Nuestros PROTAC homodiméricos son los primeros inhibidores químicos de Cereblon y pueden ayudar a dilucidar aún más el mecanismo molecular de los análogos de talidomida, así como a investigar la función fisiológica de Cereblon. Esta nueva tecnología de plataforma PROTAC puede ser muy útil para apuntar específicamente a proteínas de interés que de otro modo se consideran incontrolables. La inhibición de CRBN por sí sola no tiene actividad antitumorátuma.
Sin embargo, los degradantes del CRBN pueden tener implicaciones clínicas en la obesidad, enfermedades infecciosas y otros trastornos. La síntesis es desafiante y es difícil encontrar enlaces y unión óptimos para generar degradadores de proteínas eficaces al diseñar un compuesto PROTAC. Para empezar, coloque 2,46 gramos de L-glutamina protegida por boc y 50 mililitros de tetrahidrofurano en un matraz de fondo redondo de 100 mililitros, y revuelva a 800 rpm durante un minuto.
A continuación, añadir 1,95 gramos de 1, 1'carbonyldiimidazol y una cantidad catalítica de 4-piridina. Continúe revolviendo durante 10 horas al reflujo para obtener una solución transparente e incolora de compuesto de glutrimida. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y retire el disolvente con un evaporador rotatorio.
Redissolve el residuo en 200 mililitros de acetato de etilo y vierta en un embudo separador. Lavar la capa orgánica con 50 mililitros cada uno de agua desionizada y salmuera, y secar la capa orgánica sobre sulfato de sodio. La gravedad filtra la solución a través de gel de sílice para eliminar el desecante, y luego enjuagar el gel de sílice con 200 mililitros de acetato de etilo.
Retire el disolvente del filtrado al vacío para obtener el Compuesto 1 como sólido incoloro. Seque el producto al vacío durante la noche antes de usarlo. A continuación, disolver 0,50 gramos de acetato de sodio en 20 mililitros de ácido acético glacial en un matraz de fondo redondo de 100 mililitros equipado con una barra de agitación.
Añadir 1,25 gramos de anhídrido fluorofletólico y 1,14 gramos de glutatión y remover al reflujo durante seis horas para obtener una solución púrpura del Compuesto 3. Deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente, y luego vierta en 100 mililitros de agua desionizada y revuelva durante 10 minutos para precipitar el Compuesto 3. Recoger el sólido por filtración, lavarlo con agua y éter de petróleo, y secarlo al vacío durante dos días.
A continuación, coloque 0,83 gramos de Compuesto Tres y 20 mililitros de sulfóxido de dimetil seco en un matraz Schlenk de 50 mililitros y revuelva durante dos minutos. Añadir 0,22 gramos de vinculador de diamina de omega alfa Compuesto 6, y 1,05 mililitros de N, N-diisopropylethylamine y agitar la mezcla bajo argón a 90 grados centígrados durante 18 horas para obtener Homodimer 8 en una mezcla verde oscuro. Dejar enfriar la mezcla a temperatura ambiente y verter en 100 mililitros de agua desionizada.
Extraiga el producto en tres porciones de 50 mililitros de acetato de etilo, combine las capas orgánicas y lávelas con 50 mililitros cada una de agua y salmuera. Seque la capa orgánica lavada sobre sulfato de sodio, filtre el desecante y retire el disolvente al vacío. Redissolve el residuo en una cantidad mínima de disolvente de cromatografía y aplíquelo a una columna de gel de sílice para su purificación.
Recoger las fracciones de producto fluorescentes, combinarlas y retirar el disolvente para obtener el Homodimer 8 como un sólido amarillo. Para empezar, disolver 2,28 gramos de glutrimida 1 en 25 mililitros de dimetilformamida en un matraz de fondo redondo de 100 mililitros. Suspenda 2,76 gramos de carbonato de potasio molido en esta solución.
A continuación, dibuje 0,62 mililitros de yodometano en una jeringa equipada con una aguja de calibre 20. Añade la gota de yodometano en el transcurso de 10 segundos. Tape el matraz con un tabique de goma y agregue una aguja de ventilación.
Sonicar la mezcla durante dos horas a temperatura ambiente para obtener Glutarimide Compound 2. Diluir la mezcla con 50 mililitros de acetato de etilo y verter en un embudo separador. Enjuague el matraz en el embudo con otros 50 mililitros de acetato de etilo.
Elaborar el producto y purificarlo con cromatografía de columna de gel de sílice para obtener Glutarimide 2 como un sólido incoloro. Compare los tiempos de retención de los compuestos de glutrimida 1 y 2 para confirmar que la metilación N tuvo éxito. Para comenzar la validación, trate las células del mieloma múltiple con los compuestos de interés.
Aísle las proteínas pertinentes y prepare muestras para un análisis de Western Blot de la degradación de proteínas. A continuación, prepare un sándwich de gel para SDS-PAGE y llene el tanque tampón de ánodo con una solución de pH 8.9 tris-HCl. Cargue las muestras de proteínas en el gel y ejecútela a 70 Voltios durante 20 minutos, seguido de 115 voltios durante 150 minutos.
A continuación, prepare el tampón de transferencia 1x para inmunoblotting y mueva cuidadosamente el gel de su cassette al tampón de transferencia para equilibrarlo. Hay que tener mucho cuidado cuando se quita el gel del cassette para el equilibrio, ya que puede estallar y arrugar muy rápidamente. Sumerja una membrana de difluoruro de polivinilideno de 0,45 micrómetros en metanol puro durante al menos 20 segundos para activarlo y, a continuación, sumerjala en un tampón de transferencia 1x.
Deje que el gel y la membrana se equilibren durante 10 minutos. A continuación, montar el cassette Western Blotting y aplicar 180 miliamperios durante 90 minutos para transferir las proteínas a la membrana. Después, visualizar las proteínas por inmunomancha.
Para evaluar los efectos sobre la viabilidad celular, primero, siembra 50.000 células de mieloma múltiple por pozo de una placa de 96 pozos en triplicado biológico. Añadir a cada pocódica 100 microlitros de medios que contengan DMSO, o un micromolar 0.1, uno o 10 de Compuesto 8, Compuesto 9 o pomalidomida. Para realizar el experimento de rescate de viabilidad celular, tratar las células con una solución nanomolar 100 de Compuesto 8 durante tres horas, antes o después de agregar una solución micromolar de pomalidomida.
Incubar las células durante 24, 48 o 96 horas a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono del 5%, y medir la viabilidad celular con un ensayo luminiscente. La estructura del PROTAC 8 homodimérico se confirmó con protones y RMN de carbono. ProTAC 9 heterodimérico fue sintetizado como un control negativo, como N-metilación dentro de la porción de glutatión resulta en una pérdida de Cereblon, o CRBN, capacidad de unión.
El homo PROTAC 8 indujo una degradación proteosómica casi completa de CRBN con efectos mínimos en los factores de transcripción linfoide IKZF1 e IKZF3. Por el contrario, el hetero PROTAC 9 mostró un comportamiento similar a los pomalidomides. Compuesto 8 la degradación inducida de CRBN podría ser bloqueada por un inhibidor directo del proteosoma, o indirectamente bloqueada por inhibición de la netilación.
Las células pretratadas con el Compuesto 8 resistieron significativamente los efectos de la pomalidomida en IKZF1 e IKZF3. La degradación inducida por el CRBN inducida por el compuesto 8 tuvo mucho menos efecto sobre la viabilidad de las células del mieloma múltiple después de 96 horas que la degradación de IKZF1 e IKZF3 del Compuesto 9 y la pomalidomida. Las células del mieloma múltiple pretratadas con el Compuesto 8 tenían una viabilidad significativamente mayor cuando se exponían a pomalidomida que las células no tratadas, lo que sugiere que el Compuesto 8 podría utilizarse para imitar la resistencia a los fármacos IMiD inmunomoduladores.
Encontramos que el Compuesto 8 induce la degradación proteasomal completa de Cereblon, no tiene efectos secundarios sobre la viabilidad y proliferación celular IKZF1 e IKZF3. Extender la tecnología del proyecto a otros objetivos tiene el potencial de inactivar y rastrear proteínas relacionadas con el cáncer y otras enfermedades. Al adaptar esta técnica para otros fármacos y proteínas, se debe investigar cuidadosamente las estructuras moleculares de la droga y el objetivo proteico para elegir los enlaces y accesorios óptimos.
Los IMiD no funcionarán en ratones debido a una mutación puntual en Cereblon, pero existe un modelo de ratón knock-in transgénico que se puede utilizar para estudios con animales adicionales. Como la pomalidomida es una talidomida análoga, que es altamente teratogénica, no recomendamos a las mujeres embarazadas que trabajen con estos medicamentos.
