Tıbbi Araştırma Konseyi UK (U105115237) RRK için finansman çekirdek için teşekkür ediyoruz.

1. hücre ve malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Hücreleri ya SM ağar kaplamalar Klebsiella aerogenesgibi bakteriler ile birlikte veya HL5 gibi besin Orta tarihinde açıklanan23yetiştirmek. Not: kusurlu macropinocytosis bakteri içinde nakavt mutantlar büyüyen macropinocytosis oranını artırabilir ikincil mutasyonların birikimi önlemek yardımcı olur. En iyi sonuçlar için hisse senedi hücrelerden kaplama sonra geçiş sayısını 4 aşağıda tutun. Mutantlar donmuş hisse senetleri en kısa zamanda yalıtım sonra muhafaza edilmelidir.</li>
	<li>SM ağar kaplamalar hücrelerdeyse yetiştirmek için K. aerogenes izdiham SM ortamda büyümeye. 200 – 300 μL bakteri bir SM agar plaka üzerine ekleyin ve yayıldı. Bir kısır döngü hücre (başka bir bakteriyel tabaktan aktarırken) almak ve plaka bir kenarında yayıldı. Bir haftaya kadar 22 ° c için kuluçkaya.</li>
	<li>Tetra-metil-rodamine isothiocyanate (TRITC-) dextran 50 mg/ml suda çözülür, 1 mL aliquots 0,22 mikron filtre kullanarak filtre uygulama ve -20 ° C'de depolayın Aliquots süresiz olarak saklanır. Not: 155 kDa bu yöntemle, rezervasyon yaptırın toplu olarak satın alınabilir, ama daha küçük dextrans macropinocytosis Dictyostelium24yılında sadece etkili tedbir olarak kullanılan tipik boyutudur. Farklı fluorophores gerekiyorsa art arda sıralı mavi veya Alexa-647, gibi farklı quenchable sigara dextrans alternatifleri vardır.</li>
</ol>2. dönüştürmek içine nicel nitel ölçümleri (isteğe bağlı)
<ol><li>
Bir sıvı alımını tahlil süspansiyon hücrelerde kullanarak gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Axenically büyüyen hücreler 300 x g 3 dk de cips, süpernatant atmak ve besin orta 1 x 107 hücre/mL olarak resuspend. TRITC-dextran 0,5 mg/mL için eklemek ve 180 rpm, 22 ° c sallamak</li>
		<li>Örnekleri 0.7 mL buz gibi KK2 , 0, 30, 60, 90, 120 dk. yıkama içine bir kez buz gibi KK2 arabellek23 ' te benchtop santrifüj 1,5 ml, 1 ml içinde aynı tampon resuspend ve buz üzerinde depolamak 0.8 mL seyreltik. Not: hemen veya tüm örneklerini topladıktan sonra yıkama eşdeğer sonuçlar verir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cilt hücreleri tarafından içselleştirilmiş sıvı belirleyin.
	<ol>
<li>Floresan bir uyarma dalga boyu 544 nm ve emisyon dalga boyu 574 kullanarak ölçmek için fluorimeter ayarla nm 10 nm kesilmiş. TRITC-dextran seyreltme serisi ayarladıysanız ve floresan için verilen ölçmek için kullanabilirsiniz dextran hacimleri. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.</li>
		<li>Bölüm 2.1 hücre süspansiyon 0.9 mL kullanarak hücreleri tarafından içselleştirilmiş floresans ölçmek. Kalibrasyon eğrisi24kullanarak hücre başına içselleştirilmiş sıvı hacmi hesaplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her zaman noktasına ayrı olarak 0.5 mL buz soğuk KK2hücrelerden kalan sulandırmak. 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 5 mL polistren akış sitometresi tüpler içine filtre. Her zaman noktası hücrelerden birbirinden farklı ve onların floresans kayıt akış sitometresi ayarlayın (3.4 ve 3.5 bölümlerine bakın).</li>
	<li>Yukarıdaki ayarları kullanarak akış sitometresi kalibrasyon boncuklar floresans ölçmek ve kaydedebilirsiniz. Not: Bu akış sitometresi üzerinde tüm gelecekteki floresans ölçümler için referanstır: tekrar kullanmadan önce boncuk çalıştırın ve öylesine onlar-si olmak aynı floresans ayarlarını yapın. Bu çok dar tanımlı en yüksek verecektir. Bir kapı floresans tepe etrafında koyarak bu kolaylık sağlar.</li>
	<li>Üç kez tekrarlayın ve bölümlerde 2.2 ve 2.3 birbirlerine karşı elde edilen hücre floresans verileri çizmek. En uygun bir çizgi çizmek ve denklemi nitel veri akış sitometresi nicel birimlerine dönüştürmek için kullanın.</li>
</ol>3. ölçme sıvı alımı
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig1.jpg"> Şekil 1: macropinocytosis yüksek üretilen iş ölçüm şematik. (A) Grow Dictyostelium bir SM plaka numaralı seribaşı ile K. aerogenes bakteri (sarı). Zaten Gelişmiş hücre kaçınarak hücrelerden besleme açık (turuncu), (yeşil), KK2 arabellek 25 mL hasat. Ayırmak için girdap tarafından 3 dk aralıklarla 300 x gde cips, sonra 3 kez 50 mL KK2 arabelleği, her zaman süpernatant atarak yıkayın. 1 x 105 hücre/ml HL5 büyüme orta resuspend ve 50 µL örnek bir düz dipli 96-şey plaka başına üç kuyu içine ekleyin. 22 ° c 24 h için (B) seyreltik TRITC-dextran 1 mg/ml HL5 büyüme orta olarak 50 mg/mL stok bir çözümden kuluçkaya. 50 µL (0 dak alımını kontrol wells hariç) her örnek ekleyin ve sonra hangi dextran 0 min alımı denetimine ekleyin 22 ° c için 1 h, kuluçkaya. (C) hemen medya dikkatle boşaltmak, plaka üzerinde aşırı orta kaldırmak ve banyo yıkamak için kuyu doldurma buz gibi KK2 arabellek daldırın bir doku pat. Arabellek dikkatle boşaltmak ve yine kuru pat. 5 mM sodyum azid KK2' hücreleri ayırmak için MC çözünmüş 100 µL ekleyin. Akış Sitometresi içselleştirilmiş floresans ölçümü için almak. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol><li>
Bir düz oturaklı 96-iyi doku kültürü tabak (Şekil 1A) ayarlayın. Hücreleri bakteri ve onları daha önce tahlil; 24 h HL5 Orta (içeren 100 µg/mL dihydrostreptomycin, 100 µg/mL ampisilin ve 50 µg/mL sefaloridin) aktarmak için kullanma Bu upregulated bakteri24tarihinde yetişkin hücrelerinde görülen düşük düzeylerde olmak macropinocytosis sağlar. Alternatif olarak, doğrudan axenic kültür hatalar farklı yoğunlukları seyreltilmiş hücreleri nedeniyle azaltmak için tahlil önce 24 h için kuluçka, hücrelerden oranında seyreltin.<ol>
<li>Hasat hücrelerden besleme ön KK2 50 mL santrifüj tüpü 25 mL içine. Hücreleri vortexing ve 300 x g 3 dk.. için de pelet tarafından ayırmak Süpernatant atmak, Pelet resuspend ve 300 x g KK2her zaman bakteri kaldırın süpernatant atarak, 3 dk 50 ml için de 3 kere yıkayın.</li>
		<li>(Bir hemacytometer veya diğer hücre sayım sistemi kullanarak) hücre yoğunluğu belirlemek ve içine HL5 içeren antibiyotikler 1 x 105 hücre/ml seyreltik. 50 μL her kuyuya pipet üç kuyu her koşul için kullanma. 22 ° c 24 h 0 min alımı denetimi ayarlamak için anımsa için kuluçkaya. Not: Bir alternatif orta, Örneğin SIH, VL6-ebilmek var olmak kullanılmış onun yerine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücreler ile TRITC-dextran (Şekil 1B) yükleyin.
	<ol>
<li>1 mg/ml kullanılan orta dextran seyreltik (Bu 2.5-5 mg/mL için çok düşük alımı hücrelerle değerlendirirken artırılabilir). 50 μL (0,5 mg/mL TRITC-dextran son bir konsantrasyon vererek) her şey eklemek ve plaka 22 ° C için 1 h, bu önemli dextran birikimi sağlar ancak dextran ekzositozu henüz başlamamış gibi geri dönün. Not: hata azaltarak daha hızlı yapılması için bu adımı tekrarlayıcı pipet sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücreleri akış sitometresi (Şekil 1 c) için hazır olun.
	<ol>
<li>Hemen yıkama önce 0 min alımı denetimlere 50 μL dextran içeren medya ekleyin.</li>
		<li>Orta dikkatle boşaltmak ve bir doku üzerinde kuru pat. Buz gibi KK2plaka batış tarafından yıkayın, sonra dikkatle boşaltmak. Not: bazı suşları bağlılık kusurları ile bu adım sırasında Örneğin her iki Talin homologs nakavt müstakil hale (talA-/ talB -)25. Kötü iliştirin ve gerekirse medya Aspire hücre hatları ile çalışırken dikkatli olun.</li>
		<li>Buz gibi 5 mM sodyum azid KK2' MC (KK2 + 2 mM MgSO4 ve 100 mikron CaCl2) çözünmüş 100 μL ekleyin. Dikkat: Sodyum azid son derece zehirlidir. Toz maskesi ve koruyucu gözlük tozu ile çalışırken kullanın. Her zaman eldiven ve önlük giymek. Isı önlemek ve asit ile birlikte kullanmayın. Not: Hücreleri hızla ayırmak ve ekzositozu EngellediBRÜKSEL24' tür. Mikroskop bunu denetlemek için kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akış Sitometresi tarafından ölçü sıvı alımı
	<ol>
<li>Eğer mutlak olanlar için göreli değerleri dönüştürmek planlama, boncuk (bkz: 2) akış sitometresi ayarları standart hale getirmek için kullanın. Alternatif olarak, kullanım hücreler olarak bölümde ileri dağılım ve yan dağılım uygun şekilde hücreleri (Şekil 2A), makine bloke değildir, sağlanması yalıtmak için ayarlandığından emin olmak için 2 dextran (Şekil 2B) yüklü ve parametrelerini ayarlamak içselleştirilmiş Floresan (Şekil 2C) ölçmek.</li>
		<li>Sistem yüksek üretilen iş örnekleme ekleyin ve plaka ekleyin. (TRITC-dextran kullanmak için sarı-yeşil lazer heyecanlandırmak ve 582 nm kanal veya benzer ölçmek için) Floresan ölçmek için bir protokol hazırlamam ayarla, 65 μL hücre süspansiyon ve Çalıştır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akış Sitometresi sonuçlarını analiz
	<ol>
<li>İleri dağılım ve yan dağılım (Şekil 2A) kullanarak hücreleri kapıda. Ortalama floresans İstatistikler seçeneğini kullanarak hücre hesaplama. Bir örnek kullanarak bu parametreleri ayarlayın ve tüm örnekleri için geçerlidir. Not: İleri dağılım/yana dağılım profilleri farklı mutantlar veya inhibitörleri kullanıldığında örnekleri arasında değişebilir.</li>
		<li>Her koşul için üç kuyular ortalamasını belirlemek ve 0 dk alımını kontrol çıkarın. Ya 2 bölümünde belirlenen denklemi kullanarak sayısal değerleri dönüştürmek veya denetime normalleştirmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. performans gösteren sıvı alımı zaman-Dershaneler
<ol><li>Hücreleri olarak bölümde 3, üç kuyular için her zaman nokta ve zorlanma/koşulu ile ayarlayın.</li>
	<li>Dextran etiketli orta farklı wells için sırayla ekleyin. Tipik bir zaman ders sıvı alımını ölçer 0, 30, 60, 90 120 ve 180 dk. 60 dk sonra kuyular için 120 dk süresi noktası ekleyerek takip 180 dk zaman noktası kuyuları için orta dextran içeren eklemek vb (Şekil 3A).</li>
	<li>0 dk az 50 μL dextran içeren eklemek orta ve hemen dikkatle boşaltmak ve plaka 3.3 bölümde olduğu gibi yıkayın. 3.5 bölümünde açıklandığı gibi analiz.</li>
</ol>5. doz yanıt eğrileri
<ol><li>Hücreleri bölümünde 3, üç kuyular için her zorlanma ve koşulu ile açıklandığı gibi ayarlayın.</li>
	<li>Bileşik faiz bileşik Çift istediğiniz maksimum son konsantrasyon , 1 mg/mL dextran içeren orta içine oranında seyreltin. Araç aynı oranda ilk olarak ile dextran ile orta içeren ikinci bir tüp hazırlayın. Girdap karıştırmak için.</li>
	<li>Örnek (Şekil 4A) başına orta içeren 200 μL dextran ilgi bileşik seyreltme serisi oluşturmak. Girdap karıştırmak için. Her örnek 1 h için iyi orta 50 μL ekleyin.</li>
	<li>Yıkama ve bölümde 3.3 itibaren açıklandığı gibi analiz.</li>
</ol>6. fagositoz ve membran alımı
<ol><li>Membran alımını ölçmek için madde 3 te açıklandığı gibi hücreleri hazırlayın. 20 mikron FM 1-43 için 10 mikron son bir konsantrasyon içeren orta 50 μL ekleyin. Yükleme sonra yıkayın ve akış sitometresi olarak bölümde 3.3 hücreleri hazırlamak. 585 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için mavi lazer kullanarak ölçmek. Not: membran kaçakçılığı sıvı fazlı daha hızlı olduğundan, 10 min 1 h26' dan kullanmak için bir daha uygun zaman noktasıdır. Yalnızca membran dahil zaman bulabilsem alternatif boya yerine kullanılabilir.</li>
	<li>
Fluorescently etiketli boncuk veya bakteri fagositoz ölçmek için kullanın. Gibi onlar ayrılmaz Dictyostelium tarafından ileri gelen ve yan dağılım24floresan Maya kullanılamaz. Hücreleri 3 bölümde açıklandığı gibi ayarlayın ve açıklanan27analiz.<ol>
<li>Fagositoz boncuk ekleyin sarı-yeşil etiketli bölümde 5 x 107 boncuk/mL (1,75 ve 2 mikron) veya 1 x 108 boncuk/mL (1 ile 1,5 mikron) 3.2 son bir konsantrasyon için 1 h için yıkama ve akış sitometresi anlamında hazırlama önce açıklandığı gibi boncuk ölçmek için Bölüm 3.3. 525 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için mavi lazer kullanarak ölçmek. Not: Daha yüksek konsantrasyonlarda hücre dekolmanı götürecek.</li>
		<li>Fagositoz bakterilerin ölçmek için Texas-kırmızı etiketli Escherichia coli bioparticles Bölüm 3.2-1 x 108 bakteri/mL 1 h için yıkama ve akış sitometresi olarak bölümde 3.3 hazırlama önce açıklandığı gibi ekleyin. 610 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için sarı-yeşil lazer kullanarak ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bloomfield, G., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uses+and+abuses+of+macropinocytosis.">Uses and abuses of macropinocytosis.</a> Journal of Cell Science. 129 (14), 2697-2705 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocompatibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).</li><li>Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.+typhimurium+encodes+an+activator+of+Rho+GTPases+that+induces+membrane+ruffling+and+nuclear+responses+in+host+cells.">S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells.</a> Cell. 93 (5), 815-826 (1998).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells.">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).</li><li>Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-phase+uptake+by+macropinocytosis+in+Dictyostelium.">Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium.</a> Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).</li><li>Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+ruffle+formation+and+closure+lead+to+macropinocytosis+in+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor-treated+cells.">Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells.</a> European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).</li><li>Buczynski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+two+Dictyostelium+discoideum+genes,+DdPIK1+and+DdPIK2,+encoding+proteins+related+to+mammalian+phosphatidylinositide+3-kinases,+results+in+defects+in+endocytosis,+lysosome+to+postlysosome+transport,+and+actin+cytoskeleton+organization.">Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization.</a> Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).</li><li>Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+the+completion+of+macropinocytosis+and+phagocytosis+by+macrophages.">A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).</li><li>Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+metabolism+during+membrane+ruffling+and+macropinosome+formation+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells.</a> Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).</li><li>Clark, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+uses+ether-linked+inositol+phospholipids+for+intracellular+signalling.">Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling.</a> The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).</li><li>Hoeller, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+functions+for+PI3-kinases+in+macropinocytosis.">Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis.</a> Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).</li><li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+membrane+ruffling+and+fluid-phase+pinocytosis+in+quiescent+fibroblasts+by+ras+proteins.">Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins.</a> Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> Elife. 5, e20085 (2016).</li><li>West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+is+required+for+constitutive+macropinocytosis+by+dendritic+cells+but+does+not+control+its+downregulation.">Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation.</a> Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li><li>Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+fusion+and+microtubule-based+dynamics+in+the+early+endocytic+pathway+of+Dictyostelium.">Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium.</a> Traffic. 3, 791-800 (2002).</li><li>Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCL12-induced+macropinocytosis+modulates+two+distinct+pathways+to+activate+mTORC1+in+macrophages.">CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).</li><li>Rivero, F., Maniak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+microscopic+methods+for+studying+the+endocytic+pathway.">Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway.</a> Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).</li><li>Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum+mutants+with+temperature-sensitive+defects+in+endocytosis.">Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis.</a> Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).</li><li>Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2015:+Expanding+data+and+annotations+in+a+new+software+environment.">dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment.</a> Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).</li><li>Williams, T. D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+macropinocytosis+during+Dictyostelium+growth+and+development.">The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Tsujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+functions+of+the+two+talin+homologues+in+Dictyostelium.">Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium.</a> Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).</li><li>Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulation+of+the+plasma+membrane+in+Dictyostelium.">Circulation of the plasma membrane in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 4419-4427 (1999).</li><li>Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+phagocytosis+and+phagosome+maturation.">Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation.</a> Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).</li><li>Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Dictyostelium+RasGEF+is+required+for+normal+endocytosis,+cell+motility+and+multicellular+development.">A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development.</a> Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).</li><li>Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mroh1,+a+lysosomal+regulator+localized+by+WASH-generated+actin.">Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin.</a> Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).</li><li>van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+cells+with+a+depolarized+plasma+membrane+potential.">Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential.</a> Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).</li><li>Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+myosin+I+double+mutants+exhibit+conditional+defects+in+pinocytosis.">Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+uses+macropinocytosis+and+apoptotic+mimicry+to+enter+host+cells.">Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells.</a> Science. 320 (5875), 531-535 (2008).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).</li><li>Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+stop+shop+for+everything+Dictyostelium:+dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center+in+2012.">One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012.</a> Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Sıvı alımını değerlendirmek için diğer yöntemleri iş hızı düşük ise, hücre içinde in situ ve hücreleri ayırmak için sodyum azid kullanımı yıkama macropinocytosis, membran alımı, yüksek üretilen iş ölçümü sağlayan kritik bu yöntemde adımlardır veya fagositoz tarafından Dictyostelium. Hücreleri bir yüzeye bağlı olan ve orta değil gibi onlar Orta çevrelerindeki ilk kapalı atılmış ise sol bağlı ve arabellek daldırma tarafından değiştirildi ve yine kapalı atılmış. Hangi hücresel ATP tüketir ve membran30depolarizes, sodyum azid sonra hücreleri ayırmak için kullanılan ve aynı zamanda hücre canlılığı24etkilemeden ekzositozu önler.
Macropinocytosis Dictyostelium tarafından ölçmek için akış sitometresi kullanarak sıvı alımı çok hassas bir ölçüm çok hızlı bir şekilde belirli zorlanma veya koşul sıvı alımı, neden değiştirdi neden kurmak için verir iken soruşturma kullanarak daha fazla Mikroskopi gerekli24' tür. Bu aynı zamanda daha önce yayımlanmış sonuçlar bazı durumlarda, sıvı alımını bir fark göstermiştir mutant suşları ya (Bu durumda), olduğu gibi bir yüzey üzerinde yetiştirilen tarafından unutulmamalıdır veya süspansiyon (olduğu gibi standart iletişim kuralı)31sallayarak. Bu yöntemi kullanarak nadir de olsa bazen belirgin sıvı alımını kusurları cevapsız, anlamına gelebilir. Ayrıca, ne zaman fagositoz ölçme, sadece düşük konsantrasyonlarda parçacıkların kullanılabilir. Fagositoz suşları ve koşullar24arasında ilgili farklılıklar ölçmek mümkün olmasına rağmen en fazla bu tekniği ile tespit edilebilecek fagositoz kadar gerçek maksimum oranıdır. Fagositoz en yüksek hızı belirlemek için alımını süspansiyon sallayarak bir alternatif iletişim kuralı27tarafından ölçülen gerekir. Bunun için buna göre akış sitometresi ayarlarken düzeltilmesi gerektiğini bu yüzden boncuk fagosite hücreleri yan dağılım, artmıştır.
Akış Sitometresi memeli hücreleri32içinde sıvı alımını ölçmek için kullanılabilir, ancak sıvı yüksek oranda aşama alımı endositik diğer yolları tarafından Dictyostelium görülen bir sorundur. Ayrıca, hücreleri genellikle daha fazla içselleştirilmiş dextran endositik ilerlemesini sağlayan 37 ° C'de tripsin kullanarak ayrılır. Buz gibi sodyum azid makrofajlar bu teknik daha fazla optimizasyon olmaksızın memeli hücreleri için geçerli değildir yapma (Williams, yayınlanmamış gözlem) bir yüzey, ayırmak neden olmaz.
Yüksek işlem hacmi ölçümü macropinocytosis inhibitörleri, genetik mutasyon veya gen nakavt etkileri Dictyostelium hücrelerde için hızlı ve ucuz ekran için kullanılan potansiyeline sahiptir. Mutantlar her zaman onların doğrudan üst'e sadece karşılaştırılmalıdır. Okuyucu Dictyostelium zorlanma için önceden hiçbir tercih varsa, axenic sigara suşları DdB veya NC4 gibi daha "vahşi axenic olanlardan daha tipi" ve axenic suşları33olarak etkili bir şekilde manipüle edilebilir. Aksi takdirde, Ax2 suşları axenic olan suşları ile iken Ax4 birçok suşu Talin A altını gizleme ve olması gereken en az sayıda genom mükerrer34, kaçınılması mümkünse23. Daha önce yayımlanmış suşlarının en Dicty stok Merkezi35sipariş edilebilir.
Bu teknik daha önce farklı koşullar, inhibitörleri ve mutasyonlar macropinocytosis Dictyosteliumtarafından üzerinde etkileri içine mümkün olandan daha fazla araştırma olanakları sağlar.

Büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımını macropinocytosis tarafından birkaç biyolojik bağlamlarda1' de, önemli olan antijen örnek bağışıklık yanında da dahil olmak üzere hücreleri2, patojen giriş ana hücreleri içine3, kanser hücre proliferasyonu4 ve prion hastalıkları5/ yayılıyor. Memeli ve Dictyostelium hücreleri, aktin6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (lipid kesin yapısını iki11arasında farklı olsa da), aktif Her ne kadar orada kalır macropinocytic yama nasıl hakkında cevaplanmamış birçok soru Ras12,13ve aktif Rac14,15 macropinocytosis tarafından verimli sıvı alımı için önemlidir. , organize ve sonunda içselleştirilmiş kurdu. Macropinocytosis daha kapsamlı bir anlayış vermek daha fazla protein macropinocytosis ve çeşitli biyolojik bağlamlarda nasıl önemliler sonraki belirlenmesi için önemli keşfetmek ve gelişmesine olanak sağlayabilecek koşullar bir dizi için hedeflenmiş tedaviler.
Dictyostelium macropinocytosis okuyan bir ideal modeli sistemidir. Standart laboratuar suşları bünye macropinocytosis yüksek düzeyde o sıvı alımı üzerinde macropinocytosis6nedeniyle % 90'ı demektir. Bu sadece memeli hücreleri macropinocytosis nedeniyle sıvı alımı oranı çok daha düşük nerede farklı olarak sıvı alımını belirlenerek ölçülecek macropinocytosis sağlar. Macropinocytosis çok iyi tanımlanmış ve bu sistemde kolayca görüntülenmeyecektir12 benzer şekilde sunan soruşturma için farklı avantajlar çekirdek macropinosome korunmuş bileşenlerinin diğer sistemleri üzerinde olabilir yerde birden çok düzenleyici sinyaller 16 , 17.
Macropinocytosis ölçmek için memeli hücreleri tarafından kullanılan standart teknik dextran pozitif veziküller18tarafından işgal bir hücre alanı belirlemek için mikroskobu ardından kısa bir süre için dextran ile darbe sonra hücreleri tamir içerir. Bu teknik ancak Dictyostelium19' bildirdi ve sadece tek uçak hücrenin içselleştirilmiş birim anlamı dikkate alır hücre, girdikten sonra daralma macropinosomes olasılığı için hesaba katmaz belli değil. Belirli bir süre içinde içselleştirilmiş macropinosomes sayılması alternatif bir tekniği, aynı downsides20vardır. Dictyostelium kullanarak bu sorunları önler; Ancak, Dictyostelium tarafından sıvı alımını ölçmek için varolan teknikleri nispeten hücreleri ve dextran21emek yoğun, büyük bir kullanarak miktarı vardır. Hücreleri yüksek yoğunluklu floresan dextran ve çeşitli noktalarda zaman-bir fluorimeter kullanarak içselleştirilmiş floresans tespiti için kaldırıldı örnekleri sarsıldı. Her ne kadar bu düşük işlem hacmi kalır bu şekilde hazırlanan hücreleri tek hücre, tercihan--dan nüfus düzeyi, çözünürlük22, kazanmak için akış sitometresi tarafından çözümlenebilir.
Burada, içselleştirilmiş sıvı floresan dextran etiket olarak kullanarak ölçmek için standart teknik yüksek üretilen iş örnekleme (HTS) eki kullanarak akış sitometresi tarafından analiz örnekleri ile bir 96-şey plaka biçimine adapte olduğunu. Hücreler için önceden belirlenmiş bir süre boyunca buz gibi soğuk arabellek daldırma tarafından yıkanmış ve ayrıca ekzositozu durur 5 mM sodyum azid kullanarak müstakil quenchable floresan dextran beslenir. Her şey hücrelerde sonra akış sitometresi tarafından incelenir. Bu yöntem yukarıdaki yöntemleri sınırlamalarının üstesinden gelir ve daha az kaynak kullanarak ve işçilik dahil azaltarak eşzamanlı suşları/koşullar çok sayıda sıvı alımını karşılaştırılması izin vermek için tasarlanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LSR_II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran (155 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1287</td>
			<td>Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5 medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>HLGCFG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrostreptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Formdium</td>
			<td>AMP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103694M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate hydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25169.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phopshate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.04877.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-potassium hydrogen phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.05104.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>LS 50 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>T35356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>15702-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>09719-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17687-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>09847-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red E. coli bioparticles</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>E2863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow-set fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6607007</td>
			<td>Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>SMACFG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Elkay Laboratory Products</td>
			<td>E25-PS22-50S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352058</td>
			<td>Use a tube that will fit onto your flow cytometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeating pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4-SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL repeating pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>70920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry

Büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımını macropinocytosis tarafından bazı kanser hücreleri, antijen örnekleme, konak hücre işgali ve nörodejeneratif hastalıkların yayılması yayılması için önemlidir. Amip Dictyostelium discoideum yaygın olarak kullanılan laboratuar suşları hangi yüzde 90'ını macropinocytosis nedeniyle bitti besin ortamda büyüdü son derece yüksek sıvı alımını oranlarına sahip. Buna ek olarak, birçok memeli macropinocytosis bilinen çekirdek bileşenlerinin da macropinocytosis çalışmak için bir mükemmel model sistem yapım mevcuttur. Burada, içselleştirilmiş sıvı floresan dextran etiket olarak kullanarak ölçmek için standart teknik yüksek üretilen iş örnekleme (HTS) eki kullanarak akış sitometresi tarafından analiz örnekleri ile bir 96-şey plaka biçimine adapte olduğunu.
Hücreler için önceden belirlenmiş bir süre boyunca buz gibi soğuk arabellek daldırma tarafından yıkanmış ve ayrıca ekzositozu durur 5 mM sodyum azid kullanarak müstakil quenchable floresan dextran beslenir. Her şey hücrelerde sonra akış sitometresi tarafından incelenir. Yöntem aynı zamanda membran alımı ve fagositoz floresan boncuk veya bakteri ölçmek için adapte edilebilir.
Bu yöntem yüksek üretilen iş, emek ve kaynak verimli şekilde Dictyostelium tarafından sıvı alımını ölçümü izin vermek için tasarlanmıştır. Birden fazla suşları (Örneğin bir genin nakavt mutantlar) ve koşullar aynı anda karşılaştırma sağlar(hücreleri farklı medya veya inhibitörü farklı konsantrasyonları ile tedavi) paralel ve zaman-Dershaneler kolaylaştırır.

Bir kez gerçekleştirilen teknik ve hücreleri dextran ile dolu ve analiz (Şekil 1) için akış sitometresi engellenmiş değil emin olmak ve Şekil 2Agösterildiği hücreler gibi bakmak için ileri dağılım/yana dağılım profili ayarlayın. Makine engellenmişse, daha böyle gösterildiği 2B şekil -ecek bakmak ve devam etmeden önce engellenmemiş olması gerekir. Parametrelerini göster denetim axenic hücreleri var uzun zaman noktalarda yüksek içselleştirilmiş dextran floresans ve daha kısa olanları, düşük içselleştirilmiş floresans sağlamak (Şekil 2C).
Mutantlar arasında farklılıklar ararken, bir üç fenotipleri olacağını muhtemeldir. Mutantlar normal sıvı alımı olabilir, kısmi bir kusur olabilir veya sıvı alımını tamamen kaldırılmış olabilir. Şekil 2B bir gerilme ile normal sıvı alımı, gösterir bu durumda Standart laboratuvar gerginliği Ax2, bir mutant bir ~ %50 ile azaltmak sıvı alımı (Ax2 rasG-14) ve bir ile sıvı alımı (Ax3 gefB-28) kaldırılmış. Ortalama medyan sıvı alımı (Bölüm 3.5) elde etmek ve ( Şekil 3Bolduğu gibi) içselleştirilmiş sıvı hacmi hesaplamak veya bir denetime verileri karşılaştırmak için kullanabilirsiniz ( Şekil 4B olduğu gibi ve 4 C).
Şekil 3A, olduğu gibi bir sıvı alımını zamanlı kurs gerçekleştirirken içselleştirilmiş floresans 60-90 dk için sonra exocytosed dextran başlar, artması gerektiğini ve bir plato (Şekil 3B) ulaşılır. 60 dk macropinocytosis farklı mutantlar/koşullarda bu nedenle ulaşılması için iyi bir sinyal verir ve sinyal yok ekzositozu nedeniyle kayıp olduğunda standart saati noktası olarak kullanarak. Mutantlar nerede ekzositozu ciddi engel bir plato29ulaşmak için daha uzun sürebilir.
Ne zaman tedavi Dictyostelium ( 4A rakamolarak ayarlanır), macropinocytosis karşı etkilidir inhibitörleri ile 1s içinde içselleştirilmiş dextran hücreleri aşağı hemen hemen hiçbir şey, çoğu durumda daha yüksek inhibitörü konsantrasyonlarda gidecek (Şekil 4B). Bazı inhibitörleri % 100 etkili olmayabilir, ancak, Örneğin nocodazole sadece akut eklendiğinde macropinocytosis tarafından sıvı alımını % 50'engeller (Şekil 4 c). İnhibitörleri etkili değilse, hücreler dextran denetim olarak benzer bir miktar içselleştirmesi ve floresan bir düşüş değil görülecektir. Bu teknik çok sayıda farklı inhibitörleri ve sıvı alımını üzerindeki etkileri için macropinocytosis tarafından çok hızlı bir şekilde taranması için inhibitör konsantrasyonlarının inhibitörü tedavisi en iyi duruma getirme harcanan zamanı azaltır sağlar.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig2.jpg"> Şekil 2: Akış Sitometresi ve temsilcisi veri kümesi kadar. (A) hücreleri kolayca ayırt edilebilir böylece ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) profilleri hücre ayarlanmalıdır. Ax2 hücreleri görünmelidir nasıl bir örnek gösterilir. (B) akış sitometresi engellenmişse, bu örnekte olduğu gibi çok düşük dağılım hücreleri var. Lazer fluorophores düzgün heyecanlandırmak değil ve devam etmeden önce makine unblocked olmalıdır. Herhangi bir veri iken makine engellendi elde atılmalıdır. (C) böylece 0 min alımı örnek hücreleri için inkübe bağlandığınızda artırır düşük floresan, floresans Williams & Kay 201824alınan bu örnekte gösterildiği gibi floresan ortamda uzun ayarlanması gerekir. (D) örnekler ile normal macropinocytosis (Ax2, yeşil), 1 h için TRITC dextran ile inkübe hücre macropinocytosis (Ax2 rasG -, HM172614, turuncu) azaltılmış ve macropinocytosis (Ax3 gefB -kaldırıldı HM177628, mavi). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig3.jpg"> Şekil 3: 96-şey levha sıvı alımı zaman-Dershaneler gerçekleştirme. (A) Dextran var olmak mülhak her el örnekleri için sırayla, aynı bitiş saati ile. Sonra yıkayın kuyuları, ayırmak ve akış sitometresi tarafından içselleştirilmiş floresans ölçmek. Örnek kez dextran eklemek için burada gösterilir. (B) sıvı alımı zaman-ders Ax2 hücre 96-şey levha gerçekleştirilen. Williams & Kay 201824alınan, hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig4.jpg"> Şekil 4: sıvı alımı doz yanıt eğrileri. (A) ilgi 1 mg/mL TRITC-dextran, Çift Kişilik istenen son maksimum konsantrasyon içeren bu durumda PI3K inhibitörü LY294002, HL5 için bileşik ekleyin. HL5 büyüme orta + 1 mg/mL dextran araç yalnız koşul başına 200 µL orta seyreltme dizi oluşturmak için çeşitli oranlarda içeren ile karıştırın. Kuyu 1 h için normal olarak yıkama ve içselleştirilmiş floresans ölçme önce ekleyin. (B) sıvı alımı doz yanıt eğrisi Ax2 hücreler için aLY294002 içeren orta ile inkübe. Williams & Kay 201824uyarlanmıştır. Sıvı alımını tedavi edilmemiş bir denetim için normalleştirilmiş. Hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. (C) sıvı alımı doz yanıt eğrisi Ax2 hücreler için nocodazole ile inkübe. Williams & Kay 201824uyarlanmıştır. Sıvı alımını tedavi edilmemiş bir denetim için normalleştirilmiş. Hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry at JoVE.com

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımı, klinik biyoloji İmmünoloji, enfeksiyon, kanser ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok alanda önemlidir. Burada, mevcut teknikleri macropinocytosis model organizma Dictyostelium discoideum kullanarak macropinocytosis ölçümü akış sitometresi yüksek üretilen iş, tek hücreli çözümleme'ye izin için adapte edilmiştir.

Dictyostelium discoideum Macropinocytosis akış sitometresi tarafından yüksek üretilen iş ölçümü

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

high-throughput-measurement-dictyostelium-discoideum-macropinocytosis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

7.7K Görüntüleme.  MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK. Macropinocytosis, büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımı, klinik biyoloji İmmünoloji, enfeksiyon, kanser ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok alanda önemlidir. Burada, mevcut teknikleri macropinocytosis model organizma Dictyostelium discoideum kullanarak macropinocytosis ölçümü akış sitometresi yüksek üretilen iş, tek hücreli çözümleme'ye izin için adapte edilmiştir.

Video: High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Biyoloji

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

Çevre Örneklerinde Organik P Yüksek Verim Ölçme ve Sınıflandırma

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular development program, during which single cells chemotax towards aggregation centers1-4. This process is dependent on the release of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)5. cAMP is produced in waves through the concerted action of adenylate cyclase and phosphodiesterases, and binds to G protein-coupled cAMP receptors6,7. A widely used assay to analyze the mechanisms involved in the developmental cycle of the lower eukaryote Dictyostelium discoideum is based on the observation of cell aggregation in submerged conditions8,9. This protocol describes the analysis of the role of coronin A in the developmental cycle by starvation in tissue-culture plates submerged in balanced salt solution (BSS)10. Coronin A is a member of the widely conserved protein family of coronins that have been implicated in a wide variety of activities11,12. Dictyostelium cells lacking coronin A are unable to form multicellular aggregates, and this defect can be rescued by supplying pulses of cAMP, suggesting that coronin A acts upstream of the cAMP cascade10. The techniques described in these studies provide robust tools to investigate functions of proteins during the initial stages of the developmental cycle of Dictyostelium discoideum upstream of the cAMP cascade. Therefore, utilizing this aggregation assay may allow the further study of coronin A function and advance our understanding of coronin biology.

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Erken Açlık Tepki Koronin A Fonksiyonu incelenmesi<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Toplama Tahliller

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Dictyostelium discoideum Macropinocytosis akış sitometresi tarafından yüksek üretilen iş ölçümü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler