Canlı hücre mikroskopisi araştırmacıların mitoz ve mayoz bölünmede fisyon mayası nükleer dinamiklerini gerçek zamanlı olarak incelemelerine olanak tanır. Bu yöntemin gücü toksik fiksatifler ve lekeler ihtiyacını ortadan kaldırır normal fizyolojik koşullar altında yaşayan hücrelerde nükleer süreçlerin incelenmesi geliyor. Bu teknik, genetik veya biyomekanik manipülasyona uygun olmayan protein zamanlaması, stabilitesi ve hareketliliği ile ilgili soruları ele alır.
Görüntülemeden önce fizyon maya hücrelerinin sağlığına ve zindeliyetine dikkat etmek önemlidir. Deneyler arasında sonuçların tutarlılığını sağlamak için her zaman morfolojiyi ve büyüme özelliklerini inceleyin. Bu protokol, doğru bir şekilde ustalaşıldığında uzun süreli canlı hücre görüntülemesinin tutarlılığını ve tekrarlanabilirliğini artırabilecek mikroskop slaytlarını hazırlamanın nispeten basit bir yolunu gösterir.
Hücre maddesini kriyojenik uyandırma plakasından almaya başlamak için, EVET plakaları üzerine yerleştirin ve kriyojenik korumadan fisyon mayası suşlarını uyandırmak için maya genotipine bağlı olarak 25 santigrat veya 32 santigrat derece kuluçkaya yatırın. Daha sonra uyanmış fisyon maya suşları bireysel kolonilerden hücreleri almak ve EVET sıvı orta üç mililitre içeren test tüpleri içine aşılamak için steril bir döngü kullanın. Tüpleri 150 ila 220 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin ve bir gecede 25 veya 32 santigrat derecede nisbık büyüyün ve istenilen optik yoğunluk okuması 0,7 ila 1,0 arasında geç günlük fazı elde edin.
Kültürün 10 mikrolitresini mikroskop slaytına aktarın. Bir coverslip koyun ve uygun hücre morfolojisi ve beslenme durumu kontrol etmek için bir mikroskop altına yerleştirin. Mitoz veya kızamık analizi için bir mikroskop slayt kurmak için ilk 500 mililitrelik şişe ya minimal orta artı mitoz veya sıvı sporulating orta için takviyeleri içeren agarose iki gram ekleyin.
Agarose çözeltisini mikrodalga fırında 10 saniyelik artışlarla %60 güçte ısıtın veya kabı 55 derece lik su banyosuna 10 dakika ısıtın. Verimli erime sağlamak için çözeltiyi döndürün. Bir pipet ucu tutucuüzerinde iki mikroskop slaytı ayarlayın ve üst teki slayt, çapraz şekil oluşturmayı desteklemek için her iki uçta da iki laboratuvar bandı yığınına dayanıyor.
Uzun süreli görüntüleme için aşağıdaki adımlarda kalın bir yastık oluşturmak için iki slayt arasındaki mesafeyi iki milimetreden büyük olarak ayarlayın. Erimiş agarose'u oda sıcaklığında bir dakika soğuttuktan sonra üstteki kaydırağı çıkarın ve bir nokta yapmak için alt kaydırağa 50 ila 100 mikrolitre dağıtmak için geniş delikli pipet ucu kullanın. Agarose soğumadan önce yaklaşık bir ve çapı iki santimetre bir yayNif ped oluşturmak için üst slayt üstüne yerleştirin.
Optimal canlı hücre görüntüleme sonraki veri işleme adımları için önemlidir. Erimiş agarose herhangi bir hava baubles ortadan kaldırmak ve dört saatten daha uzun görüntüleme süreleri için ince bir ped oluşturmak emin olun. Mitotik olayları incelemek için ya sıvı EMM veya PMG artı takviyeleri bir gecede başlangıç kültürlerden hücreleri büyümek.
Kültürün bir mililitresini bir cuvette aktarın ve spektrofotometreyi 595 nanometre dalga boyunda ölçün. Optik yoğunluk 0.4'e ulaştığında hücre büyümesi orta log fazı olarak kabul edilir. Sonra bir mililitre hücre süspansiyonuna 1, 375 kez g'yi bir dakika santrifüj edin.
Supernatant çıkarın ve 100 mikrolitre son hacmi ne kadar az orta artı takviyeleri hücre pelet resuspend. Meyotik olaylar görüntü için minimal orta artı takviyeleri gecede başlangıç kültürlerden hücreleri büyümek. 595 nanometredeki optik yoğunluk 0.7 ile 1 arasında olduğunda hücre büyümesi geç günlük fazı olarak kabul edilir.
Sonra, geç günlük kültürlerden her mate tipi zorlanma 500 mikrolitre elde, H negatif ve H pozitif, ve bir mililitre hücre süspansiyon yapmak için birleştirir. Hücreleri 1, 375 kez g'de bir dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve sıvı maltoz ekstresi bir mililitre pelet resuspend.
Verimli besin giderimi sağlamak için maltoz ekstresini üç kez daha tekrarlayın. Son maltoz ekstresi yıkama sonra maltoz ekstresi bir mililitre hücreleri resuspend ve maltoz ekstresi dokuz mililitre içeren 50 mililitrelik bir şişe karışımı transfer. 50 ve 100 rpm arasında en az dönüş hızı 22 ila 25 santigrat derece 12 ila 16 saat kuluçka.
Bol kendini flokülasyon kaynaklanan birçok yuvarlak fizyon maya kümelerinin görünümü verimli bir şekilde büyümesini gösterir. Daha sonra, bir dakika için 1, 375 kez g de miyon kültürü ve santrifüj bir mililitre örnek alın. Supernatant 750 mikrolitre çıkarın ve kalan supernatant hücreleri yeniden askıya.
Girdap, kümeleri bozmak için beş saniye boyunca şiddetle. 2% agarose ped üzerinde bir mitotik veya meiyotik hücre süspansiyon 20 mikrolitre dağıtın. Slaytı ters çevirerek ve tüy bırakmayan kağıt havlunun üzerine koyarak 2-3 saniye boyunca fazla ortamı çıkarın.
Kaydırağı çevirin ve hava kabarcıkları oluşturmamalarını sağlayarak kapağın üstüne cam bir kapak kaydırın. Bir hücre monolayer oluşturmak için mitoz hücreleri veya iki tam dönüş için bir tam dönüş için işaret parmağı ile saat yönünde coverslip döndürmek için meyoz hücreleri için. Hücre maddesinin agarose pedboyunca dağıldığından emin olun ve tek hücre veya ascinin daha iyi ayrılmasını sağlayın.
Küçük bir ahşap sopa yardımı ile her agarose ped mühür kapağı kenarları boyunca erimiş hidrokarbon dolgu dağıtmak. Agarose ped mühürlendikten sonra mikroskop aşamasına yerleştirin. Sıcaklık odasını açın ve istenilen sıcaklığa ayarlayın.
Mikroskop sisteminin nemini kontrol etmek için odaya ıslak kağıt havlu ile bir tabak yerleştirin. Uygun görüntüleme koşullarında 10-15 dakika dengeleyelim. Bu kalan hava kabarcıkları dağıtmak ve herhangi bir son dakika agarose vardiya meydana sağlar.
Görüntüye uygun görüş alanlarını bulmak için 40X hedefini kullanın. Veri toplamaya başlamak için 60X hedefine geçin. Mikroskop fonksiyonunu kontrol eden yazılımda, gözlem altındaki floroforlerle en iyi eşleşen mikroskop filtre kümelerini seçin.
Uyarma dalga boylarını kullanılan floroforlarla eşleşecek şekilde ayarlayın, tutarlı bir sinyal üreten en düşük uyarma gücünü kullanın ve kabul edilebilir ancak ölçülebilir ve tekrarlanabilir görüntüleme verileri oluşturmak için dört ila sekiz saatlik pozlama sürelerini kullanın. Her saat en az altı edinme zaman puanı toplayın. Görüntü toplama yazılımında veri elde etmek ve 0,5 mikrometre aralıklı 13 bölümden oluşan bir Z-stok kullanmak için en az bir floresan kanalı seçin.
Fiji yazılımında eklentiler menüsü altında Bio-Formats Importer özelliğini seçerek dekonvolved bir görüntü yükleyin. Alma Seçenekleri açılır penceresinde Hyperstack, Varsayılan Renk modu'nu seçin, Otomatik Ölçek'i işaretleyin ve Tamam düğmesine basın. Görüntülenen pencerenin alttaki ilgili çubuklarda yan lara kaydırarak doğru sayıda floresan kanalve zaman çerçevesine sahip olduğundan emin olun.
Verileri sıkıştırmayan bir Tiff dosyası olarak kaydedin. Daha sonra Analyze menüsünün altında farklı parametreler seçmek için Ölçümleri Ayarla seçeneğini kullanın. Örneğin:Alan, Min max gri değeri, Tümleşik yoğunluk, Ortalama gri değeri, Ortanca, Yığın konumu, Çevre ve Görüntü etiketi.
Renk'i seçin ve Kanallar Aracı'na tıklayın. Kanallar açılır penceresinde yoğunluk veya alanın ölçüleceği Renk Kanalı'nı kontrol edin. Resim'i seçin, ardından Yazın ve 32 bit'e tıklayın.
Resim menüsünün altındaki Ayarla ve Eşik özelliklerini seçin. Koyu arka plan kutusunu işaretleyin, Varsayılan yöntemi seçin ve ilgi sinyallerini kaplamak için Kırmızı'yı seçin. İlgi çekici her yapıyı vurgulamak için değnek aracını kullanın ve seçilen YG yöneticisi penceresine seçilen YG'yi eklemek için klavyedeki T harfine basın.
Ardından, YG yöneticisini yüklemek için sıkıştırılmış YG klasörünü açın ve sol yan paneldeki her yg identifier'ini tıklatın. Analiz menüsünden Ölçü'yü seçin ve görüntü yığınının tüm dilimlerindeki ilgi çekici nesneleri ölçmek için her YG tanımlayıcısında bu komutu tekrarlayın. Sonuçları istatistiksel analiz için CSV dosyası olarak kaydedin.
Bu çalışmada hücreler besin sınırlaması veya aşırı büyüme nedeniyle açlıktan, onlar aşırı vakuoller ve azalmış hücre büyüklüğü gösterecektir. Logaritmik hücreler aktif DNA replikasyonu ve hücre bölünmesinin yanı sıra pan-nükleer Tos4-GFP ekspresyonu ve Sad1-DsRed foci ayrımı gösterir. Hücrelerin yeterince azot akıtılmadığında olduğu gibi çiftleşmenin yapılamaması, onların mayoz bölünmeye girmesini önleyecektir.
Karyogami geçiren bir çift fisyon hücresi gösterilmiştir. Miyon hücre süspansiyonunun sağlam flokülasyonu hücreden hücreye etkileşimi artırır ve böylece başarılı bir miyonvel ve verimli meyotik indüksiyon gösterir. Zigotik asci zig-zag ve muz hücre şekilleri de dahil olmak üzere birden fazla form alır.
Mitozbölünmede hücreler metafazdan telosfaza geçerken, ilk değişiklik metafazda nükleer boyutun daralmasını içerirken, ikincisi anafaz sırasında çekirdeğin bölünmesini gösterir. Bazı ayırma dinamiklerini mitotik hücrelerle paylaşmanın yanı sıra, meyotik hücreler homolog rekombinasyon sırasında nükleer salınım sergilerler ve anafaz II.It sonunda nükleozitlerin daha da azaltılması deney parametrelerinin deneyler arasında çoğaltılmasını ve toplanan verilerin aşağı analiziçin uygun olmasını sağlamak araştırmacıların sorumluluğundadır. Canlı hücre görüntülemesi, araştırmacıların mitoz ve kekoze nükleer bölünmenin mekaniğini yakından incelemelerine olanak sağladı.
Floresan etiketler ve mikroskop yetenekleri arttıkça gözlemleyebileceğimiz süreçlerin sayısı ve türü artacaktır.
