Bu işlevselleştirilebilir sentezi için basit bir protokoldür, yakın kızılötesi fotolüminesan altın nanokümeler yayan ve ticari bir kurulum kullanarak bunların tespiti. Bu tekniğin en önemli avantajlarından biri tiyol-fonksiyonel ligand eki ve altın nanokümelerin yüzeyinde amin fonksiyonel ligand kaplin olumsuz fotolüminesan özellikleri ve bobin stabiliteetkilemez olmasıdır. Bu yoğun fotolüminesans özellikleri ve biyomoleküller ile konjugasyon kombinasyonu düşük konsantrasyonlu aniliitler in vitro tespiti için izin verecektir öngörülebilir, biosensing, çözünme, ve biyo-görüntüleme.
Prosedürü gösteren klaudia Kvakova, benim doktora öğrencisi olacaktır. Akış sitometrisi araştırma asistanı Alzbeta Magdolenova tarafından gösterilecek. Mikroskobik kısmı, Lenka Libusova Laboratuvarı'ndan yüksek lisans öğrencisi Vaclav Bocan tarafından gösterilecek.
23,4 mililitre ultrasaf suya 60 mikrolitre de 7,8 miliyotik asit ekleyerek ve tamamen eriyene kadar karışımı karıştırarak başlayın. Daha sonra çözeltiye 10,2 mikrolitre hidrojen tetrakloraurate ekleyin ve 15 dakika sonra, 480 mikrolitre taze hazırlanmış sodyum borohidrit ekleyin ve şiddetle karıştırın. Reaksiyon karışımını bir gecede karıştırmaya devam edin.
Ertesi gün, üç kilodalton moleküler ağırlık kesme ile ultrafiltrasyon üç döngüleri kullanarak çözüm arındırın, sonra çözeltiye tiyol sonlandırılmış polietilen glikol 15.6 miligram ekleyin, 7 ve 7.5 arasında pH ayarlamak ve nanoküme 1 elde etmek için karışımı bir gecede karıştırın. Ertesi gün, dağılım arındırmak için santrifüj ve filtrasyon üç döngütekrarlayın. Nanocluster 1 çözeltisini DYP ile karıştırın ve pH'ı tek molar hidrojen klorür ile 4,5'e ayarlayın.
EDC HCL fazlalığı ekleyerek reaksiyonu başlatın ve ilk saat boyunca karışımın pH'ını izleyin. pH altının üzerine çıkarsa hidrojen klorür ekleyerek azaltın. Oda sıcaklığında bir gecede reaksiyon karışımını karıştırın.
Ertesi gün, daha önce nanocluster 2 elde etmek için açıklandığı gibi santrifüj ve filtrasyon üç döngüleri gerçekleştirin. 24 mililitre lik bir hacimde ultra saf su ile seyreltin. Hücreleri 12 kuyuluk bir plakaya, kuyu başına 20.000 hücrelik bir yoğunlukta tohumlayın.
48 saat boyunca kuluçkaya yat, sonra orta aspire ve iyi başına nano tanecikleri 500 mikrogram ile veya olmadan tam kültür ortamı 400 mikrolitre ekleyin. Nanoküme içselleştirme için hücreleri 37 derecelik santigrat kantine geri döndürün. İki saat sonra, hücreleri standart tripsinizasyon ile ayırın.
Polipropilen mikrosantrifüj tüpler ve santrifüj beş dakika için 350 kez g ve dört derece santigrat onları toplayın. FcM tamponu el yazması talimatlara göre hazırlayın ve hücre peletlerini yıkamak için bir mililitre arabellek kullanın. Hücreleri beş dakika daha santrifüj edin, sonra FCM tamponunun 500 mikrolitresinde yeniden askıya alın ve dört santigrat derecede saklayın.
Numunenin satın alınmasından önce, cihazın ilgili optik konfigürasyona sahip olduğundan emin olun. 780'i 60'ın üzerinde bandpass filtresini 405A dedektörünün önüne yerleştirin. Beş mililitrelik polistiren yuvarlak dipli tüp kullanarak tüm örnekleri hücre süzgeci kapağı ile filtreleyin.
Sitometre yapılandırmasını belirtin. Hücrelerin dağılımını göstermek için FSC-A ve SSC-A'nın iki parametrelik nokta çizimini çizin. Doublets'ı dışlamak için, FSC-H ile FSC-A'nın iki parametrelik nokta çizimini oluşturun ve örnekteki göreli floresan yoğunluğunu izlemek için floresan kanal alanı için tek parametreli bir histogram çizin.
Olay olaylarını en aza indirmek için düşük akış hızında işlenmemiş örnek edinin. Satın alma sırasında, FSC ve SSC arsa üzerinde ölçekte işlenmemiş nüfus almak için PMT gerilimleri ayarlayın. Gerekirse, fl kanalı için PMT voltajlarını ayarlayarak lekesiz popülasyonu histogramın sol köşesine yerleştirin.
Ardından yazılımdaki belirli Kapı sekmesini seçin ve istenen popülasyonun etrafına uygun bir kapı çizin. Geçidin içindeki hücreler bir sonraki kontrol noktasına hareket edecek. Denemeyi ayarlayın ve verileri kaydedin.
24 saat sonrası tohumlama, HeLa hücreleri ile orta 0,5 mililitre içeren her yemek odasına 2 100 mikrogram ekleyin. Kuvöze çanak dönün ve hücrelerin nanokümeleri içselleştirmek için izin, sonra orta atmak ve önceden ısıtılmış, taze orta hücreleri yıkayın. Her odayı 800 mikrolitre taze orta ile doldurun ve görüntülemeye devam edin.
Hücreleri görüntülemek için Plan-APOCHROMAT içeren bir konfokal mikroskop ve 63x yağ nesnel lens kullanın. Çanak ters sahnede 37 santigrat dereceye kadar ısıtılır ve nemlendirilmiş, % 5 karbondioksit atmosferi ile birlikte monte edin. Uygun bir ışın ayırıcıile %2 güç teset 405 nanometre lazer kullanarak dahilileştirilmiş altın nanokümeleri algılayın ve algılama dalga boylarının 650 ile 760 nanometre arasında ayarını ayarlayın.
Görüntünün çözünürlüğünü 2048 piksel olarak ayarlayın. Edinme hızı ayarında, bir pikselin yaklaşık dört mikrosaniye lik bir süreyi hedefleyin ve görüntüyü ortalama iki kez elde edin, ardından iğne deliğini bir alan birimine ayarlayın ve daha yüksek hassasiyet için foton sayma modunu kullanın. Dic ile doğru aydınlatma ve aktarılan ışık için Kohler'in kondansatör ve alan durağı ayarı kullanın.
İletilen ışığı elde etmek için, lazer dalga boyu için uygun bir ışın ayırıcısı ayarlamak için emin olun, herhangi bir floresan dedektörü atanmış olmadan% 0.7 güç bir 488 nanometre lazer kullanın. Absorpsiyon spektrumları altın nanokümeler 1 ve 2 karakteristik bir yüzey plazmon bandı na sahip olmadığını ve 550 ila 850 nanometre geniş emisyon göstermek belirtti. Fotolüminesans, DYP'nin 1 yüzeye bağlanmasından sonra kuvvetle artmıştır.
Nanokümelerden gelen emisyon da 365 nanometrelik BIR UV ışığı altında görülüyordu. Emisyon kararlıydı ve dalga boyu uyarma dalga boyundan bağımsızdı ama UV ışığı yla heyecanlandığında yoğunluk maksimaldı. Akım sitometrisi HeLa hücreleri tarafından nanocluster 2 alımını doğrulamak için kullanıldı.
Yakın floresan hem kuluçka süresi ne de nanoküme 2 konsantrasyonuna bağlıydı. Hücrelerdeki altın nanokümeler standart konfokal lazer tarama mikroskobu ile noninvaziv olarak görüntülendi. Hücreler nanoküme 2 ile boyanmış ve 24 saatlik kuluçkadan sonra hücrelerin içinde parlak kırmızı fotolüminesans gözlenmiştir.
Bu protokolü denerken, tepkisiz ve hidrolize sodyum borohidritin çıkarılmasının çok önemli olduğunu, aksi takdirde tiyitlü polietilen glikolin altın nanoküme yüzeyine bağlanmayacağını unutmamak gerekir. Ayrıca, altın nanokümelerin fotolüminesansı 560 nanometreden başlar. Confokal mikroskopi deneylerinde arka plan otofloresan önlemek için, fotonlar 650 nanometre yukarıda toplanmalıdır.
