Это простой протокол для синтеза функционализируемых, ближнего инфракрасного излучающих фотолюминесцентных золотых нанокластеров и их обнаружения с помощью коммерческой установки. Одним из основных преимуществ этого метода является то, что вложение тиол-функционализированного лиганда и соединение амин-функционализированного лиганда на поверхности золотых наноклюстеров не оказывает негативного влияния на фотолюминесцентные свойства и стабильность катушки. Можно предусмотреть, что сочетание интенсивных свойств фотолюминесценции и спряжения с биомолекулами позволит в пробирке обнаруживать низкоконцентратурные анилиды, биочувствение, сулинг и биовизуацию.
Демонстрацией процедуры будет Клаудия Квакова, моя аспирантка. Цитометрию потока продемонстрирует научный сотрудник Альзбета Магдоленова. Микроскопическую часть продемонстрирует Вацлав Бокан, аспирант лаборатории Ленка Либусова.
Начните с добавления 7,8 миллиграммов тиоксической кислоты в 60 микролитров двухмолярного гидроксида натрия до 23,4 миллилитров ультрапурной воды и перемешивания смеси до полного растворения. Затем добавьте в раствор 10,2 микролитров тетрахлораурата водорода и через 15 минут добавьте 480 микролитров свежеприготовленного борогидрида натрия, энергично помешивая. Продолжить перемешивание реакционной смеси на ночь.
На следующий день очистим раствор, используя три цикла ультрафильтрации с молекулярным вырезом веса из трех килодалтонов, затем добавьте 15,6 миллиграммов полиэтиленгликоль тиола в раствор, отрегулируйте рН до 7-7,5 и перемешайте смесь на ночь, чтобы получить нанокластер 1. На следующий день повторите три цикла центрифугации и фильтрации, чтобы очистить дисперсию. Смешайте раствор наноклюстера 1 с ТЭС, затем отрегулируйте рН до 4,5 с одномолярным хлоридом водорода.
Начните реакцию, добавив избыток EDC HCL и контролировать рН смеси в течение первого часа. Если рН увеличивается выше шести, уменьшить его путем добавления хлорида водорода. Перемешать реакционной смеси на ночь при комнатной температуре.
На следующий день выполните три цикла центрифугации и фильтрации, как описано ранее, чтобы получить наноклюстер 2. Разбавить 2 с ультрапурной водой в объеме 24 миллилитров. Семя клеток в 12-хорошо пластины при плотности 20000 клеток на колодец.
Инкубировать их в течение 48 часов, затем аспирировать среды и добавить 400 микролитров полной среды культуры с или без 500 микрограммов наночастиц на колодец. Верните клетки в 37-градусный инкубатор По Цельсию для интернизации наноклюстеров. Через два часа отсоедините клетки стандартной трипсинизацией.
Соберите их в полипропиленные микроцентрифуги труб и центрифуг в течение пяти минут при 350 раз г и четыре градуса по Цельсию. Подготовь буфер FCM в соответствии с рукописными указаниями и используйте один миллилитр буфера для мытья клеточных гранул. Центрифуга клетки в течение еще пяти минут, а затем повторно использовать их в 500 микролитров буфера FCM и хранить их при четырех градусах по Цельсию.
Перед приобретением образца убедитесь, что прибор имеет соответствующую оптическую конфигурацию. Поместите фильтр 780 over 60 bandpass перед детектором 405A. Фильтровать все образцы с помощью пятими миллилитров полистирола круглого дна трубки с крышкой ситечко клетки.
Укажите конфигурацию цитометра. Участок двух параметров точечного участка FSC-A и SSC-A, чтобы показать распределение ячеек. Чтобы исключить дублеты, создайте двух параметрный точечный участок FSC-H по сравнению с FSC-A и вывястите однотехатровую гистограмму для области флуоресцентного канала для мониторинга относительной интенсивности флуоресценции в образце.
Приобретайте необработанный образец с низкой скоростью потока, чтобы свести к минимуму совпадающие события. Во время приобретения отрегулируйте напряжение ПМТ, чтобы получить необработанную популяцию в масштабе на участке FSC против SSC. При необходимости отрегулируйте напряжение ПМТ для канала FL, чтобы разместить незапачканную популяцию в левом углу гистограммы.
Затем выберите конкретную вкладку Gate в программном обеспечении и нарисуйте соответствующие ворота вокруг нужного населения. Ячейки внутри ворот переместятся на следующий контрольно-пропускной пункт. Настройка эксперимента и запись данных.
В течение 24 часов после посева, добавить 100 микрограммов по 2 к каждой тарелке камеры, содержащей 0,5 миллилитров среды с клетками HeLa. Верните блюдо в инкубатор и дайте клеткам интернализировать нанокластеры, затем отбросьте среду и вымойте клетки с помощью предварительной свежей среды. Заполните каждую камеру 800 микролитров свежей среды и приступить к визуализации.
Для изображения клеток используйте конфокальный микроскоп с Plan-APOCHROMAT и 63-х масляно-объективным объективом. Намонтировать блюдо на перевернутой сцене с камерой нагревается до 37 градусов по Цельсию и поставляется с увлажненной, 5%углекислого газа атмосферы. Обнаружить интернализированные золотые нанокластеры с помощью 405-нанометрового лазерного набора мощностью 2% с соответствующим сплиттером пучка, установив диапазон длин волн обнаружения между 650 и 760 нанометров.
Установите разрешение изображения до 2048 на 2048 пикселей. В настройках скорости приобретения, цель для пикселя жить время около четырех микросекунд и приобрести изображение с два раза в среднем, а затем установить пинхол в одну единицу области и, для более высокой чувствительности, использовать режим подсчета фотона. Для правильного освещения и передаваемого света с помощью DIC используйте установку колера конденсатором и полевой остановкой.
Для получения передаваемого света используйте 488-нанометровый лазер мощностью 0,7% без назначенного детектора флуоресценции, чтобы установить соответствующий сплиттер луча для лазерной длины волны. Спектры абсорбции показали, что золотые наноклюстеры 1 и 2 не имеют характерной полосы плазмонной плазмы поверхности и показывают широкое излучение от 550 до 850 нанометров. Фотолюминесценция сильно увеличилась после прикрепления ТЭС к поверхности 1.
Выбросы из нанокластеров были также видны под 365-нанометровый ультрафиолетовый свет. Выброс был стабильным, и его длина волны была независима от возбудивания длины волны, но интенсивность была максимальной, когда возбужденных с ультрафиолетовым светом. Цитометрия потока была использована для подтверждения поглощения наноклюстера 2 клетками HeLa.
Близкую флуоресценцию зависело как от инкубационного времени, так и от концентрации наноклюстера 2. Золотые нанокластеры в клетках были изображены неинвазивно со стандартным конфокалятивным лазерным сканирующим микроскопом. Клетки были окрашены наноклюстером 2 и, после 24 часов инкубации, ярко-красная фотолюминесценция наблюдалась внутри клеток.
При попытке этого протокола, важно помнить, что удаление неотредактированных и гидролизованных борогидрид натрия очень важно, в противном случае thiolated полиэтиленгликоль не будет связываться с поверхностью нанокластер золота. Кроме того, фотолюминесценция золотых нанокластеров начинается с 560 нанометров. Чтобы избежать фоновых аутофторесцентных в экспериментах по конфокальные микроскопии, фотоны должны быть собраны выше 650 нанометров.
