Questo metodo dovrebbe interessare i ricercatori che stanno cercando di isolare i complessi proteici dell'RNA e identificarne la composizione mediante spettrometria di massa. Crediamo che il nostro protocollo sarà particolarmente utile per purificare i complessi che esistono nelle cellule in quantità limitate e tendono a dissociarsi durante lunghe procedure di purificazione in più step. Il vantaggio principale di questo metodo è che coinvolge solo un singolo passaggio di purificazione e potrebbe essere utilizzato con siti di legame RNA di qualsiasi lunghezza e sequenza.
A dimostrare alcuni dei passaggi sarà Xiao-cui Yang, che è un tecnico di ricerca senior nel nostro gruppo. Per i siti di associazione significativamente più lunghi di 65 nucleotidi, ottenere l'RNA generato da T7 e un adattatore PCB oligonucleotide come delineato nel protocollo di testo. Mescolare 20 picomoli dell'RNA con 100 picomoli dell'oligonucleotide dell'adattatore in un tubo da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di tampone legante.
Posizionare il tubo in acqua bollente e lasciarlo incubare per 5 minuti. Quindi lasciare raffreddare l'acqua a temperatura ambiente. Primo supplemento 1 millilitro di estratto nucleare di topo con EDTA da 80 millimolare a pH 8 ad una concentrazione finale di 10 millimolare.
Quindi aggiungere tra 5 e 10 picomoli del substrato di RNA che è stato taggato con la moiety PCB. Incubare sul ghiaccio per 5 minuti, assicurandosi di mescolare occasionalmente il campione. Successivamente utilizzare un microcentrifugo pre-raffreddato a 4 gradi Celsius per centrifugare la miscela a 10.000 volte g per 10 minuti per rimuovere eventuali precipitati.
Raccogliere con cura il supernatante in un nuovo tubo sul ghiaccio, facendo attenzione a evitare di trasferire il pellet. Trasferire circa 100 microlitri di sospensione di perline di agarosio streptavidina in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere circa 1 millilitro di tampone di legame per iniziare a lavare le perline.
Centrifugare il tubo a 25 volte g per 2-3 minuti e aspirare il supernatante. Ripetere questo processo di lavaggio e centrifugazione da 2 a 3 volte per equilibrare le perline con il tampone di legame. Caricare il supernatante raccolto in precedenza, che contiene il complesso assemblato sulle perline equilibrate.
Utilizzando un rotatore a tubo, ruotare il tubo per 1 ora a 4 gradi Celsius per immobilizzare l'RNA e i complessi legati sulle perline. Successivamente ruotare il tubo a 25 volte g per 2-3 minuti per raccogliere le perline nella parte inferiore del tubo. Aspirare il supernatante.
E sciacquare le perline due volte con tampone di legame, utilizzando il processo di lavaggio descritto in precedenza. Dopo aver rimosso il supernatante del secondo lavaggio, aggiungere 1 millilitro di tampone di legame e ruotare il campione per 1 ora a 4 gradi Celsius. Far girare il campione a 25 volte g per 2-3 minuti.
Aggiungere quindi 1 millilitro di tampone di legame e trasferire la sospensione su un nuovo tubo. Ruotare il campione a 4 gradi Celsius per un massimo di 1 ora. Centrifugare i complessi immobilizzati a 25 volte g per 2-3 minuti.
Quindi aspirare il supernatante e aggiungere 200 microlitri di buffer di legame. Trasferire le perline in un tubo da 500 microliter. Accendere una lampada UV ad alta intensità che emette luce UV a 365 nanometri e permettergli di raggiungere la piena brillantezza.
Riempire il fondo di una piastra di Petri con ghiaccio ben imballato impilarlo sul coperchio del piatto. Vortice brevemente il tubo contenente i complessi immobilizzati. Quindi posizionarlo orizzontalmente sul ghiaccio e coprirlo con la lampada pre-riscaldata, assicurandosi che il campione sia da 2 a 3 centimetri dalla superficie del bulbo.
Irradiare il campione per un totale di 30 minuti invertendo e vortexando frequentemente il tubo per garantire un'esposizione uniforme e prevenire il surriscaldamento. Dopodi questo, gira giù le perline a 25 volte g per 2-3 minuti e raccogli il supernatante. Centrifuga questo supernatante ancora una volta usando le stesse condizioni.
Raccogliere il supernatante risultante assicurandosi di lasciare una piccola quantità nella parte inferiore del tubo per evitare il trasferimento di perline residue. Utilizzando l'elettroforesi SDS-PAGE, separare una frazione del supernatante eluitato UV e la frazione corrispondente dal materiale lasciato sulle perline dopo l'eluizione UV. Successivamente utilizzare un kit di colorazione in argento disponibile in commercio per macchiare il gel.
Valutare l'efficienza dell'eluizione UV confrontando le intensità delle proteine presenti nel supernatante eluitato UV e quelle lasciate sulle perline in seguito all'irradiazione UV. Asportare le bande proteiche di interesse e determinarne l'identità mediante spettrometria di massa. Successivamente, analizzare direttamente una frazione del supernatante eluito dai raggi UV mediante spettrometria di massa per determinare l'intero proteoma del materiale purificato in modo imparziale.
In questo studio, l'RNA ad anello stelo taggato con biotina foto-cleavabile viene incubato con 1 millilitro di un estratto citoplasmatico S100 ottenuto dalle cellule del mieloma dei topi. E l'effetto e l'efficienza dell'eluizione UV viene analizzato dalla colorazione dell'argento. Un certo numero di proteine vengono rilevate sulle perline di streptavidina prima dell'eluizione UV.
L'irradiazione con UV ad onde lunghe rilascia solo alcune di queste proteine nel supernatante lasciando uno sfondo non specifico sulle perline. Ciò sottolinea l'importanza della fase di eluizione UV. La spettrometria di massa identifica le principali proteine eluite uv come 3'hExo e SLBP con SLBP rappresentato sia dalla proteina a lunghezza intera che da una serie di prodotti di degradazione più corti.
Piccole quantità di altre proteine identificate come varie proteine leganti l'RNA rilasciate selettivamente in soluzione dall'irradiazione UV. L'eluizione UV della Drosophila istone immobilizzata pre-mRNA taggata con biotina foto-cleavabile incubata con un estratto nucleare ha portato a un rilascio selettivo di solo un piccolo numero di proteine nel supernatante con un intenso sfondo di proteine non specifiche che rimangono sulle perline. La spettrometria di massa identifica queste proteine come componenti dell'U7 snRNP.
Non vengono rilevati in presenza di concorrenti di elaborazione che bloccano l'associazione di U7 snRNP al pre-mRNA istono. È importante utilizzare la lampada UV ad alta intensità e posizionarla a distanza ravvicinata dal campione irradiato, assicurandosi al contempo che non si suscaldi. Il metodo di eluizione UV produce complessi proteici di RNA nativi privi di contaminanti principali e direttamente adatti per ulteriori fasi di purificazione e test funzionali.
Evitare l'esposizione di occhi e pelle durante l'irradiazione UV.
