我々 は自分の仕事のすべての現在および元クンケル研究室メンバーに感謝と議論のプロトコルに関連して今回発表されたデータを再利用します。この作品は、国立衛生研究所 (NIH)、国立環境衛生研究所 (NIEHS) の学内研究部門から T.A.K. にプロジェクト Z01 ES065070 によって支えられました。

1. アルカリ加水分解と特異的南しみ (図 1)
<ol><li>細胞増殖とゲノム DNA の隔離<ol>
<li>酵母 DNA 精製キットの製造元の指示に従ってを使用して酵母ゲノム DNA を分離します。(0.5 の光学密度) と 1 の間の成長の指数の段階にあるカルチャを使用します。TE バッファー (10 mM トリス-HCl, pH 7.5、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)) x 1 の 35 mL で最終的な DNA ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>DNA に 5 mg/mL RNase A の 1 つの mL を追加し、37 ° C で 30 分間インキュベート</li>
		<li>3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.2) の 0.1 のボリュームを使用して DNA を沈殿させると氷の上に 20 分間 100% エタノールの 2.5 倍の量。</li>
		<li>16,000 x g で 4 ° C で 20 分間遠心ピペットを使用して上清を除去します。</li>
		<li>70% のエタノールの 500 mL で 2 回ペレットを洗浄します。ピペットを使用して上清を除去します。</li>
		<li>ベンチにペレットを乾燥し、TE バッファー x 1 の 35 ml で再懸濁します。</li>
		<li>DsDNA BR アッセイ キットと蛍光 (資材表) を用いた DNA 量的に表わします。</li>
		<li>3 M 酢酸ナトリウム、pH 5.2 と 2.5 量 100% の 0.1 のボリュームを使用する各サンプルから DNA の 5 mg の沈殿物の合計量 200 mL EtOH (中性ゲル コントロールが必要な場合に追加、必要に応じて 5 mg の DNA が必要な場合は、H2O を追加)。20 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
		<li>16,000 x g で 4 ° C で 20 分間遠心ピペットを使用して上清を除去します。</li>
		<li>ベンチにペレットを乾燥させます。H2o. 14 mL で DNA を再懸濁します</li>
	</ol></li>
	<li>アルカリ加水分解しゲル電気泳動<ol>
<li>1 M 島の 6 mL を追加し、55 ° C 2 時間インキュベートします。</li>
		<li>5 分間氷の上のサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>アルカリの DNA 読み込みバッファー x 6 の 4 つの mL を追加: 300 ミリメートル島、6 ミリメートルの EDTA、pH 8.0、18 %polysucrose (資材表)、0.15% ブロム クレゾール グリーンと 0.25% キシレンシアノール FF。</li>
		<li>1% のアガロース、50 mM NaOH、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 で構成されるアルカリ ゲルをキャストします。1 レーンあたり読み込まれる DNA のサンプルの 24 mL は、櫛を使用します。</li>
		<li>X アルカリ電気泳動バッファー 1 で室温でゲルを実行: 50 mM NaOH、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0。DNA サイズ マーカーが含まれます。</li>
		<li>チューブを簡単にスピンし、アルカリ agarose のゲルに全体 24 mL サンプルを読み込みます。30 V、10 V で 18-20 h に続いて、30 分 electrophorese します。</li>
		<li>穏やかな動揺の中和バッファー i: 1 M トリス-HCl、1.5 M の NaCl に室温で各 45 分の 2 の孵化のためのゲルを中和します。</li>
		<li>SYBR ゴールド汚れ穏やかな揺れで部屋の温度で 2 時間の 1/10,000 の希釈を含む水 200 mL で中和されたゲルを浸すことによって、DNA を染色します。</li>
		<li>UV transilluminator を用いた DNA を可視化します。アルカリ感度の向上は、DNA5で未修理リボヌクレオチドのより高い密度を示す小さい DNA のフラグメントの出現を引き起こします。</li>
	</ol></li>
	<li>南転送<ol>
<li>アルカリのゲルから DNA を転送すると、毛管作用10正荷電のナイロン膜。Sambrook とラッセルのマニュアル10この転送を設定する方法の例があります。</li>
		<li>アルカリの転送バッファーに室温で 15 分間アルカリ ゲルを浸す: 0.4 M NaOH、1 M 塩化ナトリウム。</li>
		<li>(ゲルのサイズへカット) ナイロン膜を水で簡単に濡れているし、アルカリ転送バッファーで 5 分間浸します。</li>
		<li>ガラスのグラタン皿に 3 のガラス ビーカー (100 mL) を反転による転送プラットフォームの設定します。この料理は agarose のゲルのサイズより少し大きめにする必要があります。それらの上にガラス板を設定します。</li>
		<li>ガラス板を 3 MM CHR 濾紙 (ゲルとバッファー貯蔵所にエッジの上に羽織ることができます長い方の辺の幅のサイズにカット) の 2 の大きい部分をかけなさい。</li>
		<li>アルカリの転送バッファーをクロマトグラフィー紙と半塗りガラス皿に注ぐ。5 mL ガラス ピペットを使用して泡を滑らか。</li>
		<li>上、再度泡を滑らかに agarose のゲルを配置します。パラフィルムでゲルのすべての端を囲みます。アルカリの転送バッファーのゲルの少量を注ぐ。</li>
		<li>漬けナイロン膜のゲルの上に配置します。泡を滑らか。</li>
		<li>ウェット 2 紙の部分は agarose のゲルのサイズにカットします。膜の上にそれらを配置し、任意の気泡を滑らかに。</li>
		<li>転送サンドイッチの上にペーパー タオル (agarose のゲルよりも少し大きいサイズにするカット) の大規模なスタックを配置します。ペーパー タオルの上にガラス板を慎重に配置します。トップ (質量 400 g うまくの本) に重み付きオブジェクトを追加します。</li>
		<li>室温で一晩進む転送ができます。</li>
		<li>慎重に転送スタックを離れて取り、中和バッファー II に室温で 15 分間膜を浸す: 0.5 M トリス-HCl、pH 7.2、1 M 塩化ナトリウム。</li>
		<li>クロスリンク UV 架橋剤を用いた荷電のナイロン膜への DNA。架橋剤の膜を置き、autocrosslink の設定を使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>南部のプローブの準備 注: ラギング鎖の DNA の繊維の対初期リードでアルカリに敏感なサイトのプロトコルに基づいていますを検出するここで説明している方法は11で公開以前。実験調査は III (図 3 a) 染色体のARS306の複製の起源に隣接する 2 つの方向 (または 1 つまたは OR2) のいずれかで挿入されているURA3のレポーターの遺伝子で実行されます。酵母ゲノム DNA にアルカリに敏感なサイトの存在は、リボヌクレオチド定款、DNA ポリメラーゼ活性12,13,14のバイオ マーカーとしてリボヌクレオチドの使用を許可するインジケーターです。ターゲットのレプリケーションでは、効率的なARS306の起源に隣接する DNA シーケンスを使用して、このアプローチは、他のゲノムの場所と同様に標的遺伝子を受けやすいはずです。<ol>
<li>次のプライマー対を用いたURA3レポーターの遺伝子の PCR 増幅 520 基ペア セグメント: URA3-F1 (5´ GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) と URA3 R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC)。</li>
		<li>テンプレートとして酵母ゲノム DNA の 10-20 ng、4 μ L 各のプライマー (10 μ M 在庫)、Taq バッファー Ex (Mg2 + plus)、dNTP の混合物 (2.5 mM) の 8 μ L、0.5 μ L の Ex Taq DNA ポリメラーゼの x 10 の 10 μ L の PCR 反応を実行 (5 U/μ L)、H2o. の 100 μ L に最終的な音量を調整して</li>
		<li>次の PCR プログラムを実行: 95 ° C、5 分。1 分、1 分、2 分; 72 ° C 55 ° C の 95 ° C の 30 サイクル4 ° C で 10 分押しのための 72 ° C</li>
		<li>PCR 精製キットを使用して PCR の製品の浄化し、H2o. の 50 mL を使用して DNA を溶出これは今 radiolabeling 反応のテンプレートとして使えます。</li>
		<li>アンチセンス カイネティックスの次のプライマーを使用: 使用 URA3 A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) プローブ A. 焼鈍 DNA を可視化します。OR2 と鎖 DNA の遅れまたは 1 つのURA3は、tnascent、 URA3のとき、これは初期の主要な鎖 DNA に対応します。URA3 B (5´ CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) を使用して、プローブ B. 焼鈍新生 DNA を可視化します。URA3は、または 1 つの初期のラギング鎖の DNA URA3 OR2 の場合初期の主要な鎖 DNA に相当 (図 3)。<ol>
<li>テンプレート DNA、プライマー (10 μ M 在庫)、Taq バッファー (Mg2 + plus) Ex 10 x の 5 μ L、4 μ L (dCTP) マイナス 2.5 mM dNTPs の 2 μ L と 10-20 ng 増幅URA3フラグメントを用いた radiolabeling 反応を実行 -32P dCTP の 5 μ L (50 μCi)、0.5 μ L の ExTaq DNA ポリメラーゼ (5 U/μ L) H2O を実行次のカイネティックスのプログラムの 50 μ L に最終的な音量を調整して: 94 ° C、5 分。25 サイクル 94 ° c 1 分、55 ° C、30 秒、1 分; 72 ° C4 ° C で 5 分押しのための 72 ° C</li>
		</ol>
</li>
		<li>G-25 スピン列を使用して、非法人放射性ラベルを削除します。標識のサンプルを追加するには、前にピペッティングで 720 g、削除バッファー x で 1 分の列を遠心します。標識反応生成物と分類されたプローブを溶出する 720 x g で 2 分間遠心をロードします。</li>
		<li>95 ° c 直前のハイブリダイゼーション プローブを変性する 5 分間インキュベートします。簡単にクールな氷の上。</li>
	</ol></li>
	<li>南交配<ol>
<li>交配管に接液膜と 25 mL の作りたての交配バッファーを追加: 0.5 M リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.2, 7% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、1% ウシ血清アルブミン (BSA)。ハイブリダイゼーション オーブンで回転で 1-2 時間の 65 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>慎重に、溶液を捨て、交配バッファー プラス放射性標識プローブの 25 mL を加えます。65 ° C 回転で 16-18 h で孵化させなさい。</li>
		<li>放射性廃棄物コンテナーに、溶液を注ぐ。隣酸塩 SDS 洗浄ソリューション i: 40 mM リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.2、室温で 5 分の 5 の洗浄を行う 5 %sds、0.5 %bsa、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0。</li>
		<li>隣酸塩 SDS 洗浄ソリューション II と 65 ° C で 15 分の 2 洗浄を実行: 40 mM リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.2, 1 %sds、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0。</li>
		<li>ピンセットを用いたハイブリダイゼーション チューブから膜を取り出し、開いているプラスチック製のスリーブ プロテクターに置きます。カバーし、イメージング プレートを公開します。異なる露出時間 4 h から 4 d に至るまでの数をみてください。</li>
		<li>必要に応じて、除去し、再約 3-4 倍異なるプローブを用いてしみをプローブします。ストリップ、65 ° c 50% ホルムアミド、2 x SSPE ソリューションの 25 mL で 2 h の膜をインキュベートします。 注: 20 x SSPE 原液: 3 M の NaCl、0.2 M NaH2PO4、0.02 M の EDTA、pH 7.4。</li>
		<li>放射性廃棄物コンテナーに、溶液を注ぐ。隣酸塩 SDS 洗浄ソリューション II の 65 ° C で 15 分の 2 洗浄を実行します。</li>
		<li>ガイガー カウンターを持つ膜をチェックし、信号が残っている場合、ストリップのプロトコルを繰り返します。</li>
		<li>前述の通り前の雑種との交配を実行します。</li>
	</ol></li>
</ol>2 突然変異率と酵母菌の特異性の測定
<ol><li>細胞培養を準備します。<ol>
<li>(アデニンの補充のみ必要な場合は 250 mg/mL アデニンと補われる産スープの 5 mL に 100 mg/mL アデニンと補われた YPD 寒天上に成長した単一コロニー (健全な酵母細胞がサイズ適切なフォームに 30 ° C で 2-3 日植民地) を接種します。使用ずみはアデニン auxotroph) です。成長するシェーカー インキュベーターまたは 30 ° C で回転子の文化に達する飽和 (重度の成長障害なしひずみの 36-48 h) まで。</li>
		<li>〜 2000 x g で 5 分で細胞をスピンします。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、5 mL の滅菌水で洗浄を行う。</li>
		<li>500 mL の滅菌水に細胞を再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞培養とめっきの希釈<ol>
<li>非選択のコントロールの 1,600,000 のプレート 100 mL 完了 (COM) プレート上に各文化の要因によって 96 ウェル プレートで細胞を希釈します。</li>
		<li>Ura3変異体の選択、100 mL 原液細胞野生型 (WT) ひずみの 5 フォア プレートのプレートします。興味のひずみの突然変異率は WT ひずみよりも高くなると予想される場合、セルをそれに応じて希釈します。</li>
		<li>Can1変異体の選択、セルを 5 倍希釈、WT ひずみのカナバニン含むプレート (缶) 100 mL をプレートします。希釈率は 0.5 です。</li>
		<li>イースト菌のコロニーが形成されるまでは、30 ° C でプレートを孵化させなさい。成長欠陥なし系統、2-3 日は COM は通常十分なプレートと 5 フォア プレートの 3-5 日をすることができます。異なる系統間変異率を比較すると、同じ日にコロニーをカウントする成長を選択することをお勧めします。冷蔵室 (~ 4 ° C) でカウントする準備ができてのプレートを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>自然突然変異率の計算<ol>
<li>各プレート上の目に見えるコロニーをカウントし、コロニー数のメモを取る</li>
		<li>ドレークの式を使用して突然変異率を計算: μ = f ÷ ln (μNt)。fは変異頻度の変異体の最終的な培養細胞の数で割った値の数によって計算されます。Nt は最終的な培養細胞の数であり、 μは突然変異率。この方程式は、ニュートン ・ ラプソン法などの反復的な方法で解決できます。突然変異率15を計算するリー ・ コールソンのテストを含むその他の推定方法あります。</li>
		<li>各分離株の utation 率の信頼区間と仮定すると対数正規分布を計算します。95% 信頼区間が最もよく使用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>突然変異スペクトルの解析<ol>
<li>各 5 FOA から単一コロニーを拾うまたは板することができますと産板リフレッシュします。</li>
		<li>コロニー次のプライマーを用いて突然変異を検出するためにURA3またはCAN1の遺伝子そしてシーケンスを増幅する PCR を実行: URA3 F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') URA3 r (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') 両方の PCR の拡大のため、800 bp URA3遺伝子の塩基配列決定CAN1 F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') CAN1 r (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') の増幅特性と CAN1 AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3')、CAN1 9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3')、CAN1 10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') と CAN1 BR (5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') 1800 bp CAN1レポーターの遺伝子の順序のため。</li>
		<li>コロニー PCR を行うには、5 μ L H2O ので単一コロニーを再懸濁し、テンプレートとして 1 μ L を使用します。プライマー (5 μ M 株式) 5 x KAPA2G バッファー (Mg2 + plus) の 2 μ L のそれぞれの 1 μ L、dNTP (2.5 mM) の 0.5 μ L、0.5 μ L の KAPA2G 高速 DNA ポリメラーゼ、H2o. の 12 μ L を追加します。</li>
		<li>URA3遺伝子の増幅、次の PCR プログラムを実行: 95 ° C、5 分。5 サイクル 95 ° C の 10 s、61 ° C、15 s、30 のための 72 ° C s;95 ° C の 10 のためのサイクル 35 秒、61 ° C、15 s 72 ° C、30 s;4 ° C で 2 分押しのための 72 ° CCAN1遺伝子の増幅、次の PCR プログラムを実行: 95 ° C、5 分。5 サイクル 95 ° C の 10 秒、61 ° C、15 s、45 のための 72 ° C s;95 ° C の 10 のためのサイクル 35 秒、61 ° C、15 s、45 のための 72 ° C s;4 ° C で 2 分押しのための 72 ° C</li>
		<li>突然変異を識別するために DNASTAR Seqman プロや Sequencher などのプログラムを使用して参照シーケンスにシーケンス結果を合わせます。</li>
		<li>突然変異型 (図 4) または突然変異の場所 (図 5) での突然変異のデータをコンパイルします。(観測されたイベントの数は突然変異体シーケンスの数で割った値) 突然変異の頻度の特定の突然変異率を乗じた全体的な突然変異率を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+sugar:+how+polymerases+select+a+nucleotide+substrate.">Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases.">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).</li><li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+H2-initiated+ribonucleotide+excision+repair.">RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair.</a> Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).</li><li>Li, Y., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+RNA+Degradation+by+Specific+Base+Catalysis+of+Transesterification+Involving+the+2'-Hydroxyl+Group.">Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA.">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).</li><li>Williams, J. S., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+in+DNA:+origins,+repair+and+consequences.">Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences.</a> DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).</li><li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. 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M., Rogers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luria-Delbruck+fluctuation+experiments:+design+and+analysis.">Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis.</a> Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).</li><li>Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+practical+guide+to+the+Luria-Delbruck+protocol.">A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol.</a> Mutat Research. 781, 7-13 (2015).</li><li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+roles+of+DNA+polymerases+epsilon+and+delta+at+the+eukaryotic+replication+fork+are+evolutionarily+conserved.">The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved.</a> PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+are+signals+for+mismatch+repair+of+leading-strand+replication+errors.">Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors.</a> Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).</li><li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+1-mediated+removal+of+ribonucleotides+from+nascent+leading-strand+DNA.">Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA.</a> Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).</li><li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation.">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).</li><li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+processing+of+ribonucleotides+in+DNA+by+topoisomerase+1+is+leading-strand+specific.">Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).</li><li>Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+consequences+of+putative+active+site+mutations+in+yeast+DNA+polymerases+alpha,+epsilon,+delta,+and+zeta.">In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta.</a> Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).</li><li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+{alpha}+and+{delta}.">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li><li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon.">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity.">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).</li><li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development.">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition.">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li></ol>

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ここでは、2 組の DNA 複製と未修理リボヌクレオチドの変異原性の効果の中に組み込まれてリボヌクレオチドを半定量的に解析は、頻繁に実験のためのプロトコルについて述べる。ただし、これらのアプローチは、モデルが出芽酵母を真核生物を含む、他の微生物とさらに高い真核生物にこれらの技術を簡単に適合できます。
南しみが付くことと相まってアルカリ アガロース電気泳動による DNA の未修理リボヌクレオチドのプロービング リボヌクレオチドの現在の数と彼らに組み込まれたストランドに関する重要な情報を提供します。しかし、そのアルカリ感度は基本サイトなど、他の DNA の病変によっても発生に注意する重要です。リボヌクレオチドを DNA 検出の別の手段は、哺乳類細胞21で行われている精製の RNase H2 酵素治療で。我々 のアプローチはありますがラギング繊維URA3レポーターの遺伝子変異解析実験に用いたのと初期のリードでアルカリに敏感なサイトの調査、それは注文の他の場所でアニール プローブを設計することが可能他のゲノムのサイトでリボヌクレオチド密度に関する重要な情報を得よう。他汎用 DNA プローブ実験プロシージャの南しみの部分を参照として使用もできます。
変動試験を使用して突然変異率の測定微生物の様々 な変異イベントの分析に広く使用されています、従って DNA のリボヌクレオチドの変異原性の結果の分析に限定されていません。測定の精度を高めるためにはこの実験の独立した文化の数を増やす大幅。産媒体に関心のひずみをストリー キング、二倍体酵母の染色のテトラッド解剖によって得られた独立した胞子のコロニーの分析で、独立した植民地を取得できます。理想的には、複数の独立した半数体酵母の使用 (e.g。、テトラッド解剖から) ひずみに変動の影響を最小限に抑えることをお勧めします。自然突然変異率が高いとき、またはひずみ成長欠陥があるとき、これは特に重要です。自発性を測定するために用いることができる追加のメソッド突然変異率が突然変異の蓄積実験22 です。この分析における突然変異頻度は広範な成長後セルの決定され、突然変異率の計算に使用することができます。ディープ シーケンス技術による突然変異蓄積実験のカップリングは、遺伝子突然変異率と特異性を解析する強力なツールであること実証されています。

真核生物の核 DNA の複製時に、リボヌクレオチドはすべての 3 つの主要な DNA replicases、DNA ポリメラーゼ (政治家) α、ε、δ1、2ゲノムに組み込まれます。RNase H2 依存リボヌクレオチド切除修理 (RER3) は、これらの組み込みのリボヌクレオチドの大半を削除します。
糖の水酸基 2' 2' 3' 環状リン酸や 5'-オハイオ州4と他の 1 つの端を解放、隣接のリン酸ジエステル結合を攻撃できる DNA のリボヌクレオチドは、加水分解を受けやすい。アルカリ条件大幅にこの反応を加速することができます。したがって、基本的なソリューションで潜伏中に埋め込まれたリボヌクレオチドの加水分解アルカリ アガロース電気泳動5で目視できるゲノム DNA の断片化が発生します。この DNA を膜に転送およびアルカリに敏感なサイトに、新生リード- またはラギング鎖の DNA を組み込むリボヌクレオチドによって引き起こされるを識別できるように特異的プローブを用いたサザンブロット解析によって検出できます。それぞれ。
酵母細胞 H2 RNase 活性、トポイソメラーゼ (Top1) 私は埋め込みリボヌクレオチド6,7で DNA をニックスするときリボヌクレオチドの除去を開始できます。ただし、Top1 は、リボヌクレオチドの 3' 側に切断、これは 5'-オハイオ州と桿菌に難治性 2' 3' 環状リン酸の DNA 終了を生成します。修理、またはこれらの '汚れた部分' の異常処理に失敗はゲノム不安定性につながることができます。さらに、切開繰り返し DNA シーケンス内で発生すると、修復処理は欠失変異体につながります。タンデムリピートのため、これは特に問題となる、削除に短い (の 2 つおよび 5 つの塩基対の間) が一般的に RNase H2 欠損細胞で観察されます。酵母リボヌクレオチド体用新生リーディング鎖合成中に無差別 DNA ポリメラーゼ ε 変異 (pol2 M644G) の活動によって悪化させる RNase H2 の不在で Top1 依存への有害な影響。
自発の突然変異につながる DNA のリボヌクレオチドの処理と適切なレポーター遺伝子を使用し、付属の形質転換の選択でこの変異を検出できます。変動試験やルリアと Delbrück の実験は、選択可能なレポーター遺伝子8,9を使用して突然変異率を測定する最も一般的な方法の 1 つです。酵母、 URA3とCAN1遺伝子は、遺伝子の機能が失われるすべての突然変異型の検出を可能にする前進突然変異試験で記者として使えます。突然変異率はターゲットのレポーターの遺伝子の変異のないシングル コロニーから始まった複数並列文化の観察中央値として。RNase H2 欠損株rnh201Δ はタンデムで 2-5 bp 削除の発現率が上昇によって引き起こされる主穏やかに上昇の全体的な突然変異率などの酵母は、シーケンスを繰り返します。したがって、リボヌクレオチドのゲノムの変異原性の効果を完全に特徴づける、特定の突然変異率を決定する必要があります。この場合は、 URA3またはCAN1のレポーター遺伝子を増幅し、シーケンスの種類と、突然変異の場所を決定することができます、特定の突然変異率を算出することができます。複数の独立したURA3またはCAN1変異体の突然変異をコンパイルは、突然変異スペクトルを生成する使用できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 &#8211; 35 ml per plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAN plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 &#176;C and cool down to 56 &#176;C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FOA plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 &#176;C and cool down to 60 &#176;C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Canavanine sulfate</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FOA</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>F5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass culture tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture rotator in 30 &#176;C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shaker incubator can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm glass beads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312A</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq DNA Polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>MPY80200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Newer model available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Dot Scientific Inc.</td>
			<td>DSF10400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromocresol green</td>
			<td>Eastman</td>
			<td>6356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>International Technologies Inc.</td>
			<td>72120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Nylon membrane Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 MM CHR Chromotography paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7560-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-25 spin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-5325-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NaH2PO4 (S9638); 
			Na2HPO4 (S9390)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying ribonucleotide incorporation: strand-specific detection of ribonucleotides in the yeast genome and measuring ribonucleotide-induced mutagenesis

核 DNA のリボヌクレオチドの存在は、ゲノム不安定性の源であると示されています。リボヌクレオチド定款のエクステントがアルカリ加水分解によって評価される、電気泳動のゲルの RNA は非常にアルカリ条件で加水分解しやすい。これは、南しみ分析との組み合わせで使用できます場所を決定し、リボヌクレオチドが組み込まれてに鎖。ただし、この手順は半定量的のみと感度は向上しますがアンチセンス サザンブロット プロービングにリボヌクレオチド コンテンツの小さな変化を検出する十分な区別できない場合があります。DNA のリボヌクレオチドの最も顕著な生物学的影響の 1 つとしては、前進突然変異試験を使用して自然発生突然変異を分析できます。適切なレポーター遺伝子を使用すると、選択した、全体的な機能の喪失の結果まれな突然変異ができるし、レポーターの遺伝子の DNA 塩基配列と変動実験からのデータを組み合わせることで特定の突然変異率を測定できます。変動アッセイは、さまざまな特定の遺伝的背景や成長条件で変異原性のプロセスを調べるに適用されます。

アルカリ アルカリ電気泳動続いて付いている genomic DNA の治療安定法人リボヌクレオチドの豊かさによる DNA 断片化の半定量的な検出が可能です。酵母ゲノム DNA 治療島5の有無のゲル画像を図 2に示します。Pol2、Polε の触媒サブユニットの M644L バリアントは、M644G 変異体を組み込んだ WT ポリメラーゼよりもより多くのリボヌクレオチド中リボヌクレオチドを組み込む能力を削減しています。プロトコルの詳細、アルカリのゲルは、アンチセンス サザンブロット法によりさらに検出できます。隣接する原点を基準にしてプローブのゲノムのサイトの場所の知識を持つ我々 は選択的に組み込まれて、新生リボヌクレオチドを調べることができるリードまたはラギング繊維。図 3は、発火初期複製の起源ARS30616の近くに 2 つの反対方向に挿入URA3レポーターの遺伝子を調査南しみ結果を示しています。リードするアンチセンス プローブを使用して、初期の主要な鎖 dna WT ひずみと系統の差別ポリメラーゼ α, δ, ε のバリエーションを表現するリボヌクレオチドでアルカリ胸の谷間による DNA フラグメント パターンを観察します。リボヌクレオチド設立。
変動実験を使用して、レポーター遺伝子を含む酵母の突然変異率を測定できます。図 4は、裏3 とCAN1 WT ポリメラーゼまたは機能の RNase H2 の有無pol2 M644G変異株の遺伝子突然変異率を示しています。RNase H2 の欠如は、全体的な突然変異率が両方の背景で適度な増加を引き起こします。ただし、変異特異性を綿密に検討は、系統の RNase H2 を欠けていることを明らかにする (図 5)、特にタンデム繰り返しシーケンス内の短い削除の突然変異率の強力な増加があります。WT および rnh201Δ系統の突然変異特異性を比較して図 5 aと図 5B Pol で初期の主要な DNA 鎖にさらに高架リボヌクレオチド定款の突然変異の効果が表示されます ε。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig1.jpg"> 図 1: 酵母ゲノム DNA にリボヌクレオチド添加によるアルカリに敏感なサイトの特異的検出の手順をプロトコルします。酵母ゲノムの DNA の隔離に始まり、最終南しみ分析を通して進むこの手順でさまざまな主な手順の概要です。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig2.jpg"> 図 2: アルカリ agarose のゲルの電気泳動結果の代表的な画像を取得します。この図は、ニック McElhinny、s. A.らから適応されています5します。 異なる遺伝子型の系統から酵母ゲノム DNA KCl (ニュートラル) または水酸化カリウム (アルカリ性) を施した、中性またはアルカリ性の agarose のゲルの分離と。「重量」と"M644G"ポルのステータスを示す ε.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig3.jpg"> 図 3: アンチセンス サザンブロットによるアルカリ agarose のゲルのプロービングします。この図から適応されているウィリアムズ、司法書士ら13。 (A) URA3レポーターの遺伝子 (または 1 つと OR2) 2 つの反対の方向でARS306の近くに挿入されている内初期の主要な DNA の繊維に radiolabeled プローブ アニール。(B)南しみが付く初期主要な特異的プローブを用いた代表的な結果。表示されるpol3 L612M pol2 M644Gまたはpol1 L868MWT DNA ポリメラーゼにひずみの初期の主要な繊維のプロービングの結果バリアント系統 RNase H2 の有無。POL1、 POL2、およびPOL3遺伝子は、それぞれ政治家 α、ε、δ の触媒サブユニットをエンコードします。バリアントは、リボヌクレオチド定款5,12,17より無差別。(C) (B)から各レーンの合計の割合によって放射性の信号の定量化。値は、合計の割合として表されます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig4.jpg"> 図 4: 酵母の自然突然変異率。この図は、ニック McElhinny、s. A.らから適応されています5. URA3とCAN1レポーター遺伝子が指定された系統の突然変異率を測定するため前進突然変異試験で使用されました。URA3 記者は、「オリエンテーション 2」(OR2、図 3 a).95% 信頼区間 (CI) は測定ごとに含まれています。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig5.jpg"> 図 5: URA3 OR2 レポーターの遺伝子の突然変異スペクトル。この図は、前の出版物5,18,19,20から適応されています。前進突然変異試験で選択した各独立の 5 耐 FOA 植民地に観察位置と変異型は、804 で描かれている bp URA3コーディング シーケンス。文字を示すベース オープン三角形の置換を示す単一基本削除、閉じた三角形を示す単一の基本挿入、実線を示す短い削除。WT ・ rnh201Δ系統(A)突然変異スペクトル。シーケンスの上に赤いラベルは、シーケンスの下青ラベルは、 rnh201Δ株で観察しながら、WT で観察された突然変異です。Pol2 M644Gとpol2 M644G rnh201Δ系統(B)突然変異スペクトル。シーケンスの上に赤いラベルは、 pol2 M644G pol2 M644G rnh201Δ系統の順序の下に青の中で観察された突然変異です。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

リボヌクレオチドは真核生物の核 DNA 複製時にゲノムに組み込む最も豊富な非正規のヌクレオチドです。正しくない削除、DNA 損傷と突然変異誘発リボヌクレオチドが発生します。リボヌクレオチド混入 DNA とその変異原性効果の豊かさを評価するために使用される 2 つの実験的アプローチを紹介します。

勉強リボヌクレオチド定款: 酵母ゲノムとリボヌクレオチド誘発突然変異を測定のリボヌクレオチド鎖特異的検出

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

studying-ribonucleotide-incorporation-strand-specific-detection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K ビュー.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS. リボヌクレオチドは真核生物の核 DNA 複製時にゲノムに組み込む最も豊富な非正規のヌクレオチドです。正しくない削除、DNA 損傷と突然変異誘発リボヌクレオチドが発生します。リボヌクレオチド混入 DNA とその変異原性効果の豊かさを評価するために使用される 2 つの実験的アプローチを紹介します。

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

出芽酵母の複製寿命の測定

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

生物学

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

アダルトゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスとファイン解剖（ゼブラフィッシュ）

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

単一の卵重亜硫酸塩の突然変異誘発

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

COSMICと細胞の薬剤-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング（小分子の架橋は、クロマチンを分離するために）

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...