이 작품 (하 제 미), 국가 한국 연구 재단 (2016R1D1A1B03931949)에서 교부 금에 의해 그리고 한국 (NRF) 부여 (J.Y에 한국 government(MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, No. 2016R1A5A2007009)에 의해 투자 연구 재단에 의해 지원 되었다 .)

1. 미토-Keima (mt Keima) 표현 HeLa 세포의 생성
<ol><li>
Mt Keima lentivirus의 준비
	<ol>
<li>0.001% 폴 리-L-리 신/인산 염-버퍼링 식 염 수 (PBS)의 2 개 mL를 추가 하 여 100 mm 문화 접시 코트 고 실 온에서 5 분 동안 서 서 있습니다.</li>
		<li>진공에 연결 하는 유리 피 펫을 사용 하 여 폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 문화 접시를 세척.</li>
		<li>플레이트 1.5 x 106 HEK293T 셀 코팅된 문화 10 %FBS 1% 페니실린/스, 포함 된 DMEM의 10 mL와 함께 요리 하 고 CO2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 셀 1 일 문화.</li>
		<li>DNAs (psPAX 2 µ g과 pVSVG 0.25 µ g) 포장 함께 mt Keima lentiviral 플라스 미드29 DNA의 2 µ g transfect transfection 시 약을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 h에 대 한.</li>
		<li>Transfection 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 8 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>48 h 후 바이러스 성 입자를 포함 하는 미디어를 수집 합니다. 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 수집 된 미디어에서 세포질 파편을 제거 하 고 0.45 μ m 주사기 필터와 필터링. 참고: 장기간 사용에 대 한 aliquots lentiviral 입자의 만들고-80 ° c.에 샘플 저장 바이러스 샘플을 동결-해 동 주기 효율적인 바이러스 감염에 대 한 복종 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mt Keima lentivirus 감염 헬러 Parkin 셀
	<ol>
<li>플레이트 5 x 104 HeLa 세포 DMEM 포함 10 %FBS 1% 페니실린/스 37 ° C에서 마운트 Keima lentivirus 수확 전에 하루 4 mL와 60 mm 문화 접시에 Parkin (헬러-Parkin)를 표현. 참고: 헬러 세포30, 더 명확 하 게 쇼 CCCP 유도 mitophagy 여기 익숙해 헬러 Parkin 셀에에서 생 Parkin 식의 부재 때문에. 이 절차는 또한 다른 주 또는 불멸 하 게 셀 라인에 적용할 수 있습니다.</li>
		<li>다음 날 성장 매체를 제거 하 고 산 Keima lentiviral 미디어의 1 mL을 추가. Polybrene 재고 솔루션 (증류수에 8 mg/mL)의 3 µ L을 포함 하는 성장 매체의 추가적인 2 mL를 추가 합니다. CO2 조직 문화 인큐베이터에서 1 일 동안 품 어.</li>
		<li>다음 날 mt Keima lentiviral 혼합물을 제거 하 고 씻어 1 x PBS로 두 번 셀. 성장 매체의 4 mL를 추가 하 고 이틀 동안 2 µ g/mL puromycin 셀 치료.</li>
		<li>Puromycin 선택의 2 일 후에 성장 매체를 제거 하 고 두 번 1 x PBS로 세포 세척. 성장 매체를 추가 하 고 사용까지 CO2 배양 기에서 세포 문화. 참고: 이 메서드는 안정적으로 mt-Keima, 다른 세포 선 및 1 차 셀을 포함 하 여 표현 하는 셀을 생성 하 적용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 유도 mitophagy CCCP 치료를 사용 하 여 및 FACS 샘플 준비
<ol style="margin-left: 40px;"><li>플레이트 5 x 104 헬러 Parkin 세포 mt-Keima-60mm 문화 표현 10 %FBS 1% 페니실린/스 포함 된 DMEM의 4 mL와 함께 요리 하 고 CO2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 일 문화.</li>
	<li>다음 날 성장 매체를 제거 하 고 신선한 DMEM 포함 10 µ M 카보닐기 시안 m-chlorophenylhydrazone (CCCP)의 4 개 mL를 추가. 헬러-Parkin-mt-Keima 셀 6 h에 대 한 CO2 조직 배양 기에 품 어.</li>
	<li>나중에 6 h 성장 매체를 제거 하 고 1x PBS의 2 mL로 세포 세척. 트립 신/EDTA 솔루션으로 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체를 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 15 mL 원뿔 튜브로 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g에서 셀 원심</li>
	<li>조심 스럽게 포부에 의해 성장 매체를 제거 하 고 차가운 1 x PBS의 1 mL로 세포를 resuspend.</li>
	<li>적합 한 FACS 튜브에 세포를 전송 하 고 얼음에 그것을 배치. 참고: 부정적인 통제로 감염 되지 않은 HeLa 세포를 준비 합니다. 참고: 세포, 몇 시간 동안 얼음에 가능한가 그리고 mt Keima 형광 신호 또한 안정적으로 유지.</li>
</ol>3. FACS 분석 mitophagy
참고:이 연구에 셀 흐름 cytometer 405 nm 및 561-nm 레이저 장착으로 분석 되었다. 바이올렛 레이저로 세포 흥분 했다 (405 nm) 방출 BV605 검출기와 노란색-녹색 레이저 610 ± 10 nm에서 감지와 (561 nm) 방출 동시에 610 ± 10 nm에서 PE CF594 검출기에 의해 감지 (그림 1)와 함께.
<ol><li>
라이브 셀 게이팅
	<ol>
<li>교류 cytometer와 컴퓨터 그리고 분석 소프트웨어에 로그인.</li>
		<li>새로운 실험을 생성 하거나 기존 실험을 복제 합니다. 보라색으로 세포를 자극 (405 nm)와 노란색-녹색 (561 nm) 레이저 및 방출 610 ± 10 nm 검출기에서 검출, 앞으로 분산형 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) 필요한 fluorophores로 매개 변수 창에서 BV605와 PE-CF594을 선택. 참고: 모든 fluorophores 선형 모드에 추가 되어야 합니다.</li>
		<li>와 동 각 셀 샘플 짧게 분산 셀을 집계 합니다.</li>
		<li>Mt Keima lentivirus 샘플 주입 포트와 감염 되지 않은 컨트롤 헬러 Parkin 셀 샘플을 포함 하는 튜브 놓고는 cytometer에서 "실행된" 버튼을 누릅니다.</li>
		<li>SSC 대 FSC의 도트 줄거리에서 점 작의의 중앙에 세포를 FSC 그리고 SSC 전압을 조정 합니다.</li>
		<li>P1 게이트 라이브 셀 주위 다각형 아이콘을 사용 하 여 그리고 죽은 세포 및 세포 잔해 (그림 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
보라색과 녹색 레이저에 대 한 전압 조정
	<ol>
<li>튜브 샘플 주입에 mt Keima lentivirus 감염 포함 헬러 Parkin 셀 포트와 cytometer에서 "실행된" 버튼을 눌러 놓습니다.</li>
		<li>BV605의 도트 음모에서 (405 nm) 헬러 Parkin 셀 mt Keima 표현이 mt-Keima (그림 2B)를 표현 하지 않는 제어 셀에서 명확 하 게 구별 되도록 BV605 전압을 조정 SSC, 대.</li>
		<li>PE-CF594의 점 플롯에 (561 nm)는 헬러 Parkin 셀 mt Keima 표현 명확 하 게 고유 컨트롤 셀 (그림 2B)에서 PE CF594 전압을 조정 SSC, 대.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitophagy 셀의 비율을 평가
	<ol>
<li>선형 눈금을 사용 하 여 PE CF594 점 플롯 대 BV605를 취득 합니다. 셀 마운트-Keima, 표현 주위 다각형 아이콘을 사용 하 여 게이트 그리고 하지 mt-Keima (그림 3A)를 표현 하는 세포를 제거. Mt Keima 형광 양성 세포 인구 "산 Keima" 문 이라고 합니다.</li>
		<li>PE-CF594 유일한 "산 Keima"를 보여주는 대 BV605의 다른 점 플롯 만들기-셀 문이. 이 점 플롯에서 치료 mt-Keima-긍정적인 세포 주위 게이트를 그립니다. 기저 mitophagy 활동 제어 헬러의 셀 낮습니다, 그리고 PE-CF594/BV605에서 방출의 비율은 1 보다 작은. 따라서,이 문 이라고 하는 "낮은" 게이트.</li>
		<li>"낮은" 게이트의 위의 영역을 포함 하는 다른 게이트를 그립니다. 이 게이트는 그것은 높은 mitophagy 활동, 즉, 셀 셀 PE-CF594/BV605 (그림 3B)에서 방출의 높은 비율을 포함 하기 때문에 "높은" 게이트 라고 합니다.</li>
		<li>"높은" 문 셀의 비율을 계산 하려면 "인구 계층 보기" 메뉴를 선택 합니다. 상위의 "%" (% 부모) 값 산-Keima-긍정적인 인구 중 "높은" 문 셀의 비율을 나타냅니다.</li>
		<li>"산 Keima" 중지 게이트에 기록 하 고 각 샘플을 실행 하려면 적어도 10000 이벤트를 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+More+than+just+a+powerhouse.">Mitochondria: More than just a powerhouse.</a> Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).</li><li>Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+revisited.+Alternative+functions+of+mitochondria.+Bioscience+Reports.">Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports.</a> Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).</li><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. 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H., Yun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+mitophagy+in+human+diseases+and+physiology.">Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology.</a> BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).</li><li>Al Rawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfertilization+autophagy+of+sperm+organelles+prevents+paternal+mitochondrial+DNA+transmission.">Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission.</a> Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).</li><li>Kim, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SESN2/sestrin2+suppresses+sepsis+by+inducing+mitophagy+and+inhibiting+NLRP3+activation+in+macrophages.">SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages.</a> Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).</li><li>Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+detection+of+mitophagy+in+human+cells,+C.+Elegans,+and+mice.">In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 mt Keima을 표현 하는 세포에 세포 mitophagy 활동을 측정 하 cytometry 사용 하기 위한 신속 하 고 중요 한 방법을 제시. Mitophagy의 높은 수준을 겪고 셀 전시 PE CF594의 증가 비율 (561 nm) / BV605 (405 nm) 여기. 따라서, mitophagy 활동 높은 561/405 비율을 전시 하는 셀의 백분율로 나타낼 수 있습니다. 우리 PE CF594의 도트에 "높은" 게이트 영역에서 셀의 비율을 계산 (561 nm) BV605 대 (405 nm), 그리고 결과 CCCP ...

미토 콘 드리 아 세포 증식과 생리학에 필수적인 세포는. 미토 콘 드리 아 생성 산화 인 산화를 통해 ATP 공급의 80% 이상 및 그들은 또한 생 합성 및 대사1,2에 대 한 다양 한 대사 중간체를 제공 합니다. 에너지 공급 및 물질 대사에 그들의 역할 외에도 미토 콘 드리 아 중앙에서 역할 많은 다른 중요 한 프로세스, 반응성 산소 종 (ROS) 생성, 세포 죽음, 그리고 세포내 캘리포니아2 + 역학3의 규칙을 포함 하 여 . 미토 콘 드리 아 기능으로 변경 인간의 질병, 암, 당뇨병, 다양 한 신경 질환4,5등와 연결 되었습니다. 증가 미토 콘 드 리아 기능 장애 및 미토 콘 드리 아 DNA 변이 정상적인 노화 과정6,,78을 생각 된다 또한. 따라서, 품질 관리 미토 콘 드리 아에서 중요 한 문제입니다. 미토 콘 드리 아에는 지속적으로 늘어나는 네트워크와 짧은, 조각난 형태 사이 그들의 모양을 변경할 수 있는 매우 동적인 세포입니다. 미토 콘 드리 아 역학 mitophagy9를 통해 그들의 저하 뿐만 아니라 미토 콘 드리 아의 기능 유지에 중요 한 역할을 한다.
Mitophagy는 autophagy 기계를 사용 하 여 전체 미토 콘 드리 아의 선택적 저하를 포함 하는 메커니즘입니다. Mitophagy 원리 메커니즘 기본 미토 콘 드 리아 회전율과 손상 또는 역 기능 mitochondria의 제거 이다. 이 과정에서 미토 콘 드리 아 막, autophagosomes, 다음 가수분해 저하9리소좀과 융합의 형성의 결과로 처음 둘러싸여 있다. 초파리 에서 유전자 연구 제안 두 파 킨 슨 병 관련 유전자, PTEN 유도 상 상속 키 니 아 제 1 (PINK1) (PARK6) Parkin (PARK2), 동일한 통로10,11에 기능. 시퀸스 연구 PINK1 Parkin 통로 제거 손상 된 미토 콘 드리 아에 대 한 책임 및 역 기능 mitophagy이 통로에 결함을 인간의 질병12,13에 기여할 수 있습니다 나타났습니다. 결함 mitophagy 프로세스에 최근 다양 한 인간 질환, 암, 심장 질환, 간 질환과 neurodegenerative 질병 14를 포함 하 여 발견 되었습니다. 또한, 최근 연구는 또한 나타났습니다 그 mitophagy는 차별화, 개발, 면역 응답15,,1617,18 등 많은 생리 과정에 중요 한 ,19, 제안 하는 mitophagy 세포 기능을 조절에 더 적극적인 역할을 재생할 수 있습니다.
최근 확인 mitophagy 미토 콘 드리 아에서 두 품질 관리에 중요 한 역할 및 인간의 질병, 밑에 mitophagy 분자 메커니즘 제대로 유지에 불구 하 고 이해. Mitophagy 관련 메커니즘에서 효 모 연구 체계적으로, 비록 포유류 세포에서 mitophagy 관련 메커니즘을 탐구 하기 위한 연구 PINK1 Parkin 통로에 주로 집중 했다. 이전 연구는 PINK1 Parkin 통로 주로 mitophagy12,20,21을 통해 손상 된 미토 콘 드리 아의 선택적 제거에 대 한 책임을 설립 하 고 있다. 그러나, 최근 연구는 일부 모델에 mitophagy 활성화 될 수 있다 기능 PINK122,,2324의 부재에도 보고 있다. 이 결과 PINK1 Parkin 통로, 거기 mitophagy를 활성화할 수 있는 추가 미확인된 통로 이외에 하는 것이 좋습니다.
Mitophagy 활동을 평가 하는 편리한 방법의 부재 탐험 경로 mitophagy 및 병 태 생리 이벤트에서의 역할에 중요 한 장애 이다. 전자 현미경 직접 autophagosome를 가득 채우고 미토 콘 드리 아를 시각화 하는 강력한 도구입니다. 그러나, 전자 현미경 mitophagy 활동 측정에 한계가 있다. 비록 microtubule 관련 단백질 1를 사용 하는 전략 빛 체인 3 (LC3)-GFP LC3, 등 활용된 형광 프로브는 현재 가장 널리 사용 되 접근25, LC3 기반 신호의 과도 특성 및 그것의 높은 속도의 허위-긍정 신호 셀26에서 mitophagy을 탐지 하기 위한 그것의 감도 제한 합니다. 미토 콘 드리 아 단백질 수준, autophagosomes 또는 리소좀 미토 콘 드리 아 colocalize 미토 콘 드리 아 DNA, 형광 현미경 분석의 정량화를 측정 하기 위해 서 부 럽의 조합 평가 하기 위한 좋은 방법이 될 것 이라고 mitophagy입니다. 그러나, 정량화 한계 및 기존 방법론의 부족 새로운 접근에 대 한 호출합니다. 새로운 pH 의존 형광 단백질, 미토 콘 드 리아 대상 Keima (mt Keima)의 소개는 크게 mitophagy27을 감지 하는 능력 향상. 시 토 크롬 c 산화 효소 소 단위 VIII (콕스 VIII) Keima로의 미토 콘 드리 아를 대상으로 순서를 융합 하는 여 산 Keima는 미토 콘 드리 아를 감독 이다. 440에서 여기 Keima 피크에에서 큰 변화 586 nm (해당 pH 7과 pH 4, 각각) 수 nm 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험28,29에 민감하게 좋은 mitophagy를 평가 하기 위해 활용 . 더 중요 한 것은, lysosomal 저하 산 Keima의 저항 리소좀, mitophagy 활동의 쉬운 양적 측정에 대 한 허용에 mt Keima 신호 통합을 발생 합니다. Mt-Keima에서 발생 하는 형광 변경 중 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석 될 수 있다 또는 흐름 cytometry28,29. 그러나, mt Keima를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 교류 cytometry 기반 방법까지 자세히 제공 되어 하지 않았습니다.
여기, 우리 산 Keima를 사용 하 여 셀에 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 흐름 cytometry 기반 기술에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 여기에 표시 된 Parkin 표현 하는 HeLa 세포에서 성공적으로 감지 CCCP 유도 mitophagy을 교류 cytometry 분석을, 비록이 기술은 다양 한 셀 형식에 적용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">poly-L-lysine</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:133px;">wellgene</td>
			<td style="width:119px;">LS202-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:133px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30013.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293T</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPTI-MEM&#160;</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Turbofect</td>
			<td style="width:133px;">Thermos scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.45 &#956;m syringe filter</td>
			<td style="width:133px;">sartorius</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polybrene</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9268</td>
			<td>8 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">puromycin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8833</td>
			<td>2 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2759</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:133px;">wellgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EQUIPMENTS</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:133px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSDIVA</td>
			<td style="width:133px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">FACSDIVA (v8.0.1)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive measurement of mitophagy by flow cytometry using the ph-dependent fluorescent reporter mt-keima

Mitophagy 선택적 제거의 autophagy 기계를 사용 하 여 손상 되거나 불필요 한 미토 콘 드리 아의 과정 이다. 결함이 mitophagy 및 신경 퇴행 성 질환, 암, 대사 질환 등 다양 한 인간 질병 사이 가까운 연결이 발견 되었습니다. 또한, 최근 연구는 mitophagy는 차별화 및 개발 등의 정상적인 세포 프로세스에 관여 나타났습니다. 그러나,의 정확한 역할 및 mitophagy 기본 분자 메커니즘 연구를 해야 합니다. 따라서, 그것은 mitophagy 활동에 변화를 측정 하기 위한 강력 하 고 편리한 방법을 개발 하는 중요 한입니다. 여기, 우리는 양적 cytometry 미토 콘 드리 아-타겟 형광 단백질 Keima (mt Keima)를 사용 하 여 통해 mitophagy 활동을 평가 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 더 신속 하 고 민감하게 전통적인 현미경 검사 법 또는 immunoblotting 기반 방법 보다이 흐름 cytometry 분석 결과 mitophagy 활동을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양 한 셀 형식에 mitophagy 활동 분석에 적용할 수 있습니다.

헬러 Parkin 셀에 mitophagy CCCP 유도의 흐름 cytometry 분석의 예는 그림 4에 표시 됩니다. 위에서 설명한 흐름 cytometry 분석 방법을 사용 하 여, 우리는 "높은" 게이트 mitophagic 셀에 극적인 증가 검색할 수 있습니다. "높은" 문 셀의 백분율은 치료 제어 셀 (그림 4A)에 비해 10 배 이상 증가 했다. Mitophagy 활동에 있는이 증가 bafilomycin A (BFA) (<...

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Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy, 미토 콘 드리 아, 선택적 저하 미토 콘 드 리아 항상성에 연루 되어 고 다양 한 인간 질병에 폐지. 그러나, mitophagy 활동을 측정 하기 위한 편리한 실험적인 방법을 매우 제한 됩니다. 여기, 우리는 cytometry를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 중요 한 분석 결과 제공 합니다.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

sensitive-measurement-mitophagy-flow-cytometry-using-ph-dependent

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K 조회수.  Dong-A University. Mitophagy, 미토 콘 드리 아, 선택적 저하 미토 콘 드 리아 항상성에 연루 되어 고 다양 한 인간 질병에 폐지. 그러나, mitophagy 활동을 측정 하기 위한 편리한 실험적인 방법을 매우 제한 됩니다. 여기, 우리는 cytometry를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 중요 한 분석 결과 제공 합니다.

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

연구

생물학

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

격리 된 괴 경 Protoplasts의 Cytometry에 의해 측정 Endoreduplication

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.