Tüm mevcut ve eski Kunkel laboratuvar Üyeler kendi çalışmaları için teşekkür ediyoruz ve tartışmaları ile ilgili protokolü için ve burada sunulan verileri yeniden. Bu eser proje Z01 ES065070 tarafından bölümü, Intramural araştırma--dan Ulusal Sağlık (NIH), Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) Enstitüleri T.A.K. için destek verdi.

1. alkali hidroliz ve Strand özgü Southern Blot (Şekil 1)
<ol><li>Hücre büyümesi ve genomik DNA izolasyon<ol>
<li>Bir Maya DNA arıtma kit üreticinin talimatları kullanarak Maya genomik DNA izole et. Üstel büyüme (0,5 bir optik yoğunluk) ile 1 arasında aşamasında olan kültürler kullanın. Son DNA Pelet 35 ml 1 x TE arabellek (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) resuspend.</li>
		<li>DNA'yı 5 mg/mL RNase A 1 mL ekleyin ve 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
		<li>3 M sodyum asetat (pH 5.2) 0.1 birimleri kullanma DNA çökelti ve %2.5 100 etanol için buz üzerinde 20 dk hacimleri.</li>
		<li>4 ° C'de 20 dk için 16.000 x g, santrifüj Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Pelet iki kez 500 mL % 70 etanol ile yıkayın. Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Pelet bankta kuru ve 35 ml 1 x TE arabellek resuspend.</li>
		<li>Bir fluorimeter (Malzeme tablo) dsDNA BR tahlil kiti ile kullanarak DNA quantitate.</li>
		<li>DNA 5 mg 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve 2.5 birimleri %100 0.1 birimleri kullanma her örnekten çökelti alkol için 200 mL toplam hacmi (H2O tarafsız jel denetim gerekli ise DNA'ın gerekli, ek 5 mg gerekirse ekleyin). 20 dk için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>4 ° C'de 20 dk için 16.000 x g, santrifüj Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Pelet bankta kuru. DNA 14 mL H2O. resuspend</li>
	</ol></li>
	<li>Alkalin hidroliz ve jel elektroforez<ol>
<li>1 M KOH 6 mL ekleyin ve 55 ° c 2 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Örnekleri 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>6 x alkalin DNA yükleme arabellek 4 mL ekleyin: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, % 18 polysucrose (Malzeme tablo), % 0.15 bromocresol yeşil ve % 0.25 ksilen cyanol FF.</li>
		<li>% 1'özel, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0 oluşan bir alkali jel döküm. DNA örneği için 24 mL lane yüklenmesine olanak sağlar bir tarak kullanın.</li>
		<li>1 x alkalin Elektroforez arabellek içinde oda sıcaklığında jel çalıştırın: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Uygun bir DNA boyutu işaretleyici içerir.</li>
		<li>Kısaca tüpler spin ve tüm 24 mL örnek Alkalin özel jel yükleyin. 30 V, 18-20 h tarafından 10 V izleyen 30 dk için electrophorese.</li>
		<li>45 dk her nazik ajitasyon nötralizasyon tampon ı: 1 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl ile Oda sıcaklığında 2 incubations için jel etkisiz hale getirin.</li>
		<li>DNA'yı etkisiz jel 200 mL su 1/10.000 seyreltme nazik sallayarak ile Oda sıcaklığında 2 h için SYBR altın leke, içeren ıslatarak leke.</li>
		<li>UV transilluminator kullanarak DNA görselleştirin. Alkali duyarlılık arttı DNA5düzeltilmemiş ribonucleotides daha yüksek yoğunluğu gösteren daha küçük DNA parçalarının görünümünü neden olur.</li>
	</ol></li>
	<li>Güney transfer<ol>
<li>DNA alkalin jel kılcal eylem10tarafından pozitif yüklü naylon membran için transfer. Nasıl bu transfer ayarlanabilir bir örnek Sambrook ve Russell'ın el ile10içinde sağlanır.</li>
		<li>Alkali aktarım arabellek içinde oda sıcaklığında 15dk için alkali jel emmek: 0.4 M NaOH, 1 M NaCl.</li>
		<li>(Jel boyutuna kesme) naylon membran kısaca su ile ıslak ve daha sonra 5 dakika içinde alkalin aktarım arabellek için emmek.</li>
		<li>Aktarım platformu 3 cam şişeler (100 mL) ters çevirme yemek pişirme bir cam ayarlayın. Bu yemek biraz özel jel boyutundan daha büyük olmalıdır. Bir cam levha onları üst üzerinde ayarlayın.</li>
		<li>3 MM CHR Kromatografi kağıt (jel artı kenarları üzerinde arabellek göle asmak uzun taraf genişliğini boyutuna kesme) 2 büyük parçaları üzerinde cam levha asmak.</li>
		<li>Alkali aktarım arabellek Kromatografi kağıt ve yarım dolgu cam tabak üzerine dökün. 5 mL Cam Pipet kullanarak kabarcıklar dışarı pürüzsüz.</li>
		<li>Üzerine tekrar kabarcıklar yumuşatma, özel jel yerleştirin. Jel parafilm ile tüm kenarlarını çevreleyen. Alkali aktarım arabellek az miktarda jel üzerine dökün.</li>
		<li>Öncesi naylon membran jel üstüne yerleştirin. Baloncuklar dışarı pürüzsüz.</li>
		<li>Kağıt ıslak 2 adet özel jel boyutuna kesme. Onları membran üstüne yerleştirin ve herhangi bir kabarcıklar pürüzsüz.</li>
		<li>Büyük bir yığın kağıt havlu (kesim özel jel biraz daha büyük bir boyuta) aktarım sandviç üstüne yerleştirin. Dikkatle kağıt havlu üzerine bir cam plaka yer. Üst (bir kitle 400 g çalışır kitapla) ağırlıklı bir nesne ekleyin.</li>
		<li>Gecede oda sıcaklığında devam transfer izin.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde transfer yığın ayrı almak ve nötralizasyon arabellek II oda sıcaklığında membran 15dk için emmek: 0,5 M Tris-HCl, pH 7.2, 1 M NaCl.</li>
		<li>Crosslink UV crosslinker kullanarak şarj edilmiş naylon membran için DNA. Membran cross-linker ve autocrosslink ayarını kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Güney soruşturma hazırlık Not: bir protokol tabanlı doğmakta olan lider-ahşap kaplama iplikçikli DNA iplikçiğinin karşı alkali duyarlı siteleri bulmak için burada açıklanan yaklaşım daha önce11yayınlandı. Deneyimiz için sondalama adlı bir iki yönler (OR1 veya OR2) kromozom III (Şekil 3A) ARS306 çoğaltma köken bitişik eklenen URA3 muhabir gen gerçekleştirdi. Alkali duyarlı siteleri Maya genomik DNA'varlığı ribonucleotide birleşme, DNA polimeraz etkinlik12,13,14biyolojik ribonucleotides kullanımına izin veren bir göstergesidir. Bu yaklaşım, bir hedef DNA dizisi çoğaltma, verimli ARS306 kökeni bitişik kullanarak diğer genomik mekanlar ve hedef genlerin de mükellef olmalıdır.<ol>
<li>PCR-yükseltmek 520-baz çifti kesimi aşağıdaki astar çiftini kullanarak URA3 muhabir gen: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) ve URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>10-20 ng bir şablon olarak Maya genomik DNA'ın, her astar (10 μm kalınlığında hisse senedi) 10 x Taq arabellek Ex (Mg2 + artı işareti), 8 μL dNTP karışımı (2.5 mM her), 0,5 μL in Ex Taq DNA polimeraz 10 μL 4 μL kullanarak PCR reaksiyonu gerçekleştirmek (5 U/μL) ve H2o 100 μL için son ses seviyesini</li>
		<li>Aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 95 ° C 5 dakika; 30 döngüleri 95 ° c için 1 dakika, 55 ° C için 1 dakika, 2 dk 72 ° C; 10 dk ve tutun 4 ° C'de 72 ° C</li>
		<li>PCR arıtma seti kullanarak PCR ürünü arındırmak ve 50 mL H2O. kullanarak DNA elute Bu şimdi radiolabeling tepki olarak şablon olarak kullanılabilir.</li>
		<li>Strand özel radiolabeling için aşağıdaki astar kullanın: sonda A. anneals DNA görüntülenmesi için kullanım URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) URA3 OR2 ve URA3 OR1 içinde olduğunda iplikçik DNA kalmış tnascent olduğunda bu da doğmakta olan önde gelen iplikçik DNA karşılık gelir. URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) prob B. anneals doğmakta olan DNA görüntülenmesi için kullanın URA3 OR2 içinde olduğunda OR1 ve doğmakta olan ahşap kaplama iplikçik DNA URA3 olduğunda bu da doğmakta olan önde gelen iplikçik DNA karşılık gelir (Şekil 3).<ol>
<li>Şablon DNA, astar (10 μm kalınlığında hisse senedi), 10 x Taq arabellek (Mg2 + artı) Ex 5 μL, 2.5 mM dNTPs (dCTP), eksi 4 μL 2 μL olarak 10-20 ng güçlendirilmiş URA3 parçası kullanarak radiolabeling reaksiyonu gerçekleştirmek 5 μL (50 μCi) bir -32P-dCTP , 0.5 μL ExTaq DNA polimeraz (5 U/μL) ve H2O. Çalıştır aşağıdaki programı radiolabeling için 50 μL için son ses seviyesini: 94 ° C 5 dakika; 94 ° C 25 döngüleri için 1 dakika, 55 ° C 30 s, 72 ° C için 1 dk; 5 min ve tutun 4 ° C'de 72 ° C</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir G-25 spin sütun unincorporated radyoaktif etiketi kaldırmak için kullanın. Radiolabeled örnek eklemeden önce 1dk 720 x g ve MemberForm'un arabellek adlı için sütun pipetting tarafından santrifüj kapasitesi. Radiolabeled reaksiyon ürünü ve etiketli sonda elute 720 x g de 2 dk santrifüj yük.</li>
		<li>Hibridizasyon hemen önce sonda denatüre 5 min için 95 ° C'de kuluçkaya. Serin kısa bir süre buz.</li>
	</ol></li>
	<li>Güney hibridizasyon<ol>
<li>Islak membran hibridizasyon tüp içine rulo ve taze hazırlanmış hibridizasyon arabellek 25 mL ekleyin: 0,5 M sodyum fosfat tampon, pH 7.2, % 7 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), %1 sığır serum albumin (BSA). 65 ° c 1-2 h döndürme hibridizasyon fırında için kuluçkaya.</li>
		<li>Dikkatle solüsyonu dökün ve hibridizasyon arabellek artı radiolabelled sonda 25 mL ekleyin. 16-18 h döndürme için 65 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Çözüm bir radyoaktif atık konteyner içine dökün. 5 dk her olarak fosfat-SDS yıkama çözüm ı: 40 mM sodyum fosfat tampon, pH 7.2, oda sıcaklığında 5 yıkama gerçekleştirmek %5 SDS, % 0.5 BSA, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>15 dk her fosfat-SDS yıkama çözüm II ile 65 ° C'de 2 yıkama gerçekleştirmek: 40 mM sodyum fosfat tampon, pH 7.2, % 1 SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>Membran Cımbız kullanarak hibridizasyon tüpünden çıkarın ve bir açılan plastik kol koruyucusu yerleştirin. Kapak ve bir görüntüleme plakasına bulaşmasına neden. 4 h 4 d arasında değişen kez farklı pozlama bir dizi deneyin.</li>
		<li>Gerekirse, şerit ve yaklaşık 3 - 4 kez farklı bir sonda kullanarak leke yeniden sonda. Şerit için 2 h 65 ° c 25 ml % 50 formamide, 2 x SSPE çözüm için membran kuluçkaya. Not: 20 x SSPE hisse senedi çözüm: 3 M NaCl, 0.2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7.4.</li>
		<li>Çözüm bir radyoaktif atık konteyner içine dökün. 15 dk her 65 ° C'de 2 yıkama fosfat-SDS yıkama çözüm II içinde gerçekleştirin.</li>
		<li>Bir Gayger sayacı ile membran kontrol ve sinyal kalırsa sıyırma Protokolü tekrarlayın.</li>
		<li>Öncesi hibridizasyon ve hibridizasyon yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ölçme mutasyon oranı ve özgüllük S. cerevisiae suşları
<ol><li>Hücre kültürü hazırlamak<ol>
<li>YPD agar 5 mL 250 mg/mL adenin (adenin takviyesi sadece gerekli ise takıma YPDA suyu içine 100 mg/mL adenin ile desteklenmiş olarak yetiştirilen bir koloni (sağlıklı Maya hücreleri alır 2-3 gün 30 ° c ile formu uygun boyutlu kolonileri) aşılamak kullanılan yük olduğunu bir adenin auxotroph). Doygunluk (36-48 h ciddi büyüme kusur olmadan büyük bir yük için) kültür ulaşıncaya kadar bir shaker kuluçka veya bir rotator 30 ° C üzerinde büyür.</li>
		<li>Spin aşağı hücreleri ~ 2000 x g 5 min için de.</li>
		<li>Süpernatant atın ve hücreleri 5 mL steril su ile yıkayın.</li>
		<li>500 mL steril su hücrelerde resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seyreltme hücre kültür ve kaplama<ol>
<li>Sigara seçim denetimleri için 96-şey plaka hücrelerde 1.600.000 ve plaka her kültür tam (COM) plaka üzerine 100 mL faktör tarafından oranında seyreltin.</li>
		<li>Ura3 mutantlar için seçmek için bir vahşi-tipi (WT) yük için 5-FOA levha üzerine su katılmamış hücrelerinin 100 mL plaka. Mutasyon oranı faiz baskı bir WT yük daha yüksek olması bekleniyor Eğer hücreleri buna göre oranında seyreltin.</li>
		<li>Can1 mutantlar için seçmek için hücreleri 5-fold sulandırmak ve canavanine içeren için bir tabak (CAN) bir WT yük üzerine 100 mL plakası. 0,5 seyreltme faktörüdür.</li>
		<li>30 ° C'de tabak mantar kolonileri formu kadar kuluçkaya. Suşları bir büyüme kusur olmadan için 2-3 gün COM için genellikle yeterli olur ve plakaları ve 3-5 gün 5-FOA plakaları için olabilir. Mutasyon oranları farklı suşları arasında karşılaştırmak için aynı gün büyüme kolonileri saymak için seçmek en iyisidir. Soğuk Oda (~ 4 ° C) sayılacak hazır plakaları saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spontan mutasyon oranı hesaplama<ol>
<li>Her plaka üzerinde görünür kolonileri saymak ve koloni sayıların notlar almak</li>
		<li>Drake'in formülü kullanarak mutasyon oranı hesaplamak: μ = f ÷ ln (μNt). f son kültür hücre sayısı bölü mutantlar sayısına göre hesaplanan mutasyon sıklığıdır. NT son kültür hücre sayısı ve μ mutasyon oranı. Bu denklem Newton-Raphson yöntemi gibi yinelemeli bir yöntem tarafından çözülebilir. Mutasyon oranı15hesaplamak için Lea ve Coulson testi de dahil olmak üzere diğer Tahmincisi yöntemleri de vardır.</li>
		<li>Güven aralığı varsayarak günlük normal dağılım bireysel yalıtır utation oranları hesaplamak. % 95 güven aralığı en sık kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mutasyon spektrum analizi<ol>
<li>Plaka veya bir koloni her 5 FOA üzerinden almak ve yenileme YPDA tabağa.</li>
		<li>Koloni URA3 veya CAN1 gen ve sıralaması aşağıdaki primerler kullanılarak mutasyonlar algılamak için yükseltmek için PCR gerçekleştirmek: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') ve URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') için her iki PCR güçlendirme ve 800 bp URA3 gen sıralama; Can1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') ve CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') amplifikasyon ve CAN1-AR için (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') ve CAN1-BR ( 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') 1800 bp CAN1 muhabir gen sıralama için.</li>
		<li>Koloni PCR gerçekleştirmek için bir koloni içinde 5 μL H2O resuspend ve 1 μL şablon olarak kullanın. Eklemek her birinin astar (5 mikron hisse senedi) 5 x KAPA2G arabelleği (Mg2 + artı) 2 μL 1 μL, 0.5 μL dNTP (2.5 mM), 0,5 μL, KAPA2G hızlı DNA polimeraz, H2o 12 μL</li>
		<li>URA3 gen amplifikasyon için aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 95 ° C 5 dakika; 5 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 30 72 ° C s; 35 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 30 72 ° C s; 2 dk ve tutun 4 ° C'de 72 ° C CAN1 gen amplifikasyon için aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 95 ° C 5 dakika; 5 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 45 72 ° C s; 35 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 45 72 ° C s; 2 dk ve tutun 4 ° C'de 72 ° C</li>
		<li>Mutasyonlar tanımlamak için DNASTAR Seqman Pro veya Sequencher gibi bir program kullanarak bir başvuru sırası sıralama sonuçları hizalayın.</li>
		<li>Mutasyon türü (Şekil 4) veya mutasyon konumu (Şekil 5) göre mutasyonlar veri derlemek. (Gözlenen olayları sıralı mutantlar numarasına göre bölünmüş) bir mutasyon sıklığına göre belirli mutasyon oranları genel mutasyon oranı ile çarpımı hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+sugar:+how+polymerases+select+a+nucleotide+substrate.">Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases.">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).</li><li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+H2-initiated+ribonucleotide+excision+repair.">RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair.</a> Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).</li><li>Li, Y., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+RNA+Degradation+by+Specific+Base+Catalysis+of+Transesterification+Involving+the+2'-Hydroxyl+Group.">Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA.">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).</li><li>Williams, J. S., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+in+DNA:+origins,+repair+and+consequences.">Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences.</a> DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).</li><li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication.">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).</li><li>Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luria-Delbruck+fluctuation+experiments:+design+and+analysis.">Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis.</a> Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).</li><li>Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+practical+guide+to+the+Luria-Delbruck+protocol.">A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol.</a> Mutat Research. 781, 7-13 (2015).</li><li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+roles+of+DNA+polymerases+epsilon+and+delta+at+the+eukaryotic+replication+fork+are+evolutionarily+conserved.">The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved.</a> PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+are+signals+for+mismatch+repair+of+leading-strand+replication+errors.">Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors.</a> Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).</li><li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+1-mediated+removal+of+ribonucleotides+from+nascent+leading-strand+DNA.">Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA.</a> Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).</li><li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation.">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).</li><li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+processing+of+ribonucleotides+in+DNA+by+topoisomerase+1+is+leading-strand+specific.">Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).</li><li>Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+consequences+of+putative+active+site+mutations+in+yeast+DNA+polymerases+alpha,+epsilon,+delta,+and+zeta.">In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta.</a> Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).</li><li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+{alpha}+and+{delta}.">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li><li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon.">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity.">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).</li><li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development.">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition.">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, DNA ikileşmesi ve düzeltilmemiş ribonucleotides mutajenik etkileri sırasında dahil ribonucleotides yarı kantitatif analiz için sık sık kullanılır deneyler iki kümesi protokollerde açıklayın. Bu yaklaşımlar modeli ökaryot S. cerevisiaeiçeren rağmen bu teknikleri diğer mikroplar ve daha yüksek Ökaryotlar kolayca adapte edilebilir.
DNA'daki özel alkalin Elektroforez Southern Blot ile birleştiğinde kullanarak düzeltilmemiş ribonucleotides için yoklama ribonucleotides mevcut sayısı ve içine onlar dahil edilmiş strand ilgili önemli bilgiler sağlar. Ancak, bu alkali-hassasiyet de abasic bir site gibi diğer DNA lezyonlar neden olabilir unutmamak gerekir. Ribonucleotides DNA'sı tespit başka bir araç tarafından arıtılmış RNase H2 enzim, tedaviyle memeli hücreleri21' yaptığı gibi 's. Her ne kadar bizim yaklaşım iplikçikleri bizim mutational analiz deneylerde kullanılan URA3 muhabir gen, ahşap kaplama karşı doğmakta olan lider alkali duyarlı siteler için sondalama içerir, sırayla diğer yerlerde de TAV sondalar tasarım mümkündür ribonucleotide yoğunluğu genomik diğer sitelerdeki ilgili önemli bilgiler elde etmek için. Prosedürün Southern blot kısmı diğer genel DNA problama deneyler için de başvuru olarak kullanılabilir.
Ölçüm kullanarak bir dalgalanma test mutasyon oranları yaygın mikroorganizmaların çeşitli mutajenik etkinliklere analizi için kullanılan ve böylece DNA'ribonucleotides mutajenik sonuçlarını analiz için sınırlı değildir. Bu deneme için bağımsız kültürler artırıldığında ölçüm doğruluğunu büyük ölçüde geliştirebilirsiniz. Bağımsız koloniler YPDA bir ortama ilgi büyük bir yük çizgiler veya diploit Maya leke dörtlü diseksiyon tarafından elde edilen bağımsız spor kolonileri analizini elde edilebilir. İdeal olarak, birden çok bağımsız haploit maya suşları kullanımı (Örn., dörtlü diseksiyon üzerinden) zorlanma zorlanma varyasyon etkisini en aza indirmek için teşvik edilmektedir. Spontan mutasyon oranı yüksek olduğunda ya da zorlanma bir büyüme kusur varsa bu özellikle önemlidir. Spontan ölçmek için kullanılan ek bir yöntem bir mutasyon birikimi deneme22mutasyon oranı var. Bu analizde, mutasyon sıklığı ve mutasyon oranı için hesaplamak için kullanılan hücreler için geniş büyüme sonra belirlenir. Kaplin derin sıralama teknolojisi ile bir mutasyon birikimi denemenin mutasyon oranı ve özgüllük genom analiz etmek için güçlü bir araç olarak kanıtlanmıştır.

Ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında ribonucleotides tüm üç büyük DNA replicases, DNA polimerazlar (siyaset bilimi) α, ε ve δ1,2tarafından genom dahil edilmiştir. RNase H2-bağımlı ribonucleotide eksizyon tamir (RER3) Bu katıştırılmış ribonucleotides çoğunluğu kaldırır.
2' hidroksil grubu şeker yan 2' - 3' döngüsel fosfat ve diğer 5'-OH4ile bir ucu serbest bitişik fosfodiester bağı saldırabilir gibi DNA'ribonucleotide hidroliz için açıktır. Alkali koşullar büyük ölçüde bu reaksiyon hızlandırabilir. Böylece, temel bir çözümde kuluçka sırasında katıştırılmış ribonucleotides hidroliz özel alkalin Elektroforez5tarafından görüntülenmiştir genomik DNA'ın parçalanma neden olur. Bu DNA'yı bir membran transfer ve doğmakta olan lider - veya ahşap kaplama-strand içine DNA dahil ribonucleotides neden alkali duyarlı sitelerin kimlik izin strand özgü probları Southern blot Analizi tarafından probed, anılan sıraya göre.
Ne zaman topoizomeraz ı (Top1) katıştırılmış ribonucleotide6,7' de DNA nicks RNase H2 etkinlik eksik Maya hücrelerinde ribonucleotides kaldırılması başlatılabilir. Top1 3' tarafında ribonucleotide cleaves, ancak, bu 5'-OH ve religation için ateşe dayanıklı 2' - 3' döngüsel fosfat DNA uçları oluşturur. Hata onarım veya bu 'kirli biter' anormal işlenmesi için genomik istikrarsızlık neden olabilir. Ayrıca, tekrar bir DNA dizisi içinde belgili tanımlık kesme ortaya çıkarsa, onarma işleminin silme mutasyonlar için yol açabilir. Bu özellikle sorunlu tandem tekrarlar için olduğunu, nerede silme işlemlerini kısa (, beş ve iki baz çifti arasındaki) RNase H2-eksik hücrelerinde yaygın olarak gözlenmektedir. Top1 bağımlı zararlı etkileri Maya RNase etkinlik şiddetlenir DNA polimeraz ε mutant (pol2-M644G) ribonucleotide birleşme sırasında doğmakta olan önde gelen strand sentezi için karışık içinde H2 yokluğunda.
DNA'ribonucleotides işlenmesi için spontan mutasyonlar neden olur ve bu mutagenesis uygun reporter genler kullanarak ve beraberindeki fenotipik değişiklik için seçildiğinde tespit edilebilir. Bir dalgalanma test veya Luria ve Delbrück deney seçilebilir reporter genler8,9kullanarak spontan mutasyon oranları ölçmek için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Maya, URA3 ve CAN1 genler gen fonksiyon kaybına neden tüm mutasyon tipleri tespiti için sağlar bir ileri mutasyon tahlil gazetecilere olarak kullanılabilir. Spontan mutasyon oranı hedef muhabir gen mutasyonlar olmadan tek kolonilerden başladı birden çok paralel kültürü için gözlenen ortancası olarak tahmin edilmektedir. Bir Maya RNase H2-eksik soy rnh201Δ büyük ölçüde 2-5 bp silme tandem yükseltilmiş bir insidansı neden olur orta derecede yüksek bir genel olarak spontan mutasyon oranı gibi dizileri yineleyin. Böylece, tamamen ribonucleotides genom içinde mutajenik etkileri karakterize için belirli mutasyon oranları tespit gerekir. Bu durumda, URA3 veya CAN1 muhabir genleri güçlendirilmiş ve türleri ve mutasyonlar yerlerini belirlemek için sıralı ve belirli mutasyon oranları hesaplanabilir. Birden çok bağımsız URA3 veya CAN1 mutantlar tanımlanan mutasyonlar derleme daha sonra bir mutasyon spektrum oluşturmak için kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 &#8211; 35 ml per plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAN plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 &#176;C and cool down to 56 &#176;C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FOA plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 &#176;C and cool down to 60 &#176;C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Canavanine sulfate</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FOA</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>F5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass culture tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture rotator in 30 &#176;C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shaker incubator can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm glass beads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312A</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq DNA Polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>MPY80200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Newer model available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Dot Scientific Inc.</td>
			<td>DSF10400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromocresol green</td>
			<td>Eastman</td>
			<td>6356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>International Technologies Inc.</td>
			<td>72120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Nylon membrane Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 MM CHR Chromotography paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7560-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-25 spin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-5325-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NaH2PO4 (S9638); 
			Na2HPO4 (S9390)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying ribonucleotide incorporation: strand-specific detection of ribonucleotides in the yeast genome and measuring ribonucleotide-induced mutagenesis

Genomik istikrarsızlık kaynağı olmaya ribonucleotides nükleer DNA'varlığı gösterilmiştir. Ribonucleotide birleşme ölçüde alkali hidroliz tarafından tespit edilebilir ve RNA hidroliz alkali koşullarda son derece duyarlı olduğu gibi Elektroforez jel. Bu, Southern blot analizi ile birlikte yerini belirlemek ve ribonucleotides dahil var haline hangi strand için kullanılabilir. Ancak, bu yordam yalnızca yarı nicel ve strand özgü Southern blot sondalama hassasiyeti artırır, ancak ribonucleotide içeriğinde, küçük değişiklikleri algılamak için duyarlı olmayabilir. En çarpıcı biyolojik sonuçlarından biri DNA'ribonucleotides ölçüsü olarak, kendiliğinden mutagenesis bir ileri mutasyon tahlil kullanılarak analiz edilebilir. Uygun reporter genler kullanarak, işlev kaybına neden olur nadir mutasyonlar seçili ve genel olabilir ve muhabir gen DNA sıralama ile dalgalanma deney verileri birleştirerek belirli mutasyon oranları ölçülebilir. Dalgalanma tahlil çok çeşitli mutajenik işlemlerinde belirli genetik arka plan veya büyüme koşulları incelemek için geçerlidir.

Tedavi ile alkali jel elektroforez tarafından takip alkali genomik DNA'ın DNA fragmantasyonu stabil anonim ribonucleotides çokluğu nedeniyle yarı kantitatif algılanması için izin verir. Şekil 2 genomik DNA veya KOH5olmadan tedavi Maya jel görüntüleri gösterir. Pol2, Polε, katalitik alt M644L türevi M644G mutant WT polimeraz daha daha fazla ribonucleotides içerir iken ribonucleotides dahil yeteneği azalttı. İletişim kuralındaki detaylı olarak alkali jel daha fazla strand özgü Southern blot analizi ile probed. Problu genomik siteye bitişik kökeni göre konumunu bilgi ile biz seçmeli olarak doğmakta olan dahil ribonucleotides yoklama başında veya sonunda iplikçikleri gerisinde kalmış. Şekil 3 bir erken ateş çoğaltma kökeni, ARS30616yakın iki zıt yönelimleri takılı URA3 muhabir gen sondalama Southern blot sonuçlarını gösterir. Strand özgü probları önde gelen kullanarak, biz DNA parçalanma desen alkali-bölünme doğmakta olan önde gelen iplikçik DNA WT zorlanma ve suşları için promiscuous vardır polimerazlar α, δ ve ε türevleri ifade ribonucleotides, neden gözlemlemek ribonucleotide birleşme.
Bir dalgalanma deney kullanarak, muhabir genleri içeren maya suşları mutasyon oranları ölçebilirsiniz. Şekil 4 mutasyon oranları URA3 ve CAN1 loci suşlarının WT polimeraz veya pol2-M644G mutant veya fonksiyonel RNase H2 olmadan ifade gösterir. RNase H2 eksikliği ılımlı bir artış genel mutasyon oranları her iki arka planlar içinde neden olur. Ancak, içinde suşları RNase H2 eksik mutasyon özgüllüğü daha yakından incelendiğinde ortaya koymaktadır (Şekil 5), mutasyon oranı özellikle de tandem tekrar dizileri kısa silme işlemleri için güçlü bir artış yoktur. 5A rakam karşılaştırır WT ve rnh201Δ suşları mutasyon özgüllük ve Şekil 5B görüntüler daha da yüksek ribonucleotide birleşme doğmakta olan önde gelen DNA zinciri içine mutational etkisi Pol tarafından ε.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig1.jpg"> Şekil 1: protokol strand özgü algılama içine Maya genomik DNA ribonucleotide birleşme nedeniyle alkali duyarlı sitelerin katılan adımlar. Bu yordam, Maya genomik DNA izolasyon ile başlayan ve son Southern blot analizi ile devam katılan çeşitli büyük adımlar genel bakış. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig2.jpg"> Şekil 2: sonuçları temsilcisi bir görüntüsünü elde edilen özel alkalin jel elektroforez ile. Bu rakam Nick McElhinny, S. A. vd adapte 5. farklı genotip suşları Maya genomik DNA KCl (nötr) veya KOH (alkali) ile tedavi ve bir nötr veya alkali özel jel ayrılmış. "Ne" ve "M644G" Pol durumunu gösterir ε. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig3.jpg"> Şekil 3: Strand özgü bir özel alkalin jöleyi Southern blot tarafından sondalama. Bu rakam üzerinden adapte edilmiş Williams, J. S. vd. 13. (A) radiolabeled sondalar tavlamak için ARS306 yakın iki zıt yönler (OR1 ve OR2) eklenen URA3 muhabir gen içinde doğmakta olan önde gelen DNA dizisi. (B) doğmakta olan önde gelen strand özgü problar kullanarak Southern Blot temsilcisi sonuçları. Görüntülenen problama bir gerilme WT DNA polimeraz, ya da pol1-L868M, pol2-M644G veya pol3-L612M ile doğmakta olan önde gelen iplikçik için varyant suşları ile ya da ezelî RNase H2 sonuçlarıdır. POL1, POL2 ve POL3 genler Pols α, ε ve δ, katalitik alt birimleri sırasıyla kodlamak. Değişik ribonucleotide birleşme5,12,17için daha promiscuous vardır. (C) miktar (b) her şeritte toplam kısmını tarafından radyoaktif sinyal. Değerleri toplamının bir yüzdesi ifade edilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig4.jpg"> Şekil 4: spontan mutasyon oranları maya suşları. Bu rakam Nick McElhinny, S. A. vd adapte 5. URA3 ile CAN1 muhabir gen ileri mutasyon assay olarak belirtilen suşları mutasyon oranları ölçmek için kullanıldı. URA3 muhabir olduğunu "yönde 2" (OR2, Şekil 3A). Her ölçüm için % 95 güven aralığı (CI) bulunur. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig5.jpg"> Şekil 5: URA3-OR2 muhabir gen mutasyon spectra. Bu rakam önceki yayınları5,18,19,20uyarlanmıştır. Her bağımsız 5 FOA dayanıklı koloni ileri mutasyon assay olarak seçilen gözlenen konumu ve mutasyon türü 804 içinde tasvir bp URA3 kodlama dizisi. Harfler gösterir Bankası oyuncu değişikliği, açık üçgen gösterir tek temel silme, kapalı üçgenler belirtir tek temel eklemeleri ve düz çizgiler kısa silme işlemleri gösterir. (A) mutasyon spectra WT ve rnh201Δ suşları içinde. Kırmızı üzerinde sıra sıra aşağıda mavi etiket o bir rnh201Δ zorlanma gözlenen iken WT içinde gözlenen mutasyon etiketleridir. (B) mutasyon spectra pol2-M644G ve pol2-M644G rnh201Δ suşları içinde. Kırmızı sıra yukarıda pol2-M644G mavi pol2-M644G rnh201Δ suşları için sıra aşağıda sırasında gözlenen mutasyon etiketleridir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis at Jo

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

studying-ribonucleotide-incorporation-strand-specific-detection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K Görüntüleme.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS. Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.

Video: Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Biyoloji

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Yetişkin Zebra balığı İç Kulak Duyu Epiteli Brüt ve Güzel Diseksiyon ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Tek Oosit Bisülfit Mutagenez

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...