Bu eser (J. U. için) Ulusal Araştırma Vakfı Kore'den (2016R1D1A1B03931949), bir hibe ve Kore (NMG) hibe (için J.Y Kore government(MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, No. 2016R1A5A2007009) tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir .)

1. nesil HeLa hücreleri mito-Keima (mt-Keima) ifade
<ol><li>
Mt-Keima lentivirus hazırlanması
	<ol>
<li>2 mL % 0.001 poli-L-lizin/fosfat-tamponlu tuz (PBS) ekleyerek bir 100-mm Kültür yemek kat ve oda sıcaklığında 5 min için stand sağlar.</li>
		<li>Bir vakum için bağlı bir cam pipet kullanarak poli-L-lizin çözümü kaldırmak ve 2 mL 1 x PBS ekleyerek kültür bulaşık yıka.</li>
		<li>Plaka 1.5 x 106 HEK293T hücreleri kaplamalı kültür üzerine 10 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM ile yemek ve CO2 doku kültürü kuluçka 37 ° C'de hücreler kültür için bir günü.</li>
		<li>Mt-Keima lentiviral plazmid29 DNA 2 µg DNA'lar (psPAX 2 µg ve pVSVG 0,25 µg) paketleme ile birlikte transfect için üreticinin yönergelerine göre 8 h transfection reaktif kullanarak.</li>
		<li>Transfection ortamını çıkarın ve 8 mL taze medya ekleyin.</li>
		<li>Viral parçacıkların 48 saat sonra içeren medya toplamak. Santrifüjü 500 x g 5 min için de tarafından toplanan medyadan hücresel enkaz kaldırmak ve bir 0.45 µm şırınga filtre ile. Not: Uzun vadeli kullanım için aliquots lentiviral parçacıkların yapmak ve örnekleri-80 ° C'de depolayın Donma-çözülme döngüsü için etkili viral enfeksiyon için viral örnekleri tabi kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mt-Keima lentivirus ile Parkin HeLa hücreleri bulaşmasını
	<ol>
<li>Plaka 5 x 104 HeLa hücreleri 60 mm kültür tabağına 4 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin 37 ° C'de mt-Keima lentivirus hasat önce bir gün içeren DMEM ile Parkin (HeLa-Parkin) ifade. Not: Endojen Parkin ifade HeLa hücreleri30, burada daha fazla açıkça göstermek CCCP kaynaklı mitophagy için kullanılan HeLa-Parkin hücre yokluğu nedeniyle. Bu yordamı ayrıca diğer birincil veya ölümsüzleştirdi hücrenin satırlarına uygulanır.</li>
		<li>Ertesi gün büyüme orta kaldırın ve 1 mL mt-Keima lentiviral medya ekleyin. Büyüme orta 3 µL polybrene hisse senedi çözüm (8 mg/mL distile su) içeren bir ek 2 mL ekleyin. Bir gün bir CO2 doku kültürü kuluçka için kuluçkaya.</li>
		<li>Mt-Keima lentiviral karışımı ertesi gün kaldırmak ve hücreleri iki kez 1 x PBS ile yıkayın. Büyüme orta 4 mL ekleyin ve iki gün boyunca 2 µg/mL puromisindir hücrelerle tedavi.</li>
		<li>İki gün sonra puromisindir seçimi, büyüme orta kaldırmak ve hücreleri iki kez 1 x PBS ile yıkayın. Büyüme orta ekleyin ve hücreleri bir CO2 kuluçka kadar kullanmak kültür. Not: Bu yöntem stabil mt-Keima diğer hücre satırları ve primer hücre de dahil olmak üzere, hızlı hücreler üretmek için uygulanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. inducing CCCP tedavi kullanarak ve FACS örnekleri hazırlama mitophagy
<ol style="margin-left: 40px;"><li>MT-Keima 60 mm Kültür ifade plaka 5 x 104 HeLa-Parkin hücreleri 4 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM ile bulaşık ve onları bir gün bir CO2 doku kültürü kuluçka 37 ° C'de için kültür.</li>
	<li>Ertesi gün büyüme orta kaldırmak ve taze DMEM 10 µM karbonil siyanür m-chlorophenylhydrazone (CCCP) içeren 4 mL ekleyin. HeLa-Parkin-mt-Keima hücreleri bir CO2 doku kuluçka 6 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Büyüme orta 6 h daha sonra kaldırmak ve 2 mL 1 x PBS hücrelerle yıkayın. Hücreleri tripsin/EDTA çözüm ile tedavi bunları ayırmak ve tripsin büyüme orta % 10 içeren ekleyerek devre dışı bırakın FBS. Hücreleri 15 mL konik tüp içine aktarın.</li>
	<li>500 x g 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Dikkatli aspirasyon tarafından büyüme orta kaldırmak ve 1 mL soğuk 1 x PBS hücrelerle resuspend.</li>
	<li>Hücreler uygun FACS tüp içine aktarmak ve buza koyun. Not: Bulaşmamış HeLa hücreleri bir negatif kontrol hazırlayın. Not: Buzda birkaç saat için uygun hücrelerdir ve mt-Keima floresan sinyallerini de kararlı kalır.</li>
</ol>3. FACS Analizi mitophagy
Not: Bu çalışmada, hücreleri 405 nm ve 561-nm lazer ile donatılmış bir akış sitometresi ile analiz edildi. Hücreleri bir menekşe lazer ile heyecan (405 nm) 610 ± 10 nm sarı-yeşil lazer ile BV605 dedektörü ile tespit emisyon ile (561 nm) ile 610 ± 10 nm'de aynı anda bir PE-CF594 dedektörü tarafından algılanan emisyon (Şekil 1).
<ol><li>
Perdeleme canlı hücreleri
	<ol>
<li>Akış Sitometresi ve bilgisayarı açın ve analiz yazılımı oturum.</li>
		<li>Yeni bir deneme oluşturmak veya varolan bir deney çoğaltabilirsiniz. Violet ile hücreleri heyecanlandırmak için (405 nm) ve sarı-yeşil (561 nm) lazerler ve emisyon 610 ± 10 nm dedektörü, algılamak, ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) gerekli fluorophores ise parametre penceresinde ek olarak BV605 ve PE-CF594 seçin. Not: Tüm fluorophores doğrusal bir modda eklenmelidir.</li>
		<li>Girdap kısaca hücre dağıtmak için her hücre örnek toplar.</li>
		<li>Mt-Keima lentivirus örnek enjeksiyon portu ile enfekte olmayan bir denetim HeLa-Parkin hücre örnek içeren tüpü yerleştirin ve sitometresi üzerinde "Çalıştır" düğmesine basın.</li>
		<li>FSC SSC karşı nokta mezarlığına hücreleri nokta Arsa ortasına yerleştirmek için FSC ve SSC gerilim ayarlayın.</li>
		<li>Canlı hücrelerin etrafında Çokgen simgesini kullanarak bir P1 kapı çizmek ve ölü hücreleri ve hücre artıkları (Şekil 2A) ortadan kaldırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mor ve yeşil lazer gerilimleri ayarlamak
	<ol>
<li>Mt-Keima lentivirus üzerinde örnek enjeksiyon ile enfekte içeren HeLa-Parkin hücreleri port ve sitometresi üzerinde "Çalıştır" düğmesine basın tüpü yerleştirin.</li>
		<li>BV605 nokta Arsa (405 nm) mt-Keima ifade HeLa-Parkin mt-Keima (Şekil 2B) ifade değil Denetim hücrelerden açıkça ayırt edici hücrelerdir BV605 gerilim SSC karşı ayarlayın.</li>
		<li>PE-CF594 nokta Arsa (561 nm) mt-Keima ifade HeLa-Parkin hücreleri kontrol hücreleri (Şekil 2B) açıkça ayırt edici SSC karşı PE-CF594 gerilim ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitophagy hücrelerde yüzdesi değerlendirmek
	<ol>
<li>BV605 PE-CF594 nokta Arsa doğrusal bir ölçek kullanarak karşı kazanmak. Mt-Keima ifade hücrelerin etrafında Çokgen simgesini kullanarak bir kapı çizin ve mt-Keima (Şekil 3A) ifade değil hücreleri ortadan kaldırmak. Mt-Keima floresan pozitif hücre nüfus "mt-Keima" kapısı olarak adlandırılır.</li>
		<li>BV605 PE-CF594 tek "mt-Keima" gösterilen karşı olan başka bir nokta çizim oluşturma-hücrelere geçişli. Bu nokta mezarlığına tedavi edilmezse mt-Keima pozitif hücrelerin etrafında bir kapı çizin. Bazal mitophagy aktivite kontrol HeLa hücreleri düşük ve PE-CF594/BV605, emisyon oranını 1'den. Bu kapı, böylece, "düşük" kapısı olarak adlandırılır.</li>
		<li>"Düşük" kapısının yukarıdaki bölge içeren başka bir kapı çizin. Hücreleri emisyon PE-CF594/BV605 (Şekil 3B), yüksek bir oranı yüksek mitophagy etkinliği ile diğer bir deyişle, hücreler içerdiğinden bu kapı "yüksek" kapısı olarak adlandırılır.</li>
		<li>"Yüksek" gate hücrelerde yüzdesini hesaplamak için "Nüfus hiyerarşi göster" menü. "Üst yüzde" (% üst) değerinin mt-Keima pozitif halk arasında "yüksek" gate hücrelerde yüzdesini temsil eder.</li>
		<li>"Mt-Keima" durdurma kapıda kaydetmek ve her örneği çalıştırmak için en az 10.000 olayları ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+More+than+just+a+powerhouse.">Mitochondria: More than just a powerhouse.</a> Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).</li><li>Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+revisited.+Alternative+functions+of+mitochondria.+Bioscience+Reports.">Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports.</a> Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).</li><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+control+of+cellular+life,+stress,+and+death.">Mitochondrial control of cellular life, stress, and death.</a> Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).</li><li>Kang, D., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+mitochondrial+DNA+in+common+diseases+and+disease+states:+aging,+neurodegeneration,+heart+failure,+diabetes,+and+cancer.">Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer.</a> Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).</li><li>Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+basis+of+aging.">The mitochondrial basis of aging.</a> Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).</li><li>Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biology,+degenerative+diseases+and+aging.">Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging.</a> BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).</li><li>Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitohormesis.">Mitohormesis.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin.">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Drosophila+PINK1+mutants+is+complemented+by+parkin.">Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li><li>Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+the+banquet:+Mitochondrial+biogenesis,+mitophagy,+and+cell+survival.">After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival.</a> Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).</li><li>Um, J. H., Yun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+mitophagy+in+human+diseases+and+physiology.">Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology.</a> BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).</li><li>Al Rawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfertilization+autophagy+of+sperm+organelles+prevents+paternal+mitochondrial+DNA+transmission.">Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission.</a> Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).</li><li>Kim, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SESN2/sestrin2+suppresses+sepsis+by+inducing+mitophagy+and+inhibiting+NLRP3+activation+in+macrophages.">SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages.</a> Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).</li><li>Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+A+balance+regulator+of+NLRP3+inflammasome+activation.">Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation.</a> BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).</li><li>Sandoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+Nix+in+autophagic+maturation+of+erythroid+cells.">Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells.</a> Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).</li><li>Sato, M., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+paternal+mitochondria+by+fertilization-triggered+autophagy+in+C.+elegans+embryos.">Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos.</a> Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).</li><li>Geisler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1/Parkin-mediated+mitophagy+is+dependent+on+VDAC1+and+p62/SQSTM1.">PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy.">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li><li>Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Kubli, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+Is+dispensable+for+mitochondrial+recruitment+of+Parkin+and+activation+of+mitophagy+in+cardiac+myocytes.">PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes.</a> PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).</li><li>Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+techniques+to+measure+mitophagy+using+fluorescence+microscopy.">Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy.</a> Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery.">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chemistry &amp; Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li><li>Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+links+between+sirtuins+and+autophagy.">The emerging links between sirtuins and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+vivo+Mitophagy.">Measuring In vivo Mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li><li>Denison, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+common+fragile+site+gene+Parkin+in+ovarian+and+other+cancers.">Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers.</a> Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).</li><li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Basic+principles+and+applications.">Flow cytometry: Basic principles and applications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li><li>Bingol, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+deubiquitinase+USP30+opposes+parkin-mediated+mitophagy.">The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy.</a> Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).</li><li>Burbulla, L. F., Kruger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+primary+human+fibroblasts+for+monitoring+mitochondrial+phenotypes+in+the+field+of+Parkinson's+disease.">The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease.</a> Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).</li><li>Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+video+microscopy+for+assessment+of+EYFP-Parkin+aggregation+as+a+marker+for+cellular+mitophagy.">Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy.</a> Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).</li><li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+detection+of+mitophagy+in+human+cells,+C.+Elegans,+and+mice.">In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, mt-Keima ifade hücreleri hücresel mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi kullanmanın hızlı ve hassas yöntemi mevcut. Mitophagy yüksek düzeyde geçiren hücreleri sergi PE-CF594 artan bir oranını (561 nm) / BV605 (405 nm) uyarma. Böylece, mitophagy etkinlik 561/405 oranı yüksek sergilenmesi hücre yüzdesi olarak ifade edilebilir. PE-CF594 bir nokta arsa üzerinde "yüksek" kapısı bölgesinde hücre yüzdesi hesaplanan (561 nm) BV605 karşı (405 nm), ve CCCP ile tedavi mitophagy HeLa-Parkin hücrelerinde artış indüklenen sonuçlar gösterdi. Biz daha önce mt-Keima lentivirus-aracılı overexpression kendisi mitokondriyal işlev veya hücresel Fizyoloji31etkileyeceğini gösterdi. Her ne kadar bizim el yazması göstermiştir bu Akış Sitometresi Analizi başarıyla algılayabilir Parkin ifade CCCP kaynaklı mitophagy yılında HeLa hücreleri, bu teknik mt-Keima tanıtımı sonra hücre herhangi bir türü için uygulanabilir. Biz daha önce bu hipoksi indüklenen mitophagy HeLa hücreleri ektopik Parkin ifade29olmadan tespit gösterdi. Buna ek olarak, bizim ve bu diğer gruplar da dahil olmak üzere önceki çalışmalarda mt-Keima floresan analiz primer hücre fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) gibi mitophagy tespit edebilen gösterdi ve HeLa, HEK293 ve SH-SY5Y hücreleri gibi hücreler ölümsüzleştirilmiş 28 , 29 , 32.
Onlar hızlı, tekrarlanabilir analizleri hücreleri31çok sayıda izin o diğer mikroskopi veya immunoblotting tabanlı mitophagy deneyleri ile karşılaştırıldığında, akış sitometresi deneyleri avantajlara sahip. Mikroskopi tabanlı analizleri, araştırmacı önyargı sonuçları deforme edebilirsiniz ise, bu nedenle, bu önyargı bir akış sitometresi deneyleri kullanırken mesele değil.
Az 1 x 106 Akış Sitometresi Analizi için gerekli hücrelerdir. Buna ek olarak, bir örnek Analizi sadece 1-2 dakika sürer çünkü örnekleri onlarca ilâ 1-2 saat içinde çözümlenebilir. Ayrıca, akış sitometresi deneyleri ile iyi duyarlılık mitophagic hücrelerde artar algılayabilir. Bizim Akış Sitometresi Analizi, 10 kat artış mitophagic hücreleri tedavi CCCP ile 6 h sonra tespit ettik.
Akış Sitometresi kullanarak mitophagy analiz etmek için kritik adım "yüksek" ve "düşük" kapıları doğru mitophagy yüksek düzeyde geçiren hücreleri ayırt etmek için ayarlamaktır. Bazal mitophagy seviyeleri hücre türüne bağlı olarak farklı olabilir, "yüksek" ve "düşük" geçit ayarlama bazı hücre hatlarında zor olabilir. Böyle bir durumda, HeLa hücreleri gibi düşük bazal mitophagy aktivite ile kontrol hücre satırı eklemek yararlıdır. Buna ek olarak, klorokin gibi lizozomal bir önleyici ile tedavi hücreler için bafilomycin A doğru çoğunluğuna yukarı ayarlamak için düşük mitophagy denetimi olarak dahil edilebilir. Lentiviruses ilginç proteinler ektopik ifade için yaygın olarak kullanılmasına rağmen bazı hücre satırları virüs enfeksiyonu için duyarlı olabilir. Lentivirus enfeksiyon hücre büyümesini veya mitokondri işlev değişiklikleri sonuçlanırsa, başka bir yöntem mt-Keima ifade için düşünülmelidir. Mt-Keima ifade düzeyini de hücre türüne bağlı olarak değişebilir. Mt-Keima floresan sinyal çok zayıf veya çok heterojen ise, yalnızca güçlü mt-Keima floresan sinyal hücreleri hücre sıralayıcısı veya yine birkaç gün daha yüksek bir konsantrasyon puromisindir antibiyotik ile tedavi mt-Keima hücreleri kullanarak toplanabilir . Mt-Keima sinyal müstakil hücre istikrarlı sürece hücreleri uygulanabilir, ancak örnekleri akış sitometresi tarafından mümkün olduğunca hızlı bir şekilde analiz öneririz.
Bizim akış sitometresi tahlil, mitophagy analiz için sağlam ve uygun bir yöntem olmakla birlikte, bazı sınırlamalar vardır. Hücreleri tek hücre düzeyi için akış sitometresi olarak ayrılması gerektiğini, ilk olarak, bu yöntem doku veya organ mitophagy fizyolojisi değiştirmeden analiz etmek için uygulamak zor çünkü. Ayrıca, mt-Keima floresan pH bağımlı özellikleri fiksasyon sonra kaybeder ve böylece, tüm örneklerin canlı hücreler olarak analiz edilmelidir. Bu yukarıda belirtilen örnek depolama sınırlaması ve başka bir sınırlama bir ek ayirt leke uygularken sonuçlanır. Bu teknik mitophagy aktivitesinin kantitatif ölçüm yapabilir miyim ama mitokondrial morfoloji veya mitophagy işlemi9' önemli roller oynamak için bilinen dynamics, değişiklikleri izlemek değiştiremiyor. Araştırmacılar karmaşıklığı ve mitophagy belirsiz yönlerini tutmalı. Bu nedenle, olası hata önlemek için mitophagy işlemi daha fazla elektron mikroskobu, mitokondrial protein ciro, bir azalma dahil olmak üzere diğer ortak mitophagy analiz yöntemleri kombine sonuçlarını tarafından onaylanması daha önce açıklanan33,34,35mitokondrial DNA ve mitokondri organellerin veya autophagosomes olarak colocalization ölçme floresans mikroskobu. Mitophagy herhangi bir gözlenen artış da daha fazla hücre mt-Keima ifade confocal mikroskobu ile incelenebilir. Mitophagic hücrelerde, mt-Keima parlak punctate desen confocal mikroskobu28,29altında gözlenen yüksek bir 586/440 oranı ile ifade edilir.
Hızlı ve hassas mitophagy algılamak için onun yetenek göz önüne alındığında, bu akış sitometresi tahlil çalışmaları çeşitli için değerli bir ilk adım yaklaşım sağlar. Sadece mt-Keima lentivirus içeren hücreleri bulaşmasını tarafından mitophagy faaliyet değişiklikleri kolayca istenen herhangi bir hücreye bir ölçü olabilir. Hücre sıralayıcısı işlevi ile birlikte, mitophagy faaliyet belirli bir düzeyde içeren hücreler olabilir özellikle izole ve rolleri ve düzenleyici mekanizmaları mitophagy altında yatan çalışırdım.

Mitokondri hücre çoğalması ve Fizyoloji için gerekli olan organelleri vardır. Mitokondri ATP tedarik Oksidatif fosforilasyon üzerinden % 80'den fazla oluşturmaktan sorumlu vardır ve onlar da biyosentezi ve metabolizma1,2için çeşitli metabolik ara ürün sağlamak. Enerji arzı ve metabolizma rolleri yanı sıra, mitokondri reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi, hücre ölümü ve intrasellüler Ca2 + dynamics3 düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok diğer önemli süreçlerinde, merkezi rol oynarlar . Mitokondriyal işlevde değişiklik kanser, diyabet ve çeşitli nörodejeneratif hastalıklar4,5de dahil olmak üzere insan hastalıkları ile ilişkili bulunmuştur. Artan mitokondrial disfonksiyon ve mitokondriyal DNA mutasyonlar da normal yaşlanma süreçlerini6,7,8' e katkıda düşünülmektedir. Bu nedenle, kalite kontrol mitokondri içinde çok önemli bir konudur. Mitokondri sürekli uzun ağlar ve kısa, parçalanmış bir form arasında kendi şeklini değiştirebilirsiniz son derece dinamik organelleri vardır. Mitokondri dynamics mitokondri yanı sıra onların yıkımı ile mitophagy9fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar.
Mitophagy bütün mitokondri autophagy makine kullanarak Seçmeli bozulma içerir bir mekanizmadır. Mitophagy ilke mekanizması temel mitokondrial ciro ve zarar görmüş veya işlevsiz mitokondri kaldırılması olduğunu. Bu süreçte, mitokondri ilk organellerin hydrolytic Bozulması9ile sigorta autophagosomes oluşumu sonuçlanan bir zar çevrilidir. Önceki genetik çalışmalarda Drosophila iki önerilen Parkinson hastalığı ile ilgili genleri, sözde kinaz PTEN kaynaklı 1 (PINK1) (PARK6) ve Parkin (PARK2), aynı yolu10,11' işlev. Strüktür çalışmaları PINK1-Parkin yolu bozuk mitokondri ortadan kaldırılması için sorumludur ve işlevsel olmayan mitophagy bu yolu sonuç kusurları ve insan hastalıkları12,13için katkıda bulunabilir göstermiştir. Hatalarına mitophagy süreçlerde son zamanlarda çeşitli insan hastalıkları, kanser, kalp hastalığı, karaciğer hastalıkları ve nörodejeneratif hastalık 14gibi bulduk. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda da bu mitophagy ayırt etme, geliştirme ve bağışıklık yanıtı15,16,17,18 gibi birçok fizyolojik süreçleri için çok önemlidir göstermiştir ,19o mitophagy hücre fonksiyonları kontrol daha aktif bir rol oynamak düşündüren,.
Mitophagy mitokondri her iki kalite kontrol önemli bir rol oynar ve insan hastalık, mitophagy temel moleküler mekanizmaları kalır kötü son onay rağmen anladım. Her ne kadar mitophagy ile ilgili mekanizmalar sistematik olarak Maya incelenmiştir, mitophagy ile ilgili mekanizmalar memeli hücrelerinde keşfetmek yönelik çalışmaları esas olarak PINK1-Parkin yolu üzerinde odaklanmıştır. Önceki çalışmalar PINK1-Parkin yolu öncelikle mitophagy12,20,21üzerinden hasarlı mitokondri seçici kaldırılması için sorumludur kurduk. Ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bazı modelleri mitophagy fonksiyonel PINK122,23,24olmadığında da etkinleştirilebilmesi için bildirdin. Bu sonuçlar PINK1-Parkin yolu ek olarak, orada mitophagy etkinleştirebilirsiniz ek bir tanımlanamayan yolu göstermektedir.
Mitophagy etkinliğini değerlendirmek için uygun bir yöntem mitophagy ve patofizyolojik olaylarda rolü düzenleyen yollar keşfetmek için büyük bir engel bulunmamasıdır. Elektron mikroskobu doğrudan autophagosome yuttu mitokondri görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Ancak, elektron mikroskobu mitophagy aktivite miktarının içinde sınırlamalar vardır. Her ne kadar Mikrotubul ilişkili protein-1 kullanmak stratejileri zinciri 3 (LC3) ışık-GFP-LC3 gibi konjuge floresan problar vardır şu anda en çok kullanılan yaklaşımlar25, LC3 tabanlı sinyal geçici doğasını ve onun yüksek oranda yanlış sinyalleri mitophagy hücreleri26algılama hassasiyeti sınırlayın. Mitokondrial protein seviyesi, Mitokondrial DNA ve floresan mikroskopi analiz mitokondri ya autophagosomes ya da organellerin ile colocalize için miktar ölçmek için western Blot bir arada değerlendirmek için iyi bir yaklaşım olurdu mitophagy. Ancak, miktar kısıtlamaları ve uygunluk-in mevcut metodolojiler eksikliği yeni yaklaşımlar için çağrı. Giriş bir yeni pH bağımlı floresan protein, mitokondrial hedef Keima (mt-Keima), mitophagy27algılama yeteneğini büyük ölçüde geliştirilmiş. Sitokrom c oksidaz alt birim VIII (COX VIII) Keima içine mitokondrial hedefleme dizisi eritme tarafından mt-Keima mitokondrial matris yönlendirilir. 440 büyük vardiya Keima uyarma tepe içinde nm 586 (pH 7 ve pH 4, sırasıyla karşılık) nm olabilir kullanılan hassas in vitro ve in vivo deneyler28,29 iyilikle mitophagy değerlendirmek için . Daha da önemlisi, mt-Keima lizozomal bozulması için direnç organellerin mitophagy aktivite kolay nicel ölçüm için izin, mt-Keima sinyal entegrasyonu neden olur. Mt-Keima içinde oluşur floresans değişikliği her iki confocal mikroskobu kullanılarak analiz veya akış sitometresi28,29. Ancak, mt-Keima kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi tabanlı yöntemi ayrıntılı tarihi için sağlanmış olan değil.
Burada, mt-Keima kullanarak hücreleri mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi tabanlı tekniği için detaylı bir protokol açıklayın. Her ne kadar biz burada Akış Sitometresi Analizi HeLa hücreleri Parkin ifade başarıyla CCCP kaynaklı mitophagy tespit göstermiştir, bu teknik çok çeşitli hücre tipleri için uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">poly-L-lysine</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:133px;">wellgene</td>
			<td style="width:119px;">LS202-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:133px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30013.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293T</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPTI-MEM&#160;</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Turbofect</td>
			<td style="width:133px;">Thermos scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.45 &#956;m syringe filter</td>
			<td style="width:133px;">sartorius</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polybrene</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9268</td>
			<td>8 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">puromycin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8833</td>
			<td>2 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2759</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:133px;">wellgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EQUIPMENTS</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:133px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSDIVA</td>
			<td style="width:133px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">FACSDIVA (v8.0.1)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive measurement of mitophagy by flow cytometry using the ph-dependent fluorescent reporter mt-keima

Mitophagy seçici autophagy makine kullanarak hasarlı ya da gereksiz mitokondri kaldırılması işlemidir. Yakın bağları arızalı mitophagy ve nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve metabolik hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıkları arasında bulunmuştur. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu mitophagy normal hücresel süreçler, başkalaşım ve gelişimi gibi ilgilenmektedir göstermiştir. Ancak, kesin rolü ve moleküler mekanizmaları mitophagy altında yatan daha fazla çalışma gerektirir. Bu nedenle, bu değişiklikler mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlam ve uygun bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Burada, mitophagy etkinlik mitokondri hedefli floresan protein Keima (mt-Keima) kullanarak akış sitometresi ile kantitatif değerlendirilmesi için detaylı bir protokol açıklayın. Bu akış sitometresi tahlil daha hızlı ve hassas Yöntemler konvansiyonel mikroskopi veya immunoblotting göre daha mitophagy etkinliğini çözümleyebilirsiniz. Bu iletişim kuralı çeşitli hücre tiplerinin mitophagy etkinliğini çözümlemeye uygulanabilir.

CCCP kaynaklı mitophagy HeLa-Parkin hücrelerdeki Akış Sitometresi Analizi örneği Şekil 4' te gösterilmiştir. Yukarıda açıklanan Akış Sitometresi Analizi yöntemi kullanılarak, biz "yüksek" gate mitophagic hücrelerde dramatik bir artış algılayabilir. "Yüksek" gate hücrelerinin yüzde 10 kat daha fazla tedavi edilmemiş kontrol hücreleri (Şekil 4A) ile karşılaştırıldığında yükseltilmiştir. Mitophagy aktivite bu artış tamamen bafilomycin A (BFA) (Şekil 4A ve 4B) ile ortak tedavi tarafından kaldırıldı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58099/58099fig1.jpg"> Resim 1 . Mitophagy akış sitometresi ile ölçmek için kullanılan yönteminin şematik Gösterim. Düzen hücreleri mitophagy akış sitometresi tarafından geçiren ölçmek için gerekli ana adımları özetliyor. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58099/58099fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58099/58099fig2.jpg"> Resim 2 . Akış Sitometresi parametrelerini ayarlama. (A) Gating canlı hücre. Bir bölge canlı hücreler için FSC karşı ölü hücreleri ve hücre artıkları dışlamak için SSC arsa üzerinde tespit edilmiştir. (B) denetim HeLa kullanarak 405 nm ve 531-nm lazerler ayarlayarak hücreleri ve HeLa hücreleri ifade mt-Keima. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58099/58099fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58099/58099fig3.jpg"> Şekil 3 . Mitophagic hücre oranı akış sitometresi tarafından hesaplanıyor. (A) mt-Keima ifade Gating HeLa hücreleri. (B) mitophagic hücreleri çoğunluğuna ve istatistik aracı kullanarak oran hesaplama. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58099/58099fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58099/58099fig4.jpg"> Şekil 4 . CCCP kaynaklı mitophagy HeLa hücreleri akış sitometresi tarafından yapılan miktar. (A) mt-Keima ifade HeLa-Parkin hücreleri 10 µM CCCP 6 h ile veya olmadan 100 nM bafilomycin A (BFA) ile tedavi. Hücreleri BV605 ve PE-CF594 dedektörleri kullanarak FACS tarafından analiz edildi. (B) hücreleri ile PE-CF594/BV605 oranı yüksek ("yüksek") seçildi ve onların oran hesaplanır. Üç tekrarlanan deneylerin sonuçlarını standart sapmalar ile çizilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58099/58099fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima at JoVE.com

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

sensitive-measurement-mitophagy-flow-cytometry-using-ph-dependent

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Görüntüleme.  Dong-A University. Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.

Video: Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Biyoloji

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Endoreduplication izole yumru önceki Akış Sitometresi tarafından ölçme

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

Dictyostelium discoideum Macropinocytosis akış sitometresi tarafından yüksek üretilen iş ölçümü

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...