K.M.R, S.D.M, M.U. ve D.L.D, Promega Corporation'ın tüm çalışanlarıdır.

1. HiBiT CRISPR ile uç nokta bozunma çalışmaları, isteğe bağlı hücre canlılığı floresan analizi ile litik formattaki proteinleri hedefler
<ol><li>Memeli yapışkan veya süspansiyon hücre hattının hazırlanması ve kaplanması<ol><li>Pasaj ve hücre büyümesi için kullanılan uygun hücre ortamında seyreltme ile hücre yoğunluğunu 2,22 x 105/mL'ye ayarlayın.</li>
		<li>Hücreleri, deney ve kontrol koşulu başına en az 3 kuyucuklu plakalara dağıtın. Hücre süspansiyonunun kuyusu başına 90 μL (20.000 hücre) 96 delikli beyaz plakalara dağıtın. 384 delikli format için, hücre süspansiyonunun kuyusu başına 36 μL (8.000 hücre) 384 delikli beyaz plakalara dağıtın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşiklerin hazırlanması ve eklenmesi<ol><li>Seri olarak seyreltilmiş PROTAC veya degrader test bileşiği plakalarını% 100 DMSO'da 1.000x nihai konsantrasyonda hazırlayın. Daha sonra hücre kültürü ortamında 10x nihai konsantrasyona seyreltin. Bileşiksiz DMSO kontrolü olarak kullanılmak üzere ortama eşit hacimde DMSO ekleyin.</li>
		<li>96 kuyucuklu format için 90 μL hücreye 10 μL 10x bileşik ve kontrol solüsyonları ekleyin. 384 kuyucuklu format için 36 μL hücreye 4 μL 10x bileşik ve kontrol solüsyonu ekleyin.</li>
		<li>Plakaları bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de istenen süre boyunca veya büyümeleri için en uygun koşullarda inkübe edin. NOT: Bu bir uç nokta testi olduğundan, birden fazla zaman noktasının test edilmesi, yukarıdaki adım 1.1.2'de açıklandığı gibi, her zaman noktası için ayrı bozunma plakalarının hazırlanmasını gerektirecektir. Bileşik aracılı bozunmayı tespit etmek için kuluçka süreleri oldukça değişkendir ve muhtemelen bileşik konsantrasyonuna da bağlıdır. Önerilen başlangıç zaman noktaları 6 saat ve 24 saat olacaktır.</li>
		<li>İsteğe bağlı hücre canlılığı ölçümü olmadan uç nokta ışıldayan algılamasını ölçüyorsanız, doğrudan aşağıdaki adım 1.3'e geçin. Hücre canlılığı ölçümü ile çoklama yapıyorsanız, aşağıdaki bir sonraki bölüm 1.4'e geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücrelerin litik ölçümü<ol><li>HiBiT litik ölçümlerinden hemen önce, litik tamponun her 1 mL'si başına 20 μL litik substrat ve 10 μL LgBiT proteini ekleyerek 2x litik algılama reaktifi hazırlayın. Pipetleme hatasını hesaba katmak için ekstra hacim de dahil olmak üzere test edilecek kuyu sayısı için yeterli sayıda 2x algılama reaktifi hazırlayın (yani, kuyu sayısı +% 10).</li>
		<li>Hücrelere hazırlanmış litik tespit reaktifi ekleyin. 96 kuyucuklu format için, 100 μL hücre içeren her bir kuyucuğa 100 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. 384 kuyucuklu format için, 40 μL hücre içeren her bir kuyucuğa 40 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. Plakayı bir mikro plakalı vorteks karıştırıcı üzerinde 350 rpm'de 10-20 dakika boyunca karıştırın.</li>
		<li>96 veya 384 kuyucuklu bir plakadaki lüminesansı okuyabilen bir luminometre üzerinde lüminesansı ölçün.</li>
	</ol></li>
	<li>İsteğe bağlı hücre canlılığı çoklaması NOT: Bu adım, piyasada satılan bir CellTiter-Fluor (CTF) kiti kullanılarak gerçekleştirilir (bkz.<ol><li>İstenilen son nokta ölçümünden 30-40 dakika önce, tahlil Tamponunun 2 mL'sine 10 μL substrat ekleyerek 6x hücre canlılığı algılama reaktif çözeltisi hazırlayın. Pipetleme hatası için ekstra hacim de dahil olmak üzere test edilecek her kuyu için yeterli 6x reaktif hazırlayın (yani, kuyu sayısı +% 10).</li>
		<li>Hazırlanan reaktifi kuyucuklara ekleyin. 96 delikli format için, zaten 100 μL hacim içeren her bir kuyucuğa 20 μL 6x reaktif ekleyin. 384 kuyucuklu format için, 40 μL hücre içeren her bir kuyucuğa 8 μL 6x reaktif ekleyin. Bir mikroplaka vorteks karıştırıcısında kısaca karıştırın, ardından plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>İstenilen ölçüm bitiş noktasında (yani, 6 veya 24 saat işlem sonrası, adım 1.2.3), floresanı (380-400nmEx / 505nmEm) 96 veya 384 kuyu formatında okuyabilen bir cihazda floresan ölçün.</li>
		<li>1 mL litik tampon başına 20 μL litik substrat ve 10 μL LgBiT proteini ekleyerek 2x litik tespit reaktifi hazırlayın. Pipetleme hatasını hesaba katmak için ekstra hacim de dahil olmak üzere, test edilecek kuyu sayısı için yeterli sayıda 2x algılama reaktifi hazırlayın (örneğin, kuyu sayısı + %10).</li>
		<li>Hazırlanan litik tespit reaktifini kuyucuklara ekleyin. 96 kuyucuklu format için, zaten 120 μL hacim içeren her bir kuyucuğa 120 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. 384 kuyucuklu format için, zaten 48 μL hacim içeren her bir kuyucuğa 48 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. Plakayı bir mikroplaka vorteks karıştırıcısında 10-20 dakika karıştırın.</li>
		<li>96 veya 384 kuyu plakalarındaki lüminesansı okuyabilen bir luminometre üzerinde lüminesansı ölçün.</li>
	</ol></li>
	<li>Bozunma ve hücre canlılığının ölçülmesi<ol><li>Ölçülen zaman noktasında DMSO kontrolünden gelen göreceli ışık birimlerinin (RLU) ortalaması. Bu değeri, aynı anda test edilen diğer tüm tedavileri normalleştirerek fraksiyonel bozulmayı hesaplamak için hedefin temel protein seviyesi olarak kullanın. Örneğin, 6 saatte DMSO kontrol kuyuları için ortalama RLU 10.000 ve 6 saatte belirli bir bileşik işlem için RLU 5.000 ise, fraksiyonel bozulma 5.000 ÷ 10.000 = 0.5 olarak hesaplanacaktır (Denklem 1). Denklem 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Fraksiyonel RLU'dan yüzde bozulmasını belirleyin: Denklem 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>Bileşiklerin aktivitesini sıralamak için belirli zaman noktalarında fraksiyonel RLU veya % bozunmayı çizin.</li>
		<li>İsteğe bağlı olarak, tüm tedavilerden elde edilen değerleri DMSO kontrolüyle karşılaştırarak hücre canlılığı testi ölçümü için göreceli floresan birimi (RFU) verilerini analiz edin. DMSO kontrolüne göre herhangi bir tedavi için RFU'da önemli bir düşüş gözlenirse, bozulma verileri, hücre canlılığındaki kayıplara göre protein seviyesindeki değişiklikleri belirlemek için hücre canlılığı testi verilerine ek olarak normalleştirilebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. HiBiT CRISPR hedef proteinlerinin gerçek zamanlı kinetik bozunması ve isteğe bağlı hücre canlılığı lüminesans testi
NOT: Kinetik tarama ve bozunma yapabilme yeteneği, hücrede daha önce 18,19,63 olarak tanımlanan LgBiT protein ko-ekspresyonunu gerektirir. Bu, bir LgBiT vektörünün geçici transfeksiyonu, BacMam LgBiT kullanımı veya bir LgBiT kararlı hücre hattına HiBiT CRISPR yerleştirme işlemi gerçekleştirilerek elde edilebilir.
<ol><li>Yapışkan hücre hatlarının kaplanması.<ol><li>Aspirasyonla hücre şişesinden ortamı çıkarın, hücreleri DPBS ile yıkayın,% 0.05 tripsin-EDTA ile hücreleri ayırın ve hücrelerin şişe tabanından ayrışmasına izin verin. Süspansiyon hücresi hatları için bölüm 2.2'ye geçin.</li>
		<li>Serum içeren hücre kültürü ortamını kullanarak tripsini nötralize edin, hücreleri toplamak ve yeniden askıya almak için karıştırın ve hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 125 x g'de döndürün. Hücre kültürü ortamını atın ve eşit hacimde taze hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın.</li>
		<li>Deney ve kontrol koşulu başına en az üçlü kuyucuklara sahip tahlil plakalarına plaka hücreleri. Hücre yoğunluğunu tahmin etmek için 96 kuyucuklu format sayımı için, yoğunluğu tahlil ortamında 2 x 105 hücre / mL'ye ayarlayın ve 96 delikli bir plakada kuyucuk başına 100 μL (20.000 hücre) dağıtın. Hücre yoğunluğunu tahmin etmek üzere 384 kuyucuklu format sayımı için, tahlil ortamında yoğunluğu 4,44 x 105 hücre/mL'ye ayarlayın ve kuyucuk başına 18 μL (8.000 hücre) dağıtın.</li>
		<li>Plakaları 37 °C'de, gece boyunca% 5 CO2'de veya büyümeleri için en uygun koşullarda inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Süspansiyon hücrelerinin kaplanması<ol><li>%10 FBS ve 1x Endurazin (stok reaktifinin 1:100 seyreltilmesi) ile desteklenmiş CO 2'den bağımsız ortamda hücre yoğunluğunu2,22 x 105 hücre/mL'ye ayarlayın.</li>
		<li>Plaka hücreleri, deney ve kontrol koşulu başına en az 3 kuyucuklu tahlil plakalarına dönüştürür. 96 kuyucuklu format için kuyu başına 90 μL (20.000 hücre) dağıtın. 384 kuyucuklu format için kuyu başına 36 μL (8.000 hücre) dağıtın. NOT: Arka plana (S:B) düşük sinyalli (S:B) lüminesansı olan süspansiyon hücre hatları için, örneğin klonlar yerine CRISPR havuzlarıyla çalışırken, kaplanan hücre sayısını, 96 kuyucuklu formatta 100.000 hücreye/kuyuya veya 384 kuyucuklu biçimde 40.000 hücreye/kuyuya kadar artırarak lüminesansı artırmak mümkündür.</li>
	</ol></li>
	<li>LgBiT'yi eksprese eden HiBiT CRISPR hücrelerini kullanarak kinetik bozunma testleri<ol><li>2.2.'deki kaplama adımına dahil edilen Endurazin içeren süspansiyon hücreleri için, doğrudan adım 2.3.3'e geçin. Yapışkan hücre hatları için Nano-Glo Endurazin çözeltisi hazırlayın. 96 kuyucuklu format için, stok reaktifi 1:100'ü% 10 FBS ile desteklenmiş CO2'den bağımsız ortama seyrelterek 1x Endurazine çözeltisi hazırlayın. 384 kuyucuklu format için, stok reaktifi 1:50'yi% 10 FBS ile desteklenmiş CO 2'den bağımsız ortama seyrelterek2x Endurazine çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Endurazin çözeltisini yapışkan hücrelerin her bir kuyucuğuna ekleyin. 96 delikli format için aspirasyon ortamı ve 90 μL 1x Endurazin çözeltisi ekleyin. 384 kuyucuklu format için, 18 μL hücreye 18 μL 2x Endurazin çözeltisi ekleyin. Bozunma testi, 384 delikli formatta 50:50 kültür ortamı ve CO2 bağımsız ortam karışımında gerçekleştirildiği için ortamı aspire etmeyin.</li>
		<li>Lüminesansın dengelenmesini sağlamak için bir inkübatörde 2,5 saat boyunca Endurazin içeren süspansiyonu veya yapışkan hücre plakalarını 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
		<li>CO2'den bağımsız ortamda 10x konsantrasyonda test PROTAC titrasyonu hazırlayın ve 96 delikli plakanın her bir haznesine 10 μL veya 384 delikli plaka için 4 μL ekleyin. Etkinliği bilinmeyen bileşikler için, başlangıç noktası olarak en yüksek noktada 1-10 μM'lik bir son konsantrasyon önerilir.</li>
		<li>0-48 saat arasında bir süre boyunca 37 ° C'ye önceden dengelenmiş luminometrede kinetik lüminesans ölçümlerini toplayın. Ölçümün zaman artışları her deney için özelleştirilebilir, ancak önerilen bir ilk deney, 24 saat boyunca her 5-15 dakikada bir veya istenen miktarda lüminesans ölçümleri olacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Son kinetik ölçümden sonra opsiyonel hücre canlılığı aynı kuyucuklu multipleks analizi NOT: Bu tahlil, piyasada satılan bir CellTiter-Glo (CTG) kiti ile gerçekleştirilir (bkz.<ol><li>CTG reaktifini oda sıcaklığına dengeleyin.</li>
		<li>Kinetik analizin son zaman noktasında bozunma ölçümünü takiben, plakanın kuyucuğu başına 100 μL (96 delikli plaka) veya 40 μL (384 kuyucuklu plaka) ilave edin ve 5 dakika boyunca 500-700 rpm'de (96 delikli plaka) bir plaka çalkalayıcıda veya bir mikroplaka vorteks karıştırıcısında (384 delikli plaka) karıştırın.</li>
		<li>Hücre lizisine ve HiBiT sinyalinin söndürülmesine izin vermek için plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Üreticinin tavsiyesine uyarak bir luminometredeki toplam parlaklığı ölçün.</li>
	</ol></li>
	<li>Kinetik bozunma profillerinin nicelleştirilmesi<ol><li>Toplanan kinetik lüminesans ölçümlerini kullanarak, zaman içinde serbest furimazin konsantrasyonundaki değişiklikleri hesaba katmak için her bir PROTAC konsantrasyonu için ham RLU'ları her zaman noktasında replika ortalaması DMSO koşuluna normalleştirin. Denklem 1'i kullanarak Kesirli RLU'yu hesaplayın. Denklem 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Bozunma eğrilerinden, Denklem 2'yi kullanarak tek bileşenli üstel bozunma modelini, her eğrinin ilk bozunma kısmına, verilerin bir platoya ulaştığı noktaya kadar sığdırın. NOT: Bozulma gözlenmeden önce kısa bir gecikme olabileceğinden, ilk birkaç veri noktasını sığdırmanın dışında tutmak yararlı olabilir. Denklem 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>Denklem 2'den, bozulma hızı sabitini temsil eden ƛ parametresini ve kalan en düşük protein miktarını temsil eden Plato parametresini belirleyin.</li>
		<li>Parçalanan proteinin maksimum fraksiyonel miktarı olan ve 1-Plato olarak hesaplanan Dmax'ı hesaplayın.</li>
		<li>Zamandan bağımsız bir bozunma potens eğrisi belirlemek için her bir PROTAC konsantrasyonu için Dmax'ı çizin.</li>
		<li>Bileşiklerin etkinliğini analiz etmek için 2.3.5'teki arsa için Dmax50 değerini belirleyin. NOT: Belirli bir zaman noktasında bir DC50 belirlemek için, seçilen zamanda her konsantrasyon için hesaplanan yüzde bozunmasını çizin. Bu, DC 50 t=4 h veya DC50 t=12 h olarak belirtilebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Promega Corporation, HiBiT ve NanoLuc teknolojilerinin ve uygulamalarının patentlerinin atanmasıyla ticari sahibidir.

Burada, ekstrem bileşik aktivitesini sonlanım noktası litik formatında veya canlı hücre kinetik modunda taramak için iki yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşımlar aynı ışıldayan ölçüm prensiplerine dayanır, ancak farklı ayrıntı ve anlayış seviyeleri sağlar. Her iki yaklaşımın seçimi de muhtemelen tarama hedeflerine ve bileşik kütüphanenin boyutuna bağlı olacaktır. Büyük bileşik tarama güverteleri veya birincil eleklerin tespit edilebilir herhangi bir bozulmayı gözlemlemesi için, uç nokta litik tarama, batı lekesi veya kütle spektrometresi gibi diğer uç nokta yaklaşımlarının pratik olmadığı veya uyarlanmasının zor olabileceği hassas ve verimli yüksek verimli uyumluluk sunar14. Bu ekranlar için bir başlangıç noktası, sınırlı sayıda konsantrasyon ve zaman noktası ile gerçekleştirilebilir. Test etmek için önerilen başlangıç konsantrasyonları, düşük potansiyele, zayıf geçirgenliğe sahip veya bazı durumlarda yüksek etkili bileşiklere sahip ilk bozundurucuları hesaba katmak için 100 nM-10 μM aralığındadır. Ayrıca, 4-6 saatte erken başlangıçlı bozunmayı ve 18-24 saatte gizli veya sürekli bozulmayı sağlamak için en az iki farklı zaman noktasının test edilmesi önerilir. Yüksek bozunma potansiyeli ve hedef üzerinde mekanizma sergileyen bileşikler 4-6 saatlik bir zaman diliminde kolayca gözlenirken, sadece daha sonraki zaman noktalarında gözlenen bozulma veya görünür protein kaybı çeşitli mekanizmalardan kaynaklanabilir. Hücre canlılığının hem erken hem de geç zaman noktalarında izlenmesi şiddetle tavsiye edilir, böylece protein kaybı hücre ölümüne bağlı kayıptan ayrılabilir. Herhangi bir ışıldayan veya floresan tahliline benzer şekilde, kütüphanelerdeki bileşiklerin sinyale müdahale etme veya inhibe etme potansiyeli vardır, bu nedenle, ilgisiz füzyonlar veya protein seviyesini izlemeye alternatif yaklaşımlar kullanan kurşun bileşikleri ile ortogonal takip deneyleri, bu tahlillerde RLU kaybının doğrudan hedef protein bozulması ile ilişkili olduğunu değerlendirmek için önemli olacaktır.
Uzun süreler boyunca canlı hücre kinetik formatında tarama yeteneği, arka plana yapılan tahlil sinyaline (S: B) büyük ölçüde dayanır. S: B'ye katkıda bulunan faktörler, hedef proteinin kendisinin ekspresyon seviyesini, birkaç büyüklük sırasını kapsayabilen ekspresyon seviyesini, peptid yerleştirilmesi için seçilen hücre hattındaki LgBiT ekspresyonunun verimliliğini, ve çeşitli yerel komplekslerinde tamamlama için etiketli hedefin kullanılabilirliği. Kinetik moddaki bozulmayı Endurazin veya Vivazine ile başarılı bir şekilde ölçmek için 15'lik bir S: B'den oluşan genel bir kesme gereksinimi belirledik. S: B, Endurazin veya Vivazine canlı hücre substratlarının varlığında tek başına LgBiT'yi eksprese eden düzenlenmemiş ebeveyn hücrelerine göre LgBiT'yi birlikte eksprese eden HiBiT düzenlenmiş hücrelerin taban çizgisi sinyalinin ölçülmesiyle belirlenir. Vivazine daha yüksek bir ışıldayan sinyal üretecek, ancak Endurazine'den daha hızlı bozunacak ve sinyal alımını 24 saat veya daha kısa bir süre ile sınırlayabilir. Ayrıca, S: B, CRISPR havuzlarının mı yoksa klonların mı kullanıldığına da büyük ölçüde bağımlı olabilir. CRISPR / Cas9 mühendisliği için daha uygun ve yüksek verimliliğe sahip hücre hatlarındaki hedefler için, düzenlenmiş hücrelerin heterojen bir CRISPR havuz popülasyonu, kinetik analiz için yeterli S: B'ye sahip olabilir. CRISPR aracılığıyla daha az verimli genomik entegrasyonun düşük S: B'li havuzlarla sonuçlandığı daha zor hücre hatlarındaki hedefler için, düzenlenmiş popülasyonları zenginleştirmek ve kinetik analiz için yeterince yüksek bir S: B elde etmek için CRISPR klonlarını izole etmek gerekebilir. Bu senaryolardan herhangi biri için, S: B, Endurazin veya Vivazine substratları ile 15'ten küçükse, son nokta litik taraması önerilir.
Kantitatif parametrelerle bir bozunma profilinin belirlenmesi de dahil olmak üzere bileşiklerin daha iyi anlaşılması ve karakterizasyonu için, canlı hücrelerde gerçek zamanlı kinetik analiz önerilen tarama yaklaşımıdır14,18. Yukarıda tartışılan son nokta analizi gibi, ilk kinetik tarama, yüksek verimli bir şekilde 100nM-10μM aralığında sınırlı sayıda konsantrasyonla yapılabilir. 384 kuyucuklu formatta, 100'den fazla bileşik, tek bir plaka üzerinde bir konsantrasyonda üçlü olarak kolayca taranabilir. Ortaya çıkan bozunma profilleri sadece gözlemlenen bozulmanın kapsamı hakkında değil, aynı zamanda bozulma oranı, bozulma süresi ve protein 14,18'in potansiyel geri kazanımı konusunda da rehberlik sağlayacaktır (Şekil 2 ve Şekil 3). Bozunma profilinin şekilleri de değerli bilgiler verir. Spesifik ve güçlü bozunucular genellikle hedef proteinin birkaç saat içinde bir platoya hızlı bir şekilde kaybolduğunu gösterir18,53, oysa transkripsiyonel geri besleme veya bileşik toksisite gibi diğer mekanizmalar tipik olarak proteinin zamanla daha doğrusal kaybına neden olur. Bu detaylar ve nüanslar, uç nokta litik analizi ile kaçırılır ve 24-48 saat boyunca gerçek zamanlı analizle, yeni veya bilinmeyen bileşik kümeleri içinde gerçek Dmax'ı yakalama zamanını tahmin etmek zorunda kalmazsınız.
Gerçek zamanlı kinetik, bileşik etkinliğini, bileşik konsantrasyonunun ilk bozunma oranını nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için etkili doz yanıtı taramasına izin verir ve bileşikleri birden fazla parametreye göre sıralama olanakları sunar. Klasik bozunma potansiyeli ölçümleri, görünür bozunma maksimumuna dayanan belirli bir zamanda DC50 hesaplamalarını içerir. Buna karşılık, potensi değerlendirmek için kinetik yaklaşımımız,18. zamanda ne zaman meydana geldiğine bakılmaksızın her konsantrasyonda gerçek bozulma maksimumunu içerir. Kinetik bozunma potansiyelinin bu ölçümüne Dmax5018 diyoruz. Bu şekilde analiz, daha düşük konsantrasyonlarda bozulmayı daha yavaş başlatabilen ve bu nedenle Dmax'larına ulaşmak için işlem sonrası daha uzun zaman alabilen bileşikleri açıklar. Bileşikleri hem bozunma hızına hem de Dmax'a göre sıralamak özellikle bilgilendirici olabilir. En güçlü bozundurucular için bu, yavaş ama güçlü bozucuları hem hızlı hem de güçlü olanlardan daha da farklılaştıracaktır. Birlikte, HiBiT CRISPR hücre hatlarını kullanan hem litik hem de canlı hücre kinetik taraması, hedeflenen protein bozunumunun, bileşik fonksiyonunun daha kapsamlı bir resmini veren ve anahtar bozunma parametrelerinin iyileştirilmesi yoluyla ilk aktivite değerlendirmesinden aşağı akış kimyasal optimizasyonuna kadar tarama sürecini sağlayan güçlü yaklaşımlardır.

Hedeflenen protein bozunması, kanser tedavisi için immünomodülatör moleküler yapıştırıcı bileşiklerinin (örneğin, IMiD) terapötik başarısı ve Chimera bileşiklerini hedefleyen Proteoliz 1,2,3,4,5,6,7,8'in umut verici erken klinik çalışma verileriyle büyük ölçüde desteklenen, küçük moleküllü ilaç keşfinde en hızlı büyüyen alanlardan biri olarak ortaya çıkmıştır. 9,10,11,12. Hedeflenen protein bozunma bileşikleri, E3 ligaz makinesi proteinleri 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ile bir hedef proteini yakınlaştırarak işlev görür . Hedef proteinin E3 ligazına bu bileşik kaynaklı alımı, ubikitin proteazomal yolu (UPP) 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 yoluyla hedef protein ubikitinasyonuna ve bozulmasına yol açar. . Tarihsel olarak, küçük moleküllü ilaç keşif tarama programları, aktiviteyi değerlendirmek ve bileşikleri sıralamak için ilk biyokimyasal testlere güvenmiştir. Bununla birlikte, bu, nihai aktivitesi, proteazom yoluyla bozunma, hücresel olayların bir kaskadına bağlı olan hedeflenen protein bozunumcuları için önemli bir zorluk ortaya koymuştur 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. Başarılı hedef bozunması için gerekli olan protein komplekslerinin çoklu yolları ve karmaşıklığı, ilk bileşiklerin erken taranması ve önceliklendirilmesi için hücresel analiz yaklaşımlarını gerektirmektedir. Şu anda, hücresel ortam bağlamında hedef protein bozulmasını yüksek verimli bir şekilde izlemek için teknolojilerin mevcudiyeti ciddi şekilde eksiktir14. Burada, CRISPR / Cas9 endojen olarak etiketlenmiş HiBiT hedef hücre hatları 18,19,20 kullanılarak gerçek zamanlı kinetik canlı hücre veya son nokta litik bozunma aktivitesi değerlendirmesi için protokoller sunacağız ve 10,11,18,19 degrader bileşikleri ile tedaviden sonra ışıldayan ölçüm yoluyla hedef proteinin kaybını izleyeceğiz.
Terapötik hedeflerin başarılı bir şekilde parçalanmasını sağlamak ve ilaçlanabilir proteomu genişletmek için, plazma zarında veya içinde lokalize olanlar, lizozomlar, mitokondriyal membranlar, sitoplazma ve çekirdek21-57 dahil olmak üzere yıkım için çok çeşitli proteinleri hedefleyebilen çok sayıda yaklaşım ve tipte bozundurucu ortaya çıkmıştır. En kapsamlı olarak incelenen iki ana bileşik sınıfı, moleküler yapıştırıcılar ve simeraları hedefleyen protein 2,4,5,6,7,12,26'dır. Moleküler yapıştırıcılar monovalenttir, bu nedenle tipik olarak daha küçüktür ve yeni bir proteini kolaylaştırır: bir E3 ligaz bileşeni2,12,26'ya bağlandıktan sonra bir hedef protein ile protein etkileşim arayüzü. Bunlar en yaygın olarak Cereblon (CRBN) E3 ligaz bileşeni2,12,26,55,56,57'ye bağlanan bozunuculardır. Son zamanlarda, DCAF1558,59,60 ve DDB1 45'e CDK / Siklin alımı gibi diğer E3 ligaz makinelerini kullanan heyecan verici yeni örnekler, bu bileşik sınıfının genişleme potansiyelini göstermektedir. Buna karşılık, PROTAC'lar daha büyük, iki değerli moleküllerdir, bir hedef bağlama ligandından oluşur, çoğunlukla bir inhibitör, kimyasal bir bağlayıcı aracılığıyla bir E3 ligaz sapına 1,3,4,5,7,13 ile köprülenir. Bu nedenle, bu bileşikler hem E3 ligazına hem de hedef protein 1,3,4,5,7,13'e doğrudan bağlanabilir. Çok sayıda proteinin bu iki değerli moleküller yoluyla parçalandığı gösterilmiştir ve en çok kullanılan E3 ligaz sapları CRBN veya Von Hippel Lindau (VHL) 1,3,4,5,7,13'ü işe alır. Bununla birlikte, proteoliz tasarımını hedefleyen kimeralarda E3 ligaz alımı için mevcut tutamakların sayısı hızla artmakta ve bu bileşik sınıfının yeteneklerini, çeşitli hedef sınıfları bozma ve hücre veya doku tipi özgüllüğünü arttırma potansiyeli ile genişletmektedir 24,48,61,62 . Marjinal afinite ile bile, bir hedef proteini meşgul etmek için minimum gereklilik ile birleştiğinde, bozunma bileşikleri, uyuşturulabilir proteomu genişletmek için umut vaat etmektedir.
Protein kaybının hücresel dinamiklerini ve tedavi sonrası potansiyel protein geri kazanımını karakterize etmek, bozunma bileşiği fonksiyonunu ve etkinliğini anlamak için kritik öneme sahiptir. Batı leke antikor tahlilleri veya kütle spektrometrisi ile ilgili hücresel sistemlerdeki endojen protein seviyesi değişikliklerini incelemek mümkün olsa da, bu yaklaşımların yüksek verimli tarama formatlarına adapte edilmesi, sınırlı niceleme kabiliyetine veya birçok zaman noktasında kinetik değişiklikleri ölçme kabiliyetine sahip olması zordur14. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, endojen protein seviyelerindeki değişiklikleri izlemek için, 11 amino asit etiketi HiBiT'in CRISPR / Cas9'u aracılığıyla herhangi bir anahtar bozunma hedefinin 18,19,20 lokusuna genomik yerleştirmeyi kullanan plaka tabanlı bir hücresel ışıldayan sistem geliştirdik. Bu peptit, 18,19,20,63 substratının varlığında parlak lüminesans üretmek için bağlanma ortağı LgBiT'ye yüksek afinite ile tamamlar, böylece bu etiketli endojen proteinleri hücrelerde veya lizatlarda ışıldayan hale getirir 18,19,20,63 . Bir luminometre cihazı ile ölçülen göreceli ışık birimleri (RLU'lar), etiketlenmiş hedef protein seviyeleri 18,19,20,63 ile doğru orantılıdır. Stabilize lusiferaz substratlarının geliştirilmesiyle, 24-48 saatlik zaman dilimleri üzerinde gerçek zamanlı kinetik protein seviyesi ölçümleri mümkündür 18,53,64. Bu, herhangi bir bileşik konsantrasyonunda, ilk bozunma hızının, bozunma maksimumunun (Dmax) kantitatif analizi ve bileşik muameleden sonra geri kazanım18,53 dahil olmak üzere, herhangi bir belirli hedef için tam bir bozunma profilinin belirlenmesine izin verir. Bununla birlikte, bozunma bileşiklerinin büyük kütüphaneleri taranırsa, son nokta analizi, çeşitli ilaç konsantrasyonlarında ve belirlenen zamanlarda 384 kuyucuklu formatta kolayca gerçekleştirilebilir.
Bu makalede sunulan protokoller, hedeflenen protein bozunma bileşikleri için hücresel tarama stratejilerini temsil etmektedir ve her türlü bozundurucu için geçerlidir. Bununla birlikte, HiBiT CRISPR hücre hatlarının bu protokollerle birlikte kullanılması, protein yıkımı ile sınırlı değildir, bunun yerine, bileşiklerin etkisini ve hatta direnç mekanizmalarını incelemek için işlem sonrası modüle edilebilecek herhangi bir endojen hedef protein seviyesini izlemek için genel araçlardır 20,65,66. Bu ışıldayan tabanlı tespit yöntemleri için bir ön koşul, endojen hedef ekspresyonu ve doğal promotör regülasyonu18,19,20'yi korurken, hassas ışıldayan algılamayı mümkün kıldığı için kritik öneme sahip bir CRISPR endojen etiketli HiBiT hedef hücre hattıdır. CRISRP/Cas9'un genomik etiketlerin yerleştirilmesinde, özellikle ölçeklenebilirlik 20'de ve yüksek algılama hassasiyeti ile, CRISPR havuzları veya heterozigot veya homozigot allelik eklemelere sahip klonlar dahil olmak üzere çeşitli formatlarda kullanılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir18,19,20. Endojen etiketleme yerine hücrelerde HiBiT'in eksojen ekspresyonunun veya diğer muhabir füzyonlarının kullanılması mümkündür, ancak protein aşırı ekspresyonu14,18 olan sistemler kullanılarak önemli ölçüde dikkatli olunmalıdır. Bunlar, gerçek bileşik potens ve protein geri kazanım dinamiklerini anlamada eserlere yol açabilir14,18, hedef bozunma sonrası aktive edilen potansiyel transkripsiyonel geri besleme döngüleri dahil. Ek olarak, düşük potansiyele sahip erken evre bileşikler kaçırılabilir ve taramada kendilerini yanlış negatifler olarak gösterebilir. Protein kaybı, bileşiğin neden olduğu toksisite ve hücre ölümünden kaynaklanabileceğinden, burada açıklanan protokoller şiddetle tavsiye edilir, ancak isteğe bağlı hücre canlılığı ışıldayan veya floresan tahlilleri, bozunma protokolü ile eşleştirilmiştir. Protokolün iki ana bölümü vardır: litik son nokta ve canlı hücre kinetik taraması. Bu bölümlerin her birinde, son nokta veya kinetik formatlarda çoklanmış hücre canlılığı ölçümleri için seçenekler dahil edilmiştir. Etiketlenmiş endojen proteinin değişimlerinin izlenmesi, hücrelerde LgBiT ile kompleman gerektirir. Bu nedenle, kinetik tarama bölümü, bunun tanıtımı için geçici veya kararlı ekspresyon yoluyla elde edilebilen ve canlı hücre ışıldayan ölçümlerini gerçekleştirmek için gerekli olan önemli protokollere atıfta bulunur. Burada sunulan tüm yaklaşımlar, bileşiklerin hızlı sıralama sıralamasına ve aktivite değerlendirmesine izin vererek, erken aşama bileşik tarama çabalarına ve kurşun bozundurucuların daha hızlı tanımlanmasına olanak tanır.
Bu protokol, bir HiBiT CRISPR hücre hattı ile birlikte bozunma bileşiklerinin incelenmesi için tasarlanmıştır. Çok sayıda hedef için HiBiT CRISPR eklemelerinin oluşturulmasına yönelik protokoller, yakın tarihli birkaç yayında özetlenmiştir18,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9241</td>
			<td>Cell Viability luminescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6080</td>
			<td>Cell Viability fluorescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18045-088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For compound dilution and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 LgBiT stable cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2672</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-687-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT BacMam</td>
			<td>Promega</td>
			<td>CS1956C01</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT Expression Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2681</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer Plate Reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2570</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2580</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3917</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

Moleküler yapıştırıcılar veya kimeraları hedefleyen proteoliz dahil olmak üzere hedeflenen protein bozunma bileşikleri, küçük moleküllü ilaç keşfinde heyecan verici yeni bir terapötik modalitedir. Bu bileşik sınıfı, hedef proteini ve E3 ligaz makinesi proteinlerini ubikitinasyon ve nihayetinde hedef proteini ubikitin-proteazomal yol (UPP) yoluyla bozunmak için gereken yakınlaştırarak protein yıkımını indükler. Bununla birlikte, hedef protein yıkımının yüksek verimli bir şekilde profillenmesi, bozulmayı sağlamak için gereken hücresel yolların karmaşıklığı göz önüne alındığında oldukça zor olmaya devam etmektedir. Burada, ışıldayan bir protein üretmek için LgBiT proteinine yüksek afinite ile tamamlanan 11 amino asit HiBiT etiketi ile hedef proteinlerin CRISPR / Cas9 endojen etiketlemesinin kullanımına dayanan bir protokol ve tarama stratejisi sunuyoruz. Endojen etiketlere sahip bu CRISPR hedefli hücre hatları, ışıldayan plaka tabanlı bir okuyucu kullanarak ışıldayan sinyali izleyerek gerçek zamanlı, kinetik canlı hücre veya uç nokta litik modlarında bileşik kaynaklı bozulmayı ölçmek için kullanılabilir. Burada, farklı formatlar için önerilen tarama protokollerini ana hatlarıyla belirtiyoruz ve ayrıca hız, Dmax, DC50, Dmax50'nin temel bozunma parametrelerinin hesaplanmasını ve hücre canlılığı tahlilleri ile çoklamayı açıklıyoruz. Bu yaklaşımlar, erken evre bileşiklerin hızlı bir şekilde keşfedilmesini ve önceliklendirilmesini sağlarken, ilgili hücresel arka planlarda hedef proteinlerin endojen ekspresyonunu ve düzenlenmesini sağlayarak kurşun terapötik bileşiklerin verimli bir şekilde optimize edilmesini sağlar.

Tek konsantrasyonlu sonlanım noktası litik bozunma analizini göstermek için, birkaç CDK hedef proteini; CDK2, CDK4, CDK7 ve CDK10, HEK293 hücrelerinde C-terminuslarında HiBiT ile endojen olarak etiketlendi ve pan-kinaz Sereblon bazlı PROTAC, TL12-18654'ün 1 μM konsantrasyonu ile muamele edildi (Şekil 1A). CDK proteininin seviyesi farklı zaman noktalarında ölçüldü ve DMSO kontrolüne göre fraksiyonel RLU belirlendi (Şekil 1A). Her CDK proteini, bileşik tedaviye ve çeşitli zaman noktalarına yanıt olarak farklı derecelerde bozulma göstermiştir (Şekil 1A). CDK proteinlerinin protein kaybı açısından birbirleriyle doğrudan nasıl karşılaştırıldığını anlamak için, Şekil 1A'daki fraksiyonel RLU'lar toplam % bozunma olarak hesaplanmış ve Şekil 1B'deki her zaman noktası için çizilmiştir. Bu, erken zaman noktalarında, 2 veya 4 saatte bile, CDK aile üyelerinin bazılarının zaman içinde yukarı doğru eğilim göstermeye devam eden yüksek düzeyde bozulma gösterdiğini göstermektedir (Şekil 1B).
Kinetik bozunma analizini göstermek için, BET ailesi üyesi proteinlerin her biri; BRD2, BRD3 ve BRD4, LgBiT proteini18'i kararlı bir şekilde eksprese eden HEK293 hücrelerindeki N-terminuslarında HiBiT ile endojen olarak etiketlendi. Bunlar daha sonra pan-BET PROTAC'ların üç farklı konsantrasyonu ile muamele edildi; Sereblon tabanlı dBET650 (Şekil 2A) ve VHL tabanlı ARV-77141 (Şekil 2B). Kinetik ölçümler 24 saatlik bir süre boyunca toplandı ve her konsantrasyondaki profillerden, BET aile üyesi yanıtındaki farklılıklar kolayca görülebilir. BRD2'nin bozunma sonrası bileşik tedavisinin daha hızlı bir geri kazanım yanıtı başlatma yeteneği (Şekil 2A, B) daha önce diğer pan-BET PROTAC'larla gözlemlenmiştir ve muhtemelen bozunma sürecine rekabetçi bir transkripsiyonel geri bildirim yanıtından kaynaklanmaktadır18.
Hem sonlanım noktası hem de kinetik analiz, tam bileşik doz yanıtı tedavileri ile yapılabilir. Şekil 3'te gösterilenler, dört farklı moleküler yapıştırıcı bileşiği 2,26,55,57 ile LgBiT proteinini kararlı bir şekilde eksprese eden Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat hücrelerinin tedavisinin kinetik doz yanıtı bozunma profilleridir; lenalidomid (Şekil 3A), iberdomid (CC-220) (Şekil 3B), talidomid (Şekil 3C) ve pomalidomid (Şekil 3D). Bu bozunucular, bileşikler arasında ve konsantrasyon serileri arasında bozunma tepkisinde önemli farklılıklar göstermektedir (Şekil 3).
Şekil 3'teki bileşiklerin bozunma ve sıralama sırasını nicel olarak değerlendirmek için, doz yanıt profilleri, bozunma hızı (Şekil 4A), Dmax (Şekil 4B) ve Dmax50 değerleri (Şekil 4B) dahil olmak üzere anahtar bozunma parametrelerini hesaplamak için kullanılmıştır. Bu analizler, iberdomid (CC-220) ve pomalidomidin çok benzer hızlı başlangıç bozunma oranlarına sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 4A), ancak iberdomid (CC-220) daha önce ortogonal çalışmalarda görüldüğü gibi en yüksek potansiyele sahiptir55,57 (Şekil 4B). Iberdomid bu kadar yüksek bir potens sergilediğinden ve test edilen tüm konsantrasyonlar% 50'den fazla bozulma gösterdiğinden, Iberdomid için elde edilen Dmax50 değeri, verilerin doğru bir şekilde uymasındaki sınırlamaya dayanan bir tahmini temsil eder. Şekil 3C, D ve Şekil 4B'deki grafiklerden, ne lenalidomid ne de talidomid, Ikaros / IKZF1 hedefini test edilen en yüksek konsantrasyonlarda tamamlanmasına indirgemez. Talidomid ile gözlenen çok az bozulma nedeniyle, bozunma izleri üstel bir bozunma modeline tam olarak uyamadı, bu nedenle bu tedavi için bozulma oranı ölçülmedi. En güçlü bozundurucu için, iberdomid (CC-220)55,57 (Şekil 4B). Hücre canlılığı multipleks testleri, test edilen konsantrasyonlar için hücre canlılığında herhangi bir kayıp göstermemiştir (Şekil 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> Şekil 1: Pan-kinaz PROTAC ile CDK sonlanım noktası bozulması ve toksisitesi, TL12-18654. (A) CRISPR/Cas9 aracılığıyla C-terminus üzerinde HiBiT ile kaynaştırılan ve 2 saat, 4 saat, 8 saat ve 24 saat tedavide 1 μM TL12-186 PROTAC54 ile bozunma açısından değerlendirilen endojen CDK hedef proteinlerinin panelini seçin. Değerler, her zaman noktasında ölçülen bir DMSO kontrolüne göre Fraksiyonel RLU olarak temsil edilir. Hata çubukları, 3 teknik çoğaltmanın ortalamasının SD'sini temsil eder. (B) CDK hedef proteinlerinin panelinin yüzde bozunması, (A) dan hesaplanarak 2, 4, 8 ve 24 saatlik zaman noktalarında gözlemlenen her bir aile üyesinin bozulma miktarını temsil eder. Hata çubukları, 3 teknik çoğaltmanın ortalamasının SD'sini temsil eder. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> Şekil 2: BET ailesi üyelerinin kinetik bozunma seçiciliğinin BET bozucuları, dBET650 ve ARV-77141 ile profillenmesi. Endojen BET ailesi üyelerinin, BRD2, BRD3 ve BRD4'ün kinetik bozunma profilleri, 1 nM (sol), 10 nM (orta) veya 100 nM (sağ) dBET650 (A) veya ARV-77141 (B) PROTAC'ların tek konsantrasyonlarının tedavisi ile CRISPR / Cas9 aracılığıyla N-terminus üzerinde HiBiT ile etiketlenmiştir. Değerler, her kinetik zaman noktasında bir DMSO kontrolünden hesaplanan Fraksiyonel RLU olarak temsil edilir. Hata çubukları, 4 teknik çoğaltmanın ortalamasının SD'sini temsil eder. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> Şekil 3: Moleküler tutkal paneli 2,26,55,57 ile Ikaros/IKZF1-HiBiT'nin canlı hücre kinetik bozunma doz yanıtı profilleri. LgBiT proteinini kararlı bir şekilde eksprese eden Jurkat hücreleri, Ikaros / IKZF1'in C-terminusunu HiBiT peptidi ile etiketlemek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanmıştır. Hücreler, dört farklı moleküler tutkal bileşiği 2,26,55,57'nin DMSO'sunu içeren 8 noktalı bir doz yanıtı konsantrasyon serisi ile tedavi edildi: (A) lenalidomid, (B) iberdomid (CC-220), (C) talidomid veya (D) pomalidomid. Lüminesans her 5 dakikada bir toplam 19.5 saat ölçüldü. (A-D)'den gelen göreceli ışık birimi (RLU) verileri, Adım 2.4.1'de açıklandığı gibi kesirli RLU'ya dönüştürüldü ve zamanın bir fonksiyonu olarak grafiklendirildi. Hata çubukları, 3 teknik kopyanın SD'sini temsil eder. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> Şekil 4: Ikaros/IKZF1-HiBiT için bozunma hızının ve Dmax50'nin hesaplanması ve hücre sağlığı tahlillerinin çoklanması. Kantitatif bozunma parametrelerini hesaplamak için Şekil 3'teki kinetik bozunma verileri kullanılmıştır. (A) Bozunma oranları ve (B) bozunma maksimum değerleri (Dmax), belirtilen moleküler tutkal bileşikleri2,26,55,57 için her ilaç konsantrasyonunda grafiklendirilir. (B) Her bileşik için Dmax50 değerleri, bir hedef için sıra bozunma bileşiklerini sıralamak için kullanılabilecek, kısıtlı Hill eğimi 1 olan bir doz-yanıt modeli kullanılarak hesaplanmıştır. (C) Şekil 3B'den iberdomid (CC-220)55,57 bozunma dozu yanıtı ile hücre canlılığı testleri, kinetik bozunma ölçümlerinin tamamlanmasının ardından son nokta ölçümü olarak gerçekleştirilmiştir. Hata çubukları, 3 teknik kopyanın SD'sini temsil eder. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Bu protokol, bir hedef proteine kaynaşmış antikor içermeyen endojen protein algılama etiketini eksprese etmek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanan canlı hücrelerdeki protein bozunma kinetiğinin kantitatif ışıldayan tespitini açıklar. Kantitatif bozunma parametrelerini, hızı, Dmax, DC 50 veDmax 50'yi hesaplamak ve elde etmek için ayrıntılı talimatlar dahil edilmiştir.

HiBiT CRISPR Hücre Hatları Kullanılarak Hedeflenen Protein Bozunma Bileşiklerinin Yüksek Verimli Hücresel Profillemesi

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.2K Görüntüleme.  Promega Corporation. Bu protokol, bir hedef proteine kaynaşmış antikor içermeyen endojen protein algılama etiketini eksprese etmek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanan canlı hücrelerdeki protein bozunma kinetiğinin kantitatif ışıldayan tespitini açıklar. Kantitatif bozunma parametrelerini, hızı, Dmax, DC 50 veDmax 50'yi hesaplamak ve elde etmek için ayrıntılı talimatlar dahil edilmiştir.

Video: High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move within tissues in a tightly orchestrated manner. During tumor development, this equilibrium is disturbed, and tumor cells leave the epithelium of origin to invade the local microenvironment, to travel to distant sites, and to ultimately form metastatic tumors at distant sites. The dot assay is a simple, two-dimensional unconstrained migration assay, to assess the net movement of cell sheets into a cell-free area, and to analyze parameters of cell migration using time-lapse imaging. Here, the dot assay is demonstrated using a human invasive, lung colony forming breast cancer cell line, MCF10CA1a, to analyze the cells' migratory response to epidermal growth factor (EGF), which is known to increase malignant potential of breast cancer cells and to alter the migratory phenotype of cells.

Cell migration is essential for development, tissue maintenance and repair, and tumorigenesis, and is regulated by growth factors, chemokines, and cytokines. This protocol describes the dot assay, a two-dimensional, unconstrained migration assay to assess the migratory phenotype of attached, cohesive cell sheets in response to microenvironmental cues.

Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Kanser Araştırmaları

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental disorders. A characterization of disease-related RAF mutants will help us select appropriate therapeutic strategies for treating these diseases. Recent studies have shown that RAF family kinases have both catalytic and allosteric activities, which are tightly regulated by dimerization. Here, we constructed a set of practical and feasible methods to determine the catalytic and allosteric activities and the relative dimer affinity/stability of RAF family kinases and their mutants. Firstly, we amended the classical in vitro kinase assay by reducing the detergent concentration in buffers, utilizing a gentle quick wash procedure, and employing a glutathione S-transferase (GST) fusion to prevent RAF dimers from dissociating during purification. This enables us to measure the catalytic activity of constitutively active RAF mutants appropriately. Secondly, we developed a novel RAF co-activation assay to evaluate the allosteric activity of kinase-dead RAF mutants by using N-terminal truncated RAF proteins, eliminating the requirement of active Ras in current protocols and thereby achieving a higher sensitivity. Lastly, we generated a unique complementary split luciferase assay to quantitatively measure the relative dimer affinity/stability of various RAF mutants, which is more reliable and sensitive compared to the traditional co-immunoprecipitation assay. In summary, these methods have the following advantages: (1) user-friendly; (2) able to carry out effectively without advanced equipment; (3) cost-effective; (4) highly sensitive and reproducible.

In this article, we presented a set of practical and feasible methods for characterizing disease-related mutants of RAF family kinases, which include in vitro kinase assay, RAF co-activation assay, and complementary split luciferase assay.

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

Mide kanseri hasta-türetilen xenograft modelleri ve primer hücre hatları kurulması

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide clues to overcoming radioresistance. Voltage-gated calcium channel &#945;2&#948;1 subunit isoform 5 has been reported as a marker for radioresistant CSCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Using calcium channel &#945;2&#948;1 subunit as an example of a CSC marker, methods to study the radiosensitivity of CSCs in NSCLC cell lines are presented. CSCs are sorted with putative markers by flow cytometry, and the self-renewal capacity of sorted cells is evaluated by sphere formation assay. Colony formation assay, which determines how many cells lose the ability to generate descendants forming the colony after a certain dose of radiation, is then performed to assess the radiosensitivity of sorted cells. This manuscript provides initial steps for studying the radiosensitivity of CSCs, which establishes the basis for further understanding of the underlying mechanisms.

The presence of cancer stem cells have been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. This manuscript describes the methods to study the radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines.

Akciğer Kanseri Hücre Hatlarında Kanser Kök Hücrelerinin Radyosensitivite

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited because very few patient derived SBNET cell lines have been generated. Well-differentiated SBNET cells are slow growing and are hard to propagate. The few cell lines that have been established are not readily available, and after time in culture may not continue to express characteristics of NET cells. Generating new cell lines could take many years since SBNET cells have a long doubling time and many enrichment steps are needed in order to eliminate the rapidly dividing cancer-associated fibroblasts. To overcome these limitations, we have developed a protocol to culture SBNET cells from surgically removed tumors as spheroids in extracellular matrix (ECM). The ECM forms a 3-dimensional matrix that encapsulates SBNET cells and mimics the tumor micro-environment for allowing SBNET cells to grow. Here, we characterized the growth rate of SBNET spheroids and described methods to identify SBNET markers using immunofluorescence microscopy and immunohistochemistry to confirm that the spheroids are neuroendocrine tumor cells. In addition, we used SBNET spheroids for testing the cytotoxicity of rapamycin.

Neuroendocrine tumors (NETs) originate from neuroendocrine cells of the neural crest. They are slow growing and challenging to culture. We present an alternative strategy to grow NETs from the small bowel by culturing them as spheroids. These spheroids have small bowel NET markers and can be used for drug testing.

İnce Barsak Nöroendokrin Tümör Spheroidlerinin Kurulması ve Karakterizasyonu

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great significance for tumor research. Currently, several techniques are used for the identification and purification of CSCs from tumor tissues and tumor cell lines. Separation and analysis of side population (SP) cells are two of the commonly used methods. The methods rely on the ability of CSCs to rapidly expel fluorescent dyes, such as Hoechst 33342. The efflux of the dye is associated with the ATP-binding cassette (ABC) transporters and can be inhibited by ABC transporter inhibitors. Methods for staining cultured tumor cells with Hoechst 33342 and analyzing the proportion of their SP cells by flow cytometry are described. This assay is convenient, fast, and cost-effective. Data generated in this assay can contribute to a better understanding of the effect of genes or other extracellular and intracellular signals on the stemness properties of tumor cells.

A convenient, fast, and cost-effective method to measure the proportion of side population cells in solid tumor cell lines is presented.

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

CRISPR Aracılı Temel Editörler kullanılarak BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesi

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture models. PDOs have been successfully generated from a variety of human tumors to recapitulate the architecture and function of tumor tissue accurately and efficiently. However, PDOs are unsuitable for an in vitro high-throughput assay system (HTS) or cell analysis using 96-well or 384-well plates when evaluating anticancer drugs because they are heterogeneous in size and form large clusters in culture. These cultures and assays use extracellular matrices, such as Matrigel, to create tumor tissue scaffolds. Therefore, PDOs have a low throughput and high cost, and it has been difficult to develop a suitable assay system. To address this issue, a simpler and more accurate HTS was established using PDOs to evaluate the potency of anticancer drugs and immunotherapy. An in vitro HTS was created that uses PDOs established from solid tumors cultured in 384-well plates. An HTS was also developed for assessment of antibody-dependent cellular cytotoxicity activity to represent the immune response using PDOs cultured in 96-well plates.

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

A highly accurate in vitro high-throughput assay system was developed to evaluate anticancer drugs using patient-derived tumor organoids (PDOs), similar to cancer tissues but are unsuitable for in vitro high-throughput assay systems with 96-well and 384-well plates.

Hasta Kaynaklı Tümör Organoidleri Kullanılarak Yüksek Verimli In Vitro Tahlil

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and treatment response to targeted inhibitors in cancer. Pioneering work in gastrointestinal and pancreatic cancers has highlighted the promise of patient-derived organoids (PDOs) as a patient-proximate culture system, with an increasing number of models emerging. Similarly, work in other cancer types has focused on establishing organoid models and optimizing culture protocols. Notably, 3D cancer organoid models maintain the genetic complexity of original tumor specimens and thus translate tumor-derived sequencing data into treatment with genetically informed targeted therapies in an experimental setting. Further, PDOs might foster the evaluation of rational combination treatments to overcome resistance-associated adaptation of tumors in the future. The latter focuses on intense research efforts in non-small-cell lung cancer (NSCLC), as resistance development ultimately limits the treatment success of targeted inhibitors. An early assessment of therapeutically targetable mechanisms using NSCLC PDOs could help inform rational combination treatments. This manuscript describes a standardized protocol for the cell culture plate-based assessment of drug sensitivities to targeted inhibitors in NSCLC-derived 3D PDOs, with potential adaptability to combinational treatments and other treatment modalities.

This protocol describes a standardized evaluation of drug sensitivities to targeted signaling inhibitors in NSCLC patient-derived organoid models.

EGFR-Mutant NSCLC Hasta Kaynaklı Organoidlerde Hedefe Yönelik Tedavilere Duyarlılığın Profillenmesi

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...