活细胞显微镜使研究人员能够实时研究裂变酵母核动力学的线粒体和美病。这种方法的强度来自于研究正常生理条件下活细胞的核过程，从而消除了对有毒固定剂和污渍的需要。该技术解决了与蛋白质计时、稳定性和流动性有关的问题，这些问题可能不易用于遗传或生物力学操作。
在成像前密切关注裂变酵母细胞的健康和健康至关重要。始终检查形态和生长特征，以确保实验结果的一致性。该协议显示了相对简单的显微镜幻灯片，当掌握正确可以提高长期活细胞成像的一致性和可重复性。
要开始从低温唤醒板中拾取细胞物质，请把它拖到 YES 板上，并在 25 摄氏度或 32 摄氏度时孵育它们，具体取决于酵母基因型，以唤醒低温保存中的裂变酵母菌株。然后使用无菌循环从觉醒的裂变酵母菌株中的单个菌落中挑选细胞，并接种到含有三毫升 YES 液体介质的试管中。将管以 150 至 220 rpm 的速度放在摇床中，在 25 或 32 摄氏度下在 25 或 32 摄氏度下生长到后期对数阶段，所需的光学密度读数为 0.7 至 1.0。
将培养的 10 微升转移到显微镜幻灯片中。戴上盖玻片，放在显微镜下，检查细胞形态和营养状态。要建立一个显微镜幻灯片的线粒体或梅氏分析，首先添加两克阿加罗斯在500毫升的烧瓶中含有100毫升的最小介质加上补充的线粒体或液体孢子介质的梅氏病。
在微波炉中以 60% 的功率以 10 秒的增量加热 agarose 溶液，或将烧杯放在 55 摄氏度的水浴中 10 分钟。旋转解决方案，确保高效熔化。在移液器尖端支架上设置两个显微镜幻灯片，顶部幻灯片位于两端的两叠实验室胶带上，作为交叉形状的支撑。
将两个幻灯片之间的距离调整到大于两毫米，以便在以下步骤中形成厚垫，以便进行长时间成像。在室温下冷却熔融的气糖一分钟后，拆下顶部滑轨，并使用宽孔移液器尖端在底部滑轨上分配 50 到 100 微升以进行点。在 agarose 冷却之前，将顶部幻灯片放在顶部，生成直径约为 1 和 1/2 至 2 厘米的扩散垫。
最佳活细胞成像对于后续数据处理步骤至关重要。确保消除熔融气中的任何气垫，并创建一个薄垫，用于成像时间超过四个小时。为了检查线粒体事件生长细胞从启动培养物在液体EMM或PMG加补充过夜。
将培养的一毫升转移到一个宽小的培养器中，并在波长为595纳米的分光光度计上测量。当光密度达到0.4时，细胞生长被认为是中日志阶段。然后在1，375次g下将一毫升的细胞悬浮液离心一分钟。
去除上一提液，在最小介质中重新暂停细胞颗粒，并补充至最终体积为100微升。要图像的美蒂事件生长细胞从启动培养在最小的中等加补充过夜。当 595 纳米的光密度在 0.7 和 1 之间时，细胞生长被认为是晚对数阶段。
接下来，从晚日志培养物获得500微升各配合型菌株，H阴性与H阳性，并结合使一毫升细胞悬浮。将细胞以1，375倍g离心一分钟。取出上清液，将颗粒重新在一毫升液体麦芽糖提取物中。
重复麦芽糖提取物再洗三次，以确保有效的营养去除。最后麦芽糖提取物洗涤后，将细胞重新倒入一毫升麦芽糖提取物中，将混合物转移到含有9毫升麦芽糖提取物的50毫升烧瓶中。在 22 至 25 摄氏度的最小转速下孵育 12 至 16 小时，转速在 50 至 100 rpm 之间。
大量自絮产生的圆形裂变酵母团的出现表明有效的交配。接下来，以1，375次g的1，375倍g进行1毫升的交配培养，并离心机一分钟。取出750微升的上一液，并重新暂停剩余的上一液中的细胞。
漩涡大力五秒钟，以扰乱团块。在2%的阿加罗斯垫上分配20微升的线粒体或美的细胞悬浮液。通过反转幻灯片并将其放在无绒纸巾顶部两到三秒钟，去除多余的介质。
翻转幻灯片，轻轻将玻璃盖玻片放在垫的顶部，确保不会产生气泡。创建一个细胞单层顺时针旋转盖玻片用食指一个完整的转弯的分裂细胞或两个全转的梅病细胞。确保细胞物质分散在阿加罗斯垫上，从而更好地分离单细胞或阿西。
借助一根小木棒，沿盖玻片边缘分配熔融碳氢化合物密封剂，以密封每个芳油垫。一旦阿加罗斯垫被密封，就把它放在显微镜台上。打开温度室并设置为所需温度。
将带湿纸巾的盘子放入室内，以控制显微镜系统的湿度。让它在适当的成像条件下平衡 10 到 15 分钟。这允许任何剩余的气泡消散，并且任何最后一分钟的气糖转移都会发生。
使用 40 倍目标查找适当的图像视野。切换到 60 倍目标，开始数据采集。在控制显微镜功能的软件中，选择与观测中荧光波最匹配的显微镜过滤器集。
调整激发波长以匹配使用的荧光团，使用产生一致信号的最低激发功率，并使用四到八小时的曝光时间生成可接受的可量化和可重复的成像数据。每小时至少收集六个采集时间点。在图像采集软件中，选择至少一个荧光通道来获取数据，并采用由 13 个节组成的 Z 股，间距为 0.5 微米。
在斐济软件中，通过选择插件菜单下的"生物格式导入程序"功能上传已解构的图像。在"导入选项"弹出窗口中，选择"超级堆栈""默认颜色模式"，选中"自动缩放"并按"确定"按钮。通过侧向滚动底部各条，确保显示的窗口具有正确的荧光通道和时间范围数。
保存为不压缩数据的 Tiff 文件。然后在"分析"菜单下使用"设置测量"选项选择不同的参数。例如:面积、最小最大灰色值、集成密度、平均灰色值、中位数、堆栈位置、周长和显示标签。
选择"颜色"并单击"通道工具"。在"通道"弹出窗口中，检查将测量强度或面积的颜色通道。选择"图像"，然后键入并单击 32 位。
选择"图像"菜单下的"调整"和"阈值"功能。选中"深色背景"框，选择"默认"方法，然后选择"红色"以覆盖感兴趣的信号。使用魔杖工具突出显示每个感兴趣的结构，然后按键盘上的字母 T 将所选 ROI 添加到弹出式 ROI 管理器窗口中。
接下来，打开压缩的 ROI 文件夹以加载 ROI 管理器，然后单击左侧面板中的每个 ROI 标识符。从"分析"菜单中选择"度量"，并在每个 ROI 标识符上重复此命令，以量化图像堆栈所有切片中感兴趣的对象。将结果另存为 CSV 文件，用于统计分析。
在这项研究中，如果细胞因营养限制或过度生长而挨饿，它们将显示过多的真空和细胞大小的减小。对数细胞显示活性DNA复制和细胞分裂，以及泛核 Tos4-GFP 表达和Sd1-DsRed foci分离。如果交配失败，就像细胞没有足够的氮气时一样，会阻止它们进入脑膜。
显示了一对进行卡约加米的裂变细胞。交配细胞悬浮液的强健的絮凝增加细胞对细胞的相互作用，从而表明成功的交配和高效的美的诱导。Zygotic asci 具有多种形式，包括锯齿形和香蕉细胞形状。
在细胞从元相过渡到telophase时，第一个变化涉及元相核大小的收缩，而第二个变化则显示核在相位期间分裂。除了与线粒体细胞共享一些分离动力学外，在同源重组期间，美的细胞表现出核振荡，在相相II.It结束时进一步减少核苷酸，研究人员有责任确保实验参数能够在整个实验中重现，并且收集的数据适合下游分析。活细胞成像使研究者能够仔细研究分粒和脑膜的核分裂机制。
随着荧光标签和显微镜功能的改进，我们可以观察到的过程的数量和类型将增加。
