Este es un protocolo simple para la síntesis de nanoclusters de oro fotoluminiscente de emisión de infrarrojo cercano funcionalizable y su detección mediante una configuración comercial. Una de las principales ventajas de esta técnica es que la fijación del ligando funcionalizado tiol y el acoplamiento del ligando funcionalizado con amina en la superficie de los nanoclusters de oro no afecta negativamente a las propiedades fotoluminiscentes y a la estabilidad de la bobina. Se puede prever que la combinación de intensas propiedades de fotoluminiscencia y conjugación con biomoléculas permitirá la detección in vitro de anilidos de baja concentración, biosensiones, solublees y bioimagen.
Demostrando el procedimiento estará Klaudia Kvakova, mi estudiante de doctorado. La citometría de flujo será demostrada por la asistente de investigación Alzbeta Magdolenova. La parte microscópica será demostrada por Vaclav Bocan, un estudiante de posgrado del Laboratorio Lenka Libusova.
Comience agregando 7,8 miligramos de ácido tiotáctico en 60 microlitros de hidróxido de sodio de dos molares a 23,4 mililitros de agua ultrapura y revolviendo la mezcla hasta que se disuelva por completo. A continuación añadir 10,2 microlitros de tetraclorato de hidrógeno a la solución y, después de 15 minutos, añadir 480 microlitros de borohidruro de sodio recién preparado mientras se agita vigorosamente. Continúe revolviendo la mezcla de reacción durante la noche.
Al día siguiente, purificar la solución utilizando tres ciclos de ultrafiltración con un corte de peso molecular de tres kilodaltones, luego añadir 15,6 miligramos de polietilenglicol terminado con tiol a la solución, ajustar el pH a entre 7 y 7,5, y agitar la mezcla durante la noche para obtener nanocluster 1. Al día siguiente, repita los tres ciclos de centrifugación y filtración para purificar la dispersión. Mezclar la solución de nanocluster 1 con TPP y, a continuación, ajustar el pH a 4,5 con cloruro de hidrógeno de un molar.
Comience la reacción añadiendo un exceso de EDC HCL y monitoree el pH de la mezcla durante la primera hora. Si el pH aumenta por encima de seis, reducirlo añadiendo cloruro de hidrógeno. Revuelva la mezcla de reacción durante la noche a temperatura ambiente.
Al día siguiente, realizar tres ciclos de centrifugación y filtración como se describió anteriormente para obtener nanocluster 2. Diluir 2 con agua ultrapura a un volumen de 24 mililitros. Siembra las células en una placa de 12 pozos a una densidad de 20.000 células por pozo.
Incubarlos durante 48 horas, luego aspirar el medio y añadir 400 microlitros de medio de cultivo completo con o sin 500 microgramos de nanopartículas por pozo. Devuelva las células a la incubadora de 37 grados Celsius para la internalización de nanoclusters. Después de dos horas, separe las células con la tripsinación estándar.
Recogerlos en tubos de microcentrífuga de polipropileno y centrífuga durante cinco minutos a 350 g y cuatro grados Centígrados. Prepare el búfer FCM de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y utilice un mililitro del tampón para lavar los pellets celulares. Centrifugar las células durante otros cinco minutos, luego resuspenderlas en 500 microlitros del búfer FCM y almacenarlas en cuatro grados Centígrados.
Antes de la adquisición de la muestra, asegúrese de que el instrumento tiene la configuración óptica correspondiente. Coloque el filtro de paso de banda 780 sobre 60 delante del detector 405A. Filtre todas las muestras con un tubo de fondo redondo de poliestireno de cinco mililitros con una tapa de colador celular.
Especifique la configuración del citometro. Trazar una gráfica de puntos de dos parámetros del FSC-A y SSC-A para mostrar la distribución de las celdas. Para excluir dobletes, cree una gráfica de puntos de dos parámetros de FSC-H frente a FSC-A y trace un histograma de un solo parámetro para el área del canal fluorescente para monitorear la intensidad de fluorescencia relativa en la muestra.
Adquiera una muestra no tratada a un caudal bajo para minimizar los eventos coincidentes. Durante la adquisición, ajuste las tensiones PMT para que la población no tratada se ajuste a escala en la gráfica FSC frente a SSC. Si es necesario, ajuste las tensiones PMT para que el canal FL coloque la población no mantenida en la esquina izquierda del histograma.
A continuación, seleccione la pestaña Puerta específica en el software y dibuje una puerta adecuada alrededor de la población deseada. Las celdas dentro de la puerta se moverán al siguiente punto de control. Configure el experimento y registre los datos.
A las 24 horas después de la siembra, agregue 100 microgramos de 2 a cada cámara de plato que contenga 0,5 mililitros de medio con células de HeLa. Devolver el plato a la incubadora y dejar que las células internalicen los nanoclusters, luego desechar el medio y lavar las células con medio precalificado y fresco. Llene cada cámara con 800 microlitros de medio fresco y proceda con imágenes.
Para crear imágenes de las células, utilice un microscopio confocal con Plan-APOCHROMAT y una lente objetivo de aceite 63x. Monte el plato en el escenario invertido con la cámara calentada hasta 37 grados celsius y suministrada con una atmósfera humidificada de dióxido de carbono al 5%. Detecte nanoclusters de oro internalizados utilizando un láser de 405 nanómetros ajustado a 2% de potencia con un divisor de haz adecuado, estableciendo el rango de longitudes de onda de detección entre 650 y 760 nanómetros.
Establezca la resolución de la imagen en 2048 por 2048 píxeles. En el ajuste de velocidad de adquisición, apunte a un tiempo de permanencia de píxeles alrededor de cuatro microsegundos y adquiera la imagen con un promedio de dos veces, luego establezca el agujero en una unidad de área y, para una mayor sensibilidad, utilice el modo de recuento de fotones. Para una correcta iluminación y luz transmitida con DIC, utilice el ajuste de Kohler del condensador y la parada de campo.
Para adquirir luz transmitida, utilice un láser de 488 nanómetros a 0.7% de potencia sin ningún detector de fluorescencia asignado, asegurándose de establecer un divisor de haz apropiado para la longitud de onda láser. Los espectros de absorción indicaron que los nanoclusters de oro 1 y 2 no tienen una banda de plasmon de superficie característica y muestran una amplia emisión de 550 a 850 nanómetros. La fotoluminiscencia aumentó fuertemente después de la fijación de TPP a la superficie de 1.
La emisión de los nanoclusters también era visible bajo una luz UV de 365 nanómetros. La emisión era estable y su longitud de onda era independiente de la longitud de onda de excitación, pero la intensidad era máxima cuando se excitaba con la luz UV. La citometría de flujo se utilizó para confirmar la absorción de nanocluster 2 por las células de HeLa.
La fluorescencia cercana dependía tanto del tiempo de incubación como de la concentración de nanocluster 2. Los nanoclusters de oro dentro de las células fueron imageados de forma no invasiva con un microscopio de escaneo láser confocal estándar. Las células se tiñeron con nanocluster 2 y, después de 24 horas de incubación, se observó fotoluminiscencia roja brillante dentro de las células.
Al intentar este protocolo, es importante recordar que la eliminación de borohidruro de sodio no reaccionado e hidrolizado es muy importante, de lo contrario el polietilenglicol tiolado no se unirá a la superficie del nanocluster de oro. Además, la fotoluminiscencia de los nanoclusters de oro comienza a partir de 560 nanómetros. Para evitar el autofluorescente de fondo en experimentos de microscopía confocal, los fotones deben recogerse por encima de 650 nanómetros.
