Bu yöntem, RNA protein komplekslerini izole etmeye ve kütle spektrometresi ile bileşimlerini belirlemeye çalışan araştırmacıların ilgisini çekebilir. Protokolümüzün, hücrelerde sınırlı miktarda bulunan ve uzun çok aşamalı arınma prosedürleri sırasında ayrışma eğiliminde olan kompleksleri arındırmak için özellikle yararlı olacağına inanıyoruz. Bu yöntemin en büyük avantajı, yalnızca tek bir arıtma adımı içermesi ve herhangi bir uzunluk ve diziriyi oluşturan RNA bağlama siteleri ile kullanılabilmesidir.
Bazı adımları gösteren Xiao-cui Yang, bizim grupta kıdemli araştırma teknisyeni olacaktır. 65 nükleotitten önemli ölçüde daha uzun olan ciltleme siteleri için, metin protokolünde belirtildiği gibi T7 oluşturulan RNA ve bir adaptör PCB oligonükleotid elde edin. Bağlayıcı tampon 100 mikrolitre içeren 1.5 mililitrelik bir tüp adaptör oligonükleotid 100 picomoles ile RNA 20 picomoles karıştırın.
Kaynayan suya tüp yerleştirin ve 5 dakika kuluçkaya bırakın. Daha sonra suyun oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. İlk ek 1 pH 8 de 80 milimolar EDTA ile fare nükleer özü mililitre 10 milimolar son konsantrasyon.
Sonra PCB moiety ile etiketlenmiş tir RNA substrat 5 ve 10 picomoles arasında ekleyin. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka, zaman zaman örnek karıştırın emin olun. Sonraki herhangi bir potansiyel çökelti kaldırmak için 10, 000 kez g karışımı santrifüj için 4 santigrat derecede önceden soğutulmuş mikrosantrifüj kullanın.
Pelet transfer önlemek için dikkatli yaparken dikkatle buz üzerinde yeni bir tüp içine supernatant toplamak. Yaklaşık 100 mikrolitre streptavidin agarose boncuk süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Boncukyıkama başlamak için bağlayıcı tampon yaklaşık 1 mililitre ekleyin.
Tüpü 25 kez g'de 2-3 dakika santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin. Bağlayıcı tampon ile boncukları dengelemek için bu yıkama ve santrifüj işlemini 2-3 kez tekrarlayın. Daha önce toplanan supernatant yükleyin, hangi dengelenmiş boncuklar üzerinde monte karmaşık içerir.
Bir tüp rotator kullanarak, RNA ve bağlı kompleksleri boncuklar üzerine hareketsiz leştirmek için 4 santigrat derece 1 saat boyunca tüp döndürün. Sonraki tüp altında boncuk toplamak için 25 kez g 2-3 dakika tüp spin. Süpernatant aspire.
Ve daha önce açıklanan yıkama işlemini kullanarak boncukları bağlayıcı tamponla iki kez durulayın. İkinci yıkamanın süpernatantını çıkardıktan sonra, 1 mililitre bağlayıcı arabellek ekleyin ve numuneyi 4 santigrat derecede 1 saat döndürün. 2-3 dakika için 25 kez g örnek aşağı spin.
Sonraki bağlayıcı tampon 1 mililitre ekleyin ve yeni bir tüp için süspansiyon aktarın. Numuneyi 4 derecede 1 saate kadar döndürün. 2-3 dakika 25 kez g hareketsiz kompleksleri santrifüj.
Sonra supernatant aspire ve bağlama tampon 200 mikrolitre ekleyin. Boncukları 500 mikrolitrelik bir tüpe aktarın. UV ışığını 365 nanometreye yayan yüksek yoğunluklu uv lambasını açın ve tam parlaklığa ulaşmasını bekleyin.
Petri kabının altını sıkıca paketlenmiş buzla doldurun. Kısaca immobilize kompleksleri içeren tüp girdap. Daha sonra buz üzerine yatay olarak yerleştirin ve önceden ısıtılmış lamba ile kaplayın, numuneampul yüzeyinden 2 ila 3 santimetre olduğundan emin olun.
Tek tip maruziyeti sağlamak ve aşırı ısınmayı önlemek için tüpü sık sık ters çevirip girdaplarken numuneyi toplam 30 dakika ışınlayın. Bundan sonra, 2-3 dakika için 25 kez g boncuk aşağı spin ve supernatant toplamak. Santrifüj bu supernatant bir kez daha aynı koşulları kullanarak.
Herhangi bir artık boncuk transferi önlemek için tüpün altında küçük bir miktar bırakmak için emin olmak elde edilen supernatant toplamak. SDS-PAGE elektroforezini kullanarak, UV elüsyonu ve karşılık gelen fraksiyonu UV elüsyonu sonrası boncukların üzerinde bırakılan malzemeden ayırın. Sonraki jel leke için ticari olarak kullanılabilir gümüş boyama kiti kullanın.
UV eluted supernatant mevcut proteinlerin yoğunlukları karşılaştırarak UV elution verimliliğini değerlendirmek ve UV ışınlama aşağıdaki boncuk üzerinde kalan. İlgi protein bantları excise ve kütle spektrometresi ile kimliklerini belirlemek. Bundan sonra, saflaştırılmış malzemenin tüm proteom'unun tarafsız bir şekilde belirlenmesi için kütle spektrometresi ile uv eluted supernatant'ın bir kısmını doğrudan analiz edin.
Bu çalışmada, foto-dekolteedilebilir biotin ile etiketlenmiş kök döngü RNA fareler miyelom hücrelerinden elde edilen sitoplazmik S100 ekstresinin 1 mililitre ile inkübe edilir. UV elüsyonunun etkisi ve verimliliği gümüş boyama ile analiz edilir. UV elüsyondan önce streptavidin boncuklarında bir dizi protein tespit edilir.
Uzun dalga UV ile ışınlama boncuklar üzerinde spesifik olmayan bir arka plan bırakarak supernatant içine bu proteinlerin sadece bazı bültenleri. Bu UV elüsyon adımının önemini vurgulamaktadır. Kütle spektrometresi, büyük UV eluted proteinleri 3'hExo ve SLBP olarak tanımlar ve SLBP hem tam uzunlukta protein hem de bir dizi kısa bozulma ürünü ile temsil edilir.
Çeşitli RNA bağlayıcı proteinler olarak tanımlanan diğer proteinlerin daha küçük miktarlarda da seçici uv ışınlama tarafından çözelti içine serbest. Immobilize Drosophila histon pre-mRNA UV elution foto-dekolte biotin ile inkübe foto-dekolte biotin ile etiketlenmiş bir nükleer özü ile supernatant içine proteinlerin sadece az sayıda seçici bir serbest bırakılması ile sonuçlandı boncuklar üzerinde kalan non-spesifik proteinlerin yoğun bir arka plan ile. Kütle spektrometresi bu proteinleri U7 snRNP bileşenleri olarak tanımlar.
U7 snRNP'nin histon ön mRNA'ya bağlanmasını engelleyen işleme rakiplerinin varlığında algılanmaz. Yüksek yoğunluklu UV lambası kullanmak ve aşırı ısınmadığından emin olurken ışınlanmış numuneye yakın bir mesafe yerleştirmek önemlidir. UV elüsyon yöntemi, ana kirletici madde eksikliği ve doğrudan ek arıtma adımları ve fonksiyonel tahliller için uygundur yerli RNA protein kompleksleri verir.
UV ışınlama sırasında göz ve cilde maruz kalmaktan kaçının.
