kontrast maddelerin talep canlı hayvanlarda uygulamaları sınırlamak. Nispeten OCM yüksek hız ve küçük hayvanlarda non-invaziv hızlı kalp dinamiklerini görselleştirmek için etiket ücretsiz görüntülenmesine olanak sağlar. Ancak, yine de OCM sınırlamalar vardır. ultrason 10 cm&#39;ye kadar nüfuz derinlikleri olan Örneğin, OCM tarafından sağlanan görüntü derinliği dokusunda yaklaşık 1 mm birkaç yüz mikronluk ışık saçılımı ile sınırlıdır. konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, OCM yüksek hız ve daha iyi görüntüleme derinliği, ancak daha düşük çözünürlük ve kötü moleküler kontrast vardır. Ayrıca, mevcut OCM sistemi baspektral domain algılama sistemleri sed. OCM 45 süpürüldü-kaynağına göre daha yüksek görüntüleme hızı kalp atışı gibi hızlı dinamikleri daha belirgin görüntüleri sağlayabilir. OCM&#39;de ile Drosophila kalp atışı uzunlamasına bir çalışma gerçekleştirmek için, protokol birçok kritik adımlar vardır. sinekler Deneyin her aşamasında çok ince ele alınması gerekir. Aşağıdaki gelişim aşamalarında kalp yapısı ve fonksiyonu etkileyebilir larva, zarar kolaydır çünkü larva yönetme özellikle nazik olmalıdır. sinekler kapak cam ve çok hassas görüntüleme sahnede yerleştirilmelidir. Kötü yerleştirilmiş sinekler zor kaliteli görüntüler elde etmek ve çarpık yapısal ve işlevsel kalp parametre değerleri neden olabilir yapacaktır. Ayrıca, transfer yetişkin başka bir tüp uçar ve pamuk takmayı tüpten kendi kaçmasını önlemek için çok hızlı olmalıdır. Farklı çalışmalarDrosophila kalp geliştirme protokolü değiştirerek yapılabilir. Sinekler kültüre olan sıcaklık artışı veya kalp gen ifade seviyesini değiştirebilir ve sinek geliştirme süresini değiştirmek için 25 ° C&#39;den azaltılabilir. örneğin hindistan cevizi yağı ya da standart gıda ATR gibi maddeler ekleyerek, kalp gelişimi değiştirilebilir. Belirli çalışmalar, vahşi tip veya transgenik sinekler gerçekleştirilebilir. uzunlamasına meyve sineği kalp gelişimini incelenirken, farklı zaman aralıklarında, örneğin OCM ölçümler yapmak için kullanılabilir, 8 saat aralığı pupa aşamalarında kullanılabilir. Nedeniyle bizim OCM sisteminin sınırlı hassasiyeti, düzgün benek çok gürültü zor doğru Matlab programları ile kalp kasılma sinyallerini tespit ve veri analizi etkinliğini azaltmak için yapabilirsiniz enine M-mode görüntülerde, bulunur. Duyarlılık OCM sisteminin hizalama geliştirerek arttırılabilir. Optimize edilmiş filtreleme algoritmalarıbenekler bir kısmını kaldırmak için tavsiye edilir. Açıklanan protokol, insan sirkadiyen ortologlar, Drosophila dCry ve dClock bağlı kalp kusurları sessizliği incelemek için uygulanmıştır. Azalmış RO larva, pupa ve yetişkin 15,16 dahil olmak üzere farklı gelişimsel aşamalarında gözlenmiştir. Kalp gelişiminde sirkadiyen genlerin rolü kardiyovasküler bozukluklar ve sirkadiyen ritim ilgili etkinlik modelleri arasındaki ilişkiyi açıklayabilir, ortaya çıktı. Yüksek yağlı-diyet (YYD) bağlı kalp hastalıkları da YYD 15 ile beslenen meyve sineklerinin kalp fonksiyonel değişiklikleri analiz tarafından incelenmiştir. Bu çalışmalar, kalp yapısı ve fonksiyonu gelişimsel çalışmada güçlü bir araç değil, aynı zamanda doğumsal ve doğum sonrası insan hastalıklarının anlamada kardiyak uzunlamasına çalışmanın önemi olarak sadece Drosophila gösterdi. OCM platformu gelecek çalışmalara geniş bir yelpazede sağlayacak in geni insan kalp hastalığı ile ilgili.

Küçük hayvanlarda kalp uzunlamasına bir çalışma gibi gen ile ilgili konjenital kalp defektleri 1,2 gibi insan ilgili kardiyovasküler hastalıklar, çeşitli anlamak için katkıda bulunur. Geçmiş yıllarda, fare, 3,4, Xenopus 5,6 zebra balığı 7,8, kuş 9 ve Drosophila 10-16 gibi çeşitli hayvan modellerinde,, araştırma ile ilgili, insan kalp geliştirme çalışmaları için kullanılmıştır. Fare modeli yaygın normal ve anormal kalp gelişimi ve insan kalbi 3,4 ile benzerlikler nedeniyle kalp kusur fenotipleri incelemek için kullanılır olmuştur. Xenopus embriyo nedeniyle kolay kullanım ve kısmi şeffaflık 5,6 kalp gelişimi çalışmada özellikle yararlıdır. Embriyo ve zebra balığı model erken larva şeffaflık kalp gelişimi 7,8 kolay optik gözlem için izin verir. kuş modeli gelişimsel kalp çalışmalarının ortak bir konudur because Kalp kolayca yumurta kabuklarını ve insanlarda 9 kuş kalplerin morfolojik benzerliği çıkardıktan sonra ulaşılabilir. Drosophila modeli kalbin uzunlamasına çalışmalar yapmak için ideal hale bazı benzersiz özelliklere sahiptir. İlk olarak, Drosophila kalp tüpü kalbin optik erişim ve gözlem için kolaylık sağlar dorsal yüzeyinin altında ~ 200 mikron vardır. Ayrıca, birçok moleküler mekanizmaları ve genetik yollar Drosophila ve omurgalılar arasında muhafaza edilir. İnsan hastalık genlerinin 75 üzerinde% ortologlar yaygın transgenik çalışmalarda 11,13 kullanılan yapmış Drosophila, bulundu. Ayrıca, kısa bir ömrü ve düşük bakım maliyetleri vardır ve yaygın gelişimsel biyoloji araştırma 14-16 bir örnek model olarak kullanılmıştır. Önceki raporlar o gibi Drosophila kalp fonksiyonlarını izlenmesi için protokol tarifArtbeat. Bununla birlikte, diseksiyon işlemleri 17,18 gerekmiştir. Optik görüntü nedeniyle non-invaziv doğası hayvanlarda kalp gelişimini görselleştirmek için etkili bir yol sağlar. Farklı optik görüntüleme yöntemleri gibi iki foton mikroskopi 19, konfokal mikroskopi 20,21, hafif levha mikroskobu 22, ve optik koherens tomografi (OCT) 16,23-26 olarak, performans hayvan kalp çalışmada uygulanmıştır. Nispeten, Ekim görüntüleme canlı hayvanlar için önemli olan yüksek çözünürlük ve Ultrahigh görüntüleme hızı, tutarken, kontrast maddeleri kullanmadan küçük hayvan kalplerinde büyük bir görüntüleme derinliğini sağlama yeteneğine sahiptir. Ayrıca, bir Ekim sistemini geliştirme düşük maliyetli örneklerinin optik görüntüleme için bu tekniği yaygınlaştırmıştır. Ekim başarıyla Drosophila boyuna çalışma için kullanılır olmuştur. Ekim, kalp morfolojik ve fonksiyonel görüntüleme kalp yapıları incelemek için yapılmıştır kullanma, işlevtional genlerin rolleri ve kalp gelişimi sırasında mutant modellerde kardiyovasküler kusurların mekanizmaları. Örneğin, yaşa bağlı kardiyak fonksiyon düşüş OCT 27 Drosophila aşağı-regüle anjiotensin dönüştürücü enzim ilgili (ACER) geni ile teyit edilmiştir. Gen ile ilgili kardiyomiyopati fenotiplendirme OCT 28-33 kullanılarak Drosophila gösterilmiştir. Araştırma kullanarak Ekim de Drosophila 34 kalbinde insan SOX5 geninin fonksiyonel rolünü ortaya koymuştur. OCT ile karşılaştırıldığında, OCM daha enine çözünürlük sağlamak için daha yüksek bir sayısal diyafram ile objektif kullanır. Geçmişte, bir ortologu insan sirkadiyen geni dCry / dClock susturma kaynaklanan kalp fonksiyon bozukluğu, obezite kaynaklı insan anlamak için özel bir OCM sistemi 15,16 yanı sıra Drosophila kardiyomiyopatilerde yüksek yağlı-diyetin etkisini kullanarak çalışılmıştır kalp hastalıkları. 15 Burada, inciE deneysel protokol ikinci dönem (L2), üçüncü instar (L3), pupa gün 1 (PD1), pupa günde 2 (PD2), pupa gün 3 de Drosophila kalp morfolojik ve fonksiyonel değişikliklere boyuna çalışma için (PD3) özetlenmiştir , pupa gün 4 insan kaynaklı doğumsal kalp hastalıklarının çalışma kolaylaştırmak için OCM kullanarak (PD4), pupa gün 5 (PD5) ve yetişkin (Şekil 1). İK ve CAP olarak kardiyak fonksiyonel parametreler, kantitatif kalp gelişim özellikleri ortaya çıkarmak için farklı gelişim aşamalarında analiz edildi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="515">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Custom OCM imaging system</td>
			<td style="width:136px;">Developed in our lab</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">my Temp Mini Digital Incubator</td>
			<td style="width:136px;">Benchmark</td>
			<td style="width:95px;">H2200-HC</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Cover glass</td>
			<td style="width:136px;">AmScope</td>
			<td style="width:95px;">200PCS</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Cotton Ball</td>
			<td style="width:136px;">RITE AID</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Instant Drosophila Formula</td>
			<td style="width:136px;">CAROLINA</td>
			<td style="width:95px;">formula 4-24</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Yeast</td>
			<td style="width:136px;">ActiveDry</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Microscope</td>
			<td style="width:136px;">SONY</td>
			<td style="width:95px;">WILD M420</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Brush</td>
			<td style="width:136px;">Loew-Cornell</td>
			<td style="width:95px;">245B</td>
			<td style="width:117px;">being used to move specimens</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Labview software</td>
			<td style="width:136px;">National Instruments</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Image J</td>
			<td style="width:136px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Matlab</td>
			<td style="width:136px;">Mathworks</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Tweezer</td>
			<td style="width:136px;">Wiha</td>
			<td style="width:95px;">AA SA</td>
			<td style="width:117px;">to fix the fruit fly wings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">FlyNap</td>
			<td style="width:136px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:95px;">4,224,898</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M</td>
			<td style="width:136px;">Scotch</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Pipette</td>
			<td style="width:136px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:95px;">MU18837</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Organic Extra Coconut Oil</td>
			<td style="width:136px;">Spring Valley</td>
			<td style="width:95px;">13183</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Microscope Slide</td>
			<td style="width:136px;">CapitolBrand</td>
			<td style="width:95px;">M3504-E</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Drosophila Vials</td>
			<td style="width:136px;">SEOH</td>
			<td style="width:95px;">8401SS</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">All-trans-retinal</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td style="width:95px;">R2500</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (ocm)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

uzunlamasına kardiyak görüntüleme OCM ile oda sıcaklığında 24B-GAL4 / + suşu ile meyve sinekleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ölçümler L2, L3 gerçekleştirilen ve PD4 PD1 8 saat aralıklarla ve yetişkin günlük 1 (AD1) başkalaşım süreci (Tablo 1) izlemek için bulundu. Larva erken Pupa geç pupa ve yetişkin sinek Şekil 1A görüldüğü gibi, cam lam üzerine yerleştirilmiştir. Larva ve ergin sinekler için kalbin segmenti özellikleri Şekil 1B şematik temsiller gösterilmiştir. Bu gelişimsel çalışmada, 4.096 kare bir meyve sineği kalp atışı izlemek için bizim özel OCM sistemi ile 32 saniyede elde edildi. ölçüm doğruluğunu artırmak için, beş tekrarlanan ölçümler her gelişim aşamasında her numune alındı. 3D veriler de metamorfoz sırasında kalp yapısı değişiklikleri gözlemlemek için elde edilebilir. Enine M-mod ve 3D görüntüler c vardı<html> Özel Matlab programları ve ImageJ ile reated. Yüz görüntüleri ve eksenel bölümler de Drosophila metamorfoz (Şekil 2) sırasında kalbin yeniden şekillenme sürecini görselleştirmek için elde edilen verilerden inşa edildi tr. meyve sinekleri kalp fonksiyonlarını ölçmek için, kalp bölge otomatik olarak 4096 çerçeveleri özel bir Matlab programını kullanarak segmente edildi. Sinek kalp atım hızı (KAH) enine M-mode OCM görüntülerden sayısal olabilir (Şekil 3a). Pupa aşamalarında, Drosophila kalp bazen 16 yenerek durdurur. Biz toplam görüntüleme süresi bir kalp atışı ile dönemin oranı ölçmek için yeni bir kardiyak fonksiyonel parametre, kardiyak aktivite dönemi (CAP) tanıttı (Şekil 3b). EDD, ESD, EDA, ESA ve FS de Drosophila gelişimi sırasında eksenel ve enine her iki boyutta kalp odası değişiklikleri ölçmek için kullanıldı. 16 larva aşamalarında içerik &quot;&gt;, kalp tüpü daha geniş bir lümen arka karın bölgesi A8 başlar (A5 - A8 Şekil 1B) ve daha dar çaplı (T3 / A1 ile ön sırt kesimi A1 biter - A5 Şekil 1B ). kalp odası medial ve dorsal bulunur ve L2 (Şekil 2 a, B) ya da L3 (Şekil 2 C sırasında büyük büyüdü, d). PD1 girdikten sonra, kalp tüpü, hareket eden havanın üst üzerinde eksenel olarak uzanan gözlenmiştir kabarcık (Şekil 2 e, f) Yaklaşık 10 -. 13 saat sonra, kabarcık puparium oluşumundan sonra kayboldu ve ön kalp tüpü ventral bulunduğu yana oldu dışa dönük geniş lümen, bütün kalp tüpü posterior bölgesi hariç görünmez oldu. OCM görüntüleri ~ puparium oluşumundan sonra 12 saat sonra PD2 sırasında, kalp odası yavaş yavaş dorsal karın boyunca hizalanmış ve arka kısmı (A6 - A8). kalbin elendi (Şekil 2 g, h) 42,43. Bir konik odası ~ A1 geliştirmeye başladı - PD2 sırasında A4 segmenti ve yetişkin aşamasında (Şekil 2 i - m) kadar boyutu büyüdü. yapısal değişiklikler gözlemlemenin yanı sıra, pek çok fonksiyonel değişiklikler kardiyak yeniden sırasında da bulunmuştur. Şekil 3&#39;te gösterildiği M-mod görüntüleri kalp atışı pupa aşamasına larva aşamasında önemli ölçüde yavaşladı, sonra da yetişkin pupa önemli bir artış olduğunu göstermektedir. Önemli İK değişiklikler yaşam döngüsü (Şekil 4a) sırasında gözlendi. Ayrıca, kardiyak aktivite süresi (CAP) AD1 (Şekil 4b) L2 ölçülen tüm örnekler için analiz edildi. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, sıcak L2 ve L3 için dakika başına ° &#39;de 277 (bpm) tutar. Erken pupa aşamalarında girdikten sonra İK ve CAP belirgin bir azalma var. İK PD1 başında 86 ± 11 bpm azalır ve e 26 ± 8 bpm azalmaya devam ediyorPD1 of nd nihayet erken PD2 tam bir durdurmak için gelen. Bir ilginç keşif PD2 sahne etrafında gözlenen kardiyak yazıcının uzun dönemdir (~ 24 saat - puparium oluşumundan sonra 48 saat), kardiyak gelişimsel diastalsis 16 anılacaktır. PD2 sonunda yavaş aralıklı dayak (CAP 5 ± 2 ile 6 ± HR 17 bpm) devam eder. PD3 ve PD4, İK ve CAP artış yetişkin aşamasında ilk gününde 392 ± 32 bpm ve 95 ±% 3 ulaşıncaya kadar (5 gün sonra pupa aşamasına başlayan) boyunca. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55002/55002fig1.jpg" /> Şekil Farklı Aşamaları ve Kalp Metamorphosis şematik Temsilciliği Drosophila 1. montajı. (a) larva, pupa ve montajı, ve yetişkin WT (24B-GAL4 / +) cam slaytlar uçar. (b) kalp başkalaşım şematik gösterimi. larva ve ergin schemati Kırmızı oklarsırasıyla PD1 24 saat kadar OCM M-mod görüntüleme yerleri göstermek ve daha sonraki zaman noktalarında için c. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55002/55002fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55002/55002fig2.jpg" /> 2. Drosophila Kalp Morfolojik değişiklikler Şekil. Yüz ve (a, b) L2 elde edilen bir WT Drosophila eksensel kesit OCM görüntü (c, d) L3 (e, f) PD1 (G, H) Pd2 (I, L) PD4 ve (k, m), yetişkin En aşamaları. Drosophila kalp M-mode görüntüleri PD1 kadar ve daha sonraki aşamalarda A1 segmentten A7 segmentten elde edilmiştir. Yüz ve eksenel kesit görüntüleri 200 um ve 500 mikron, r göstermek tr ölçekli çubuklarespectively. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55002/55002fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55002/55002fig3.jpg" /> 3. Drosophila Kalp Fonksiyonel Değişiklikleri Şekil. (a) yaşam döngüsü boyunca İK değişiklik gösteren farklı gelişim aşamalarında M-mod görüntüler. (b) kardiyak aktivite dönemi (CAP) hesaplama gösteren örnekler. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55002/55002fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55002/55002fig4.jpg" /> Fonksiyonel Kardiyak Parametre Şekil 4. Kantitatif AnalizWT s L2, L3, 8 saat aralıklarla Pupa Aşamaları ve AD1 gibi farklı Gelişim Aşamaları, en Sinekler. (a) İnsan. (b) CAP. her bir grubun hata çubuğu, standart sapmayı temsil etmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55002/55002fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4" rowspan="3"></td><td colspan="14"> gelişim Aşaması </td></tr><tr><td rowspan="2"> L2 </td><td rowspan="2"> L3 </td><td colspan="3"> PD1 </td><td colspan="3"> PD2 </td><td colspan="3"> PD3 </td><td colspan="2"> PD4 </td><td rowspan="2"> AD1 </td></tr><tr><td> 8 saat </td><td> 16 saat </td><td> 24 saat </td><td> 32 saat </td><td> 40 saat </td><td> 48 saat </td><td> 56 saat </td><td> 64 saat </td><td> 72 saat </td><td> 80 saat </td><td> 88 saat </td></tr><tr><td colspan="4"> numune sayısı </td><td> 21 </td><td> 17 </td><td> 13 </td><td> 19 </td><td> 19 </td><td> 19 </td><td> 19 </td><td> 19 </td><td> 19 </td><td> 18 </td><td> 17 </td><td> 18 </td><td> 9 </td><td> 25 </td></tr></tbody></table> WT Meyve Tablo 1. Sayı Kardiyak Gelişimsel Çalışması Çeşitli Gelişim Evreleri ölçüm Sinekler. <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55002/55002vid1.jpg" /> Bir WT Zamansal Boyut boyunca Heartbeat Video 1. İzleme ve z Yönetmenliği (eksenel doğrultuda) boyunca Sorumlu Kalp Odası Çapı Değişim L2 uçarlar. Kalp sabit bir oranda göreceli hızlı çarpıyordu. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55002/video1.mp4" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)</a> </<html> p&gt; <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55002/55002vid2.jpg" /> Bir WT Zamansal Boyut boyunca Heartbeat Video 2. İzleme ve z Yönetmenliği (eksenel doğrultuda) boyunca Sorumlu Kalp Odası Çapı Değişim PD1 uçarlar. İK azalmaya başlamıştır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55002/video2.mp4" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)</a> <img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/55002/55002vid3.jpg" /> Bir WT Zamansal Boyut boyunca Heartbeat Video 3. İzleme ve z Yönetmenliği (Eksenel Yönü) boyunca Sorumlu Kalp Odası Çapı Değişim PD2 uçarlar. Kalp süre içinde tamamen yenerek durdurdu. çizilen Z çaplı salınım görüntüleme gürültü nedeniyle olmuştur.<html> target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.) <img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/55002/55002vid4.jpg" /> Bir WT Zamansal Boyut boyunca Heartbeat Video 4. İzleme ve z Yönetmenliği (Eksenel Yönü) boyunca Sorumlu Kalp Odası Çapı Değişim PD4 uçarlar. PD2 sonra İK ve CAP artmaya başladı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55002/video4.mp4" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)</a> <img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/55002/55002vid5.jpg" /> AD1 bir WT Fly Zamansal Boyut boyunca Heartbeat Video 5. İzleme ve z Yönetmenliği (Eksenel Yönü) boyunca Sorumlu Kalp Odası Çap Değişikliği. İK tüm aşamalarda en yüksek ve CAP neredeyse% 100 idi.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (indirmek için sağ tıklatın.) <img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/55002/55002vid6.jpg" /> Bir larva sinek Video 6. 3D yapısal render. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55002/video6.mp4" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM at JoVE.com

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

drosophila-preparation-longitudinal-imaging-heart-function-vivo-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

10.8K Görüntüleme.  Lehigh University. Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Video: Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biyoloji

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Tüm Kalp Görüntüleme Floresan Optik Projeksiyon Tomografi tarihi Normalizasyon

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Larvaların olarak izlenmesi Kalp Fonksiyonu Drosophila melanogaster Fizyolojik Çalışmaları

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Hazırlanması Drosophila Işık Mikroskopi S2 hücreleri

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...