Homodimeric PROTACs Cereblon ilk kimyasal inhibitörleri ve daha fazla talidomid analogların moleküler mekanizması açıklığa kavuşturmak için yardımcı olabilir, hem de Cereblon fizyolojik işlevini araştırmak için. Bu yeni PROTAC platformu teknolojisi, özellikle takip edilemeyen olarak kabul edilen ilgi proteinlerini hedeflemek için son derece yararlı olabilir. CRBN inhibisyonu tek başına anti-tümör aktivitesi yoktur.
Ancak, CRBN bozunanobezite, bulaşıcı hastalıklar ve diğer hastalıklarda klinik etkileri olabilir. Sentez zorlu ve bir PROTAC bileşiği tasarlarken etkili protein bozunur oluşturmak için optimum bağlayıcılar ve eki bulmak zor. Başlamak için, 100 mililitre lik yuvarlak dipli bir şişeye 2,46 gram Boc korumalı L-glutamin ve 50 mililitre tetrahidrofuran yerleştirin ve bir dakika boyunca 800 rpm'de karıştırın.
Sonra, 1 1 gram, 1'karbonildiimidazol ve 4-piridin bir katalitik miktarda ekleyin. Glutimid bileşiğin net renksiz çözeltisi elde etmek için reflü de 10 saat karıştırmaya devam edin. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve çözücüyciyi döner buharlaştırıcı ile çıkarın.
Etil asetat 200 mililitre kalıntı redissolve ve ayırıcı huni içine dökün. Organik katmanı 50 mililitre deiyonize su ve salamura ile yıkayın ve organik katmanı sodyum sülfat üzerine kurulayın. Yerçekimi desiccant kaldırmak için silika jel ile çözüm filtre, ve sonra etil asetat 200 mililitre ile silika jel durulayın.
Renksiz bir katı olarak Bileşik 1 elde etmek için vakum altında filtrasyon solvent çıkarın. Kullanmadan önce ürünü bir gecede vakum altında kurulayın. Sonra, bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir 100 mililitre yuvarlak alt şişe de buzul asetik asit 20 mililitre sodyum asetat 0.50 gram çözün.
3-floroftalans anhidrit 1.25 gram ve glutarimid 1.14 gram ekleyin ve Bileşik 3 mor bir çözüm elde etmek için altı saat reflü karıştırın. Karışımı oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve sonra deiyonize su 100 mililitre içine dökün ve Bileşik 3 çökelti için 10 dakika karıştırın. Filtrasyon ile katı toplamak, su ve petrol eter ile yıkayın ve iki gün boyunca vakum altında kurulayın.
Sonra, 50 mililitrelik Schlenk şişesine 0,83 gram Bileşik Üç ve 20 mililitre kuru dimetil sülfoksit yerleştirin ve iki dakika karıştırın. Alfa omega diamin bağlayıcı Bileşik 0.22 gram ekleyin 6, ve N mililitre, N-diisopropiletiltilemin ve argon altında karışımı karıştırın 90 santigrat derece için 18 saat boyunca homodimer elde etmek 8 koyu yeşil karışımı. Karışımı oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve 100 mililitre deiyonize suya dökün.
Etil asetat üç 50 mililitre porsiyon içine ürün ayıklayın, organik katmanları birleştirmek ve 50 mililitre su ve salamura her onları yıkayın. Yıkanmış organik katmanı sodyum sülfat üzerine kurutun, kurutucuyu filtreleyin ve vakum un altındaki çözücüü çıkarın. Kalıntıyı en az miktarda kromatografi çözücüde çözün ve saflaştırma için silika jel kolona uygulayın.
Floresan ürün fraksiyonları toplamak, bunları birleştirmek ve sarı bir katı olarak Homodimer 8 elde etmek için çözücü kaldırın. Başlamak için, 100 mililitre yuvarlak alt şişede dimetilformamid 25 mililitre Glutarimid 1 2.28 gram çözünür. Bu çözeltide 2,76 gram öğütülmüş potasyum karbonatı askıya alın.
Daha sonra, 20-gauge iğne ile donatılmış bir şırınga içine iyodometan 0,62 mililitre çizin. 10 saniye boyunca iyodometan damla-bilge ekleyin. Stopper bir lastik septum ile şişe, ve bir havalandırma iğnesi ekleyin.
Glutarimide Bileşik 2 elde etmek için oda sıcaklığında iki saat boyunca karışımı sonicate. Karışımı 50 mililitre etil asetat ile seyreltin ve ayırıcı bir huniye dökün. Şişeyi 50 mililitre daha etil asetatla huniye durulayın.
Ürünü çalıştırın ve renksiz bir katı olarak Glutimid 2 elde etmek için silika jel sütun kromatografisi ile arındırın. N-metilasyonun başarılı olduğunu doğrulamak için Glutimid Bileşikleri 1 ve 2'nin bekletme sürelerini karşılaştırın. Doğrulamaya başlamak için, birden fazla miyelom hücrelerini ilgi çekici bileşiklerle tedavi edin.
İlgili proteinleri izole edin ve protein yıkımının Batı Leke analizi için numuneler hazırlayın. Daha sonra, SDS-PAGE için bir jel sandviç hazırlayın ve anod tampon tankını pH 8.9 tris-HCl çözeltisi ile doldurun. Jel içine protein örnekleri yükve 20 dakika boyunca 70 Volt çalıştırın, 150 dakika boyunca 115 volt takip.
Daha sonra, immünoblotting için 1x transfer tampon ulayın ve dikkatle dengelemek için transfer tampon için kasetten jel taşıyın. Jeli denge için kasetten çıkarırken çok dikkatli olmalısın, çünkü çok hızlı bir şekilde patlayabilir ve buruşabilir. 0.45 mikrometrelik poliviniliden diflorit membranını saf metanolde en az 20 saniye boyunca aktif hale getirin ve 1x transfer tamponuna batırın.
Jel ve membran 10 dakika boyunca dengesağlar. Daha sonra, Batı Blotting kasetmonte ve membran proteinleri aktarmak için 90 dakika boyunca 180 miliamperes uygulayın. Daha sonra, immünoboyama ile proteinleri görselleştirin.
Hücre canlılığı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, ilk olarak, tohum 50, 000 multipl miyelom hücreleri biyolojik triplicate bir 96 iyi plaka iyi başına. DMSO veya Bileşik 8, Bileşik 9 veya pomalidomid 0.1, bir veya 10 mikromolar içeren medya her iyi 100 mikrolitre ekleyin. Hücre canlılık kurtarma deneyi gerçekleştirmek için, bunun yerine üç saat boyunca, pomalidomid bir mikromolar çözeltisi ekledikten sonra, üç saat boyunca Bileşik 8 100 nanomolar çözüm ile hücreleri tedavi.
Hücreleri %5 karbondioksit atmosferinde 37 derecede 24, 48 veya 96 saat kuluçkaya yatırın ve canlılığı Parlak bir tözle ölçün. Homodimerik PROTAC 8'in yapısı proton ve karbon NMR ile doğrulandı. Heterodimerik PROTAC 9 negatif kontrol olarak sentezlendi, glutarimide kısmı içinde N-metilasyon Cereblon kaybı ile sonuçlanır gibi, veya CRBN, bağlama yeteneği.
Homo PROTAC 8 lenfoid transkripsiyon faktörleri IKZF1 ve IKZF3 üzerinde minimal etkileri ile tam proteozomal CRBN yıkımı yakın indüklenen. Buna karşılık, hetero PROTAC 9 pomalidomides benzer davranış gösterdi. Bileşik 8 indüklenen CRBN bozunması proteozomun doğrudan inhibitörü tarafından engellenebilir veya dolaylı olarak netilasyon inhibisyonu tarafından engellenebilir.
Bileşik 8 ile önceden tedavi edilen hücreler pomalidomidin IKZF1 ve IKZF3 üzerindeki etkilerine önemli ölçüde direndi. Bileşik 8 indüklenen CRBN bozulması, 96 saat sonra bileek 9 ve pomalidomidden IKZF3 bozulmasına göre multipl miyelom hücre canlılığı üzerinde çok daha az etkiye sahipti. Bileşik 8 ile ön tedavi edilen multipl miyelom hücreleri pomalidomide maruz kaldığında tedavi edilmeyen hücrelere göre önemli ölçüde daha fazla canlılığa sahipti, bu da Bileşik 8'in immünmodülatör IMiD ilaç direncini taklit etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Biz Bileşik 8 Cereblon tam proteazomal bozulma neden olduğunu bulundu, IKZF1 ve IKZF3 hücre canlılığı ve çoğalması üzerinde hiçbir yan etkisi yoktur. Proje teknolojisinin diğer hedeflere genişletilmesi, kanser ve diğer hastalıklarla ilgili proteinlerin etkisiz hale ilmesi ve izlenmesi potansiyeline sahiptir. Bu tekniği diğer ilaçlar ve proteinler için uyarlarken, en uygun bağlantıları ve ekleri seçmek için ilacın moleküler yapılarını ve protein hedefini dikkatle araştırmalıdır.
MiDs Cereblon bir nokta mutasyonu nedeniyle farelerde çalışmaz, ancak daha fazla hayvan çalışmaları için kullanılabilecek bir transgenik knock-in fare modeli vardır. Pomalidomid analog talidomid olduğundan, yüksek oranda teratojeniktir, bu ilaçlarla çalışan hamile kadınları önermiyoruz.
