La microscopía de células vivas permite a los investigadores estudiar la dinámica nuclear de la levadura de fisión en la mitosis y la meiosis en tiempo real. La fuerza de este método proviene del estudio de los procesos nucleares en células vivas en condiciones fisiológicas normales que elimina la necesidad de fijadores tóxicos y manchas. Esta técnica aborda cuestiones relacionadas con el tiempo de proteínas, la estabilidad y la movilidad que pueden no ser susceptibles a la manipulación genética o biomecánica.
Es fundamental prestar mucha atención a la salud y la aptitud de las células de levadura de fisión antes de la toma de imágenes. Examine siempre la morfología y las características de crecimiento para garantizar la coherencia de los resultados en todos los experimentos. Este protocolo muestra la forma relativamente sencilla de preparar las diapositivas del microscopio que cuando se dominan correctamente pueden mejorar la consistencia y reproducibilidad de las imágenes de células vivas prolongadas.
Para comenzar a recoger la materia celular de la placa de despertar criogénica, ártela en placas YES e incubarla a 25 grados centígrados o 32 grados centígrados dependiendo del genotipo de levadura para despertar las cepas de levadura de fisión de la preservación criogénica. Luego utilice un bucle estéril para recoger células de colonias individuales en las cepas de levadura de fisión despiertas e inocularlas en tubos de ensayo que contengan tres mililitros de medio líquido YES. Coloque los tubos en una coctelera a 150 a 220 rpm para crecer a 25 o 32 grados Celsius durante la noche hasta la fase de registro tardío con una lectura de densidad óptica deseada de 0,7 a 1,0.
Transfiera 10 microlitros del cultivo a un portaobjetos de microscopio. Ponte un cubreobjetos y colóquelo bajo un microscopio para comprobar si hay morfología celular y estado nutricional adecuados. Para configurar un portaobjetos para el análisis de mitosis o meiosis primero añadir dos gramos de agarosa en el matraz de 500 mililitros que contiene 100 mililitros de medio mínimo más suplementos para mitosis o medio esporulante líquido para meiosis.
Caliente la solución de agarosa en un horno microondas a una potencia del 60% en incrementos de 10 segundos o coloque el vaso de precipitados en un baño de agua de 55 grados centígrados durante 10 minutos. Gire la solución para garantizar un derretimiento eficiente. Configure dos diapositivas de microscopio en un soporte de punta de pipeta con la corredera superior apoyada en dos pilas de cinta de laboratorio en ambos extremos como soporte para hacer una forma cruzada.
Ajuste la distancia entre las dos diapositivas a más de dos milímetros para formar una almohadilla gruesa en los siguientes pasos para obtener imágenes prolongadas. Después de enfriar la agarosa fundida durante un minuto a temperatura ambiente, retire la corredera superior y utilice una punta de pipeta de diámetro ancho para dispensar de 50 a 100 microlitros en la corredera inferior para hacer un punto. Antes de que la agarosa se enfríe, coloque la corredera superior en la parte superior para generar una almohadilla de dispersión de aproximadamente uno y 1/2 a dos centímetros de diámetro.
La creación de imágenes de células vivas óptimas es fundamental para los pasos posteriores del procesamiento de datos. Asegúrese de eliminar cualquier balbuceo de aire en la agarosa fundida y cree una almohadilla delgada para períodos de diagnóstico por imágenes de más de cuatro horas. Para examinar los eventos mitóticos crecen células de cultivos de inicio en EMM líquido o PMG más suplementos durante la noche.
Transfiera un mililitro del cultivo a una cubeta, y mida el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nanómetros. El crecimiento celular se considera fase de registro medio cuando la densidad óptica alcanza 0.4. Luego centrifugar un mililitro de la suspensión celular a 1, 375 veces g durante un minuto.
Retire el sobrenadante y resusppend el pellet celular en un medio mínimo más suplementos a un volumen final de 100 microlitros. Para imaginar eventos meíticos crecen células de cultivos de inicio en medio mínimo más suplementos durante la noche. El crecimiento celular se considera fase de registro tardío cuando la densidad óptica a 595 nanómetros está entre 0,7 y uno.
A continuación, de los cultivos de registro tardío obtienen 500 microlitros de cada cepa de tipo mate, H negativa y H positiva, y se combinan para hacer una suspensión celular de un mililitro. Centrifugar las células a 1, 375 veces g durante un minuto. Retire el sobrenadante y resuspendir el pellet en un mililitro de extracto de maltosa líquida.
Repita el lavado de extracto de maltosa tres veces más para asegurar la eliminación eficiente de nutrientes. Después del último extracto de maltosa, el lavado resuspendió las células en un mililitro de extracto de maltosa y transferir la mezcla a un matraz de 50 mililitros que contiene nueve mililitros de extracto de maltosa. Incubar de 12 a 16 horas a 22 a 25 grados celsius en una velocidad de rotación mínima entre 50 y 100 rpm.
La aparición de muchos grumos redondos de levadura de fisión resultantes de una abundante auto floculación indica un apareamiento eficiente. A continuación, tome una muestra de un mililitro del cultivo de apareamiento y centrífuga a 1, 375 veces g durante un minuto. Retire 750 microlitros del sobrenadante y resusppend las células en el sobrenadante restante.
Vórtice vigorosamente durante cinco segundos para interrumpir los grumos. Dispensar 20 microlitros de una suspensión de células mitóticas o meóticas en una almohadilla de agarosa del 2%. Retire cualquier exceso de medio invirtiendo la corredera y poniéndola en la parte superior de la toalla de papel sin pelusas durante dos o tres segundos.
Voltee el portaobjetos y coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio en la parte superior de la almohadilla, asegurando que no genere burbujas de aire. Para crear una célula monocapa gire el cubreobjetos en el sentido de las agujas del reloj con el dedo índice para un giro completo para las células de mitosis o dos vueltas completas para las células de la meiosis. Asegúrese de que la materia celular se dispersa a través de la almohadilla de agarosa, lo que permite una mejor separación de células individuales o asci.
Con la ayuda de un pequeño palo de madera dispensar sellador de hidrocarburos fundidos a lo largo de los bordes del cubreobjetos para sellar cada almohadilla de agarosa. Una vez sellada la almohadilla de agarosa, colóquela en la etapa del microscopio. Encienda la cámara de temperatura y establézcala a la temperatura deseada.
Coloque una placa con una toalla de papel húmeda en la cámara para controlar la humedad del sistema de microscopio. Dejar que se equilibre durante 10 a 15 minutos en las condiciones de diagnóstico por imágenes adecuadas. Esto permite que las burbujas de aire restantes se disipen y se produzcan cambios de agarosa de última hora.
Utilice el objetivo 40X para encontrar los campos de vista adecuados para la imagen. Cambie al objetivo 60X para comenzar la adquisición de datos. En el software que controla la función del microscopio, elija los conjuntos de filtros del microscopio que mejor se adapten a los fluoróforos bajo observación.
Ajuste las longitudes de onda de excitación para que coincidan con los fluoróforos utilizados, utilice la potencia de excitación más baja que produzca una señal consistente y utilice tiempos de exposición de cuatro a ocho horas para generar datos de imagen aceptables pero cuantificables y reproducibles. Recopile al menos seis puntos de tiempo de adquisición cada hora. En el software de recopilación de imágenes, seleccione al menos un canal de fluorescencia desde el que adquirir datos y emplee un stock Z compuesto por 13 secciones con un espaciado de 0,5 micrómetros.
En el software Fiji, cargue una imagen desconvolucionada seleccionando la función Importador de bioteo format en el menú de complementos. En la ventana emergente Opciones de importación, seleccione Hyperstack, Modo de color predeterminado, marque Escalado automático y pulse el botón Aceptar. Asegúrese de que la ventana mostrada tenga el número correcto de canales de fluorescencia y marcos de tiempo desplazándose hacia los lados en las barras respectivas en la parte inferior.
Guardar como un archivo Tiff que no comprime los datos. A continuación, en el menú Analizar, utilice la opción Definir medidas para elegir diferentes parámetros. Por ejemplo:Area, Valor gris máximo mínimo, Densidad integrada, Valor gris medio, Mediana, Posición de pila, Perímetro y Etiqueta de visualización.
Seleccione Color y haga clic en la Herramienta Canales. En la ventana emergente Canales marque el Canal de Color para el que se medirá la intensidad o el área. Seleccione Imagen, luego Escriba y haga clic en 32 bits.
Elija las funciones Ajustar y Umbral en el menú Imagen. Marque la casilla Fondo oscuro, seleccione el método Predeterminado y elija Rojo para superponer las señales de interés. Utilice la herramienta de varita para resaltar cada estructura de interés y pulse la letra T en el teclado para agregar el ROI seleccionado a la ventana emergente del gestor de ROI.
A continuación, abra la carpeta ROI comprimida para cargar el administrador de ROI y haga clic en cada identificador de ROI en el panel lateral izquierdo. Seleccione Medir en el menú Analizar y repita este comando en cada identificador de ROI para cuantificar los objetos de interés en todos los sectores de la pila de imágenes. Guarde los resultados como un archivo CSV para el análisis estadístico.
En este estudio si las células mueren de hambre debido a la limitación de nutrientes o el crecimiento excesivo, mostrarán el exceso de vacuolas y disminución del tamaño de la célula. Las células logarítmicas muestran la replicación activa del ADN y la división celular, así como la expresión Pan-nuclear Tos4-GFP y la separación de los focos Sad1-DsRed. No aparearse, como es el caso cuando las células no están suficientemente hambrientas de nitrógeno, les impedirá entrar en la meiosis.
Se muestra un par de células de fisión sometidas a cariogamia. La floculación robusta de la suspensión de la célula de acoplamiento aumenta la interacción de célula a célula y, por lo tanto, indica un apareamiento exitoso y una inducción meótica eficiente. Los asci zygotic toman múltiples formas, incluyendo las formas de celda en zig-zag y banana.
En la mitosis a medida que las células pasan de la metafase a la telófase, el primer cambio implica una contracción del tamaño nuclear en la metafase, mientras que el segundo muestra la división del núcleo durante la anafase. Además de compartir algunas dinámicas de segregación con células mitóticas, las células meóticas exhiben oscilación nuclear durante la recombinación homóloga y una mayor reducción de nucleósidos al final de la II.It de análisis antófasis es responsabilidad de los investigadores garantizar que los parámetros del experimento se puedan reproducir en todos los experimentos, y que los datos recopilados sean aptos para el análisis posterior. Las imágenes de células vivas han permitido a los investigadores examinar en detalle la mecánica de la división nuclear en mitosis y meiosis.
A medida que las etiquetas fluorescentes y las capacidades del microscopio mejoren el número y el tipo de procesos que podemos observar aumentarán.
