HAC Milton E. Cassel bilgin Rita Allen Vakfı (http://www.ritaallenfoundation.org) yapıldı. Bu eser HAC için Ulusal Enstitüsü, genel tıbbi Bilimler R01 GM081686, R01 AR070245, Ulusal Enstitüsü () genel tıbbi Bilimler R01 GM0866465, Eli ve Edythe rejeneratif tıp geniş merkezi ve kök hücre araştırma hibe tarafından finanse edildi Rose Hills ve Hal Gaba Ödülleri), Iris Cantor kadın Sağlık Merkezi/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, lösemi lenfoma Derneği etkisi Jonsson kapsamlı kanser Merkezi'nden ödül WEL ve HAC için. Bu yayında bildirilen araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası P50CA092131 altında Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. HAC Eli & Edythe rejeneratif tıp geniş merkezi & kök hücre araştırmaları, UCLA Moleküler Biyoloji Enstitüsü ve UCLA Biyoinformatik bölümler arası Programı üyesidir.

Açıklanan tüm deneylerin hayvan bakımı Komitesi Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles tarafından kabul edildi.
1. dondurulmuş fare deri slaytlar oluşturmak
<ol><li>Fareler kurum politikası doğrultusunda ötenazi. Not: koruyucu giysiler için kurumsal ilke uygulayın. Tüm iletişim kuralları hayvanları içeren kurumsal hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış olması gerekir.</li>
	<li>Fare ile bir hayvan kılı düzeltici tüylerden.</li>
	<li>İnsizyon deri makas kullanarak olun. Forseps kullanarak, uzak fare cilt kaldırın. Makas kullanarak, cilt Bölüm Kes gitsin.</li>
	<li>Cryomold reaktif bileşik dondurma ile doldurun ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Cilt iğne burunlu bölümlere dolu cryomolds kullanarak forseps yerleştirin. Cilt dokusu dilimlerin bir kesit derinin epidermis dermis, hypodermis ve kas (Şekil 2) oluşturur gelecek şekilde yönlendirin. Not: Eğer mümkünse, deneysel bağlayabilir ve böylece aynı slayt kesitli ve birlikte işlenen fareler birlikte aynı cryomold kontrol. Kabarcıklar oluşturmak değil için dikkat ediniz.</li>
	<li>Cryomold bir buz kovası Kuru buz kalıbı düz yüzeye yerleştirin ve dondurma izin. Cilt yönünü izlemeye devam edin. Gerekirse ayarlayın. Not: Kuru buz işlerken kriyojenik eldiven giymek.</li>
	<li>Cryomolds-80 ° C dondurucu depolama içine aktarın. Örnekleri dondurucuda yaklaşık 3 ay enzimatik aktivite, önemli kaybı olmadan sürdürülebilir. Donmuş bölümleri kurumasına izin vermeyin.</li>
	<li>-20 ° c, 7-10 µm en iyi cilt morfoloji21için kalın bölümler oluşturmak için dilim doku bir cryostat kullanarak.</li>
</ol>2. slayt boyama için hazırlanması
<ol><li>Test edilmesi için slaytlar kümesi oluşturun. Bir denetim slayt üzerinde NAD tevkif içerir ve başka bir denetime slayt üzerinde belgili tanımlık substrate, laktat, tevkif edilecektir. Daha önce soruşturma bir donmuş doku blok olumlu denetim slayttan içerir.</li>
	<li>Kısaca 5 min için % 4 formalin ile cilt bölümü içeren slaytlar ya pipetting 1 mL % 4 formalin bir slayda veya birden çok slayt, slayt %4 formalin içeren bir konteyner içine daldırma tarafından işlenmesi sırasında düzelt. Not: Cilt slaytlardan aşağıdaki yordamlar ve korunağı cilt morfoloji sırasında soyulmak değil fiksasyonun sağlayacaktır. Dikkat: Formalin kanserojen ve tehlikeli olduğunu; eldiven giymek, senin cilde temas ve kimyasal duman mahallede bu adımı gerçekleştirin izin vermeyin.</li>
	<li>En az 1 mL fosfat ile yıkama slaytlar arabelleğe alınmış serum, pH 7.4, slayt pipetting veya daldırma.</li>
</ol>3. çözüm boyama hazırlanması
<ol><li>Laktat dehidrogenaz aktivitesi boyama için girdap birlikte reaktifler (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM phenazine methosulfate (PMS), 600 µM nitrotetrazolium mavi klorür ve 30 mM laktat) boyama miktarına bağlı olarak uygun ölçekli bir tüp Çözüm gerekli. Not: 1 mL tamamen bir slayt karşılamak için yeterli olur.</li>
	<li>Tüm reaktifler NAD dışında mevcut olan ikinci bir çözüm hazırlamak. Tüm reaktifler laktat dışında mevcut olan üçüncü bir çözüm hazırlamak.</li>
</ol>4. kuluçkaya slaytlar çözüm boyama
<ol><li>Yavaşça damlalıklı boyama çözüm veya bölümün tamamını kapsayan hazırlanan slaytlar üzerine kontrol çözümleri (1 mL bir slayt için yeterli). Birden çok slayt birlikte işlenen eğer boyama çözüm tüm slaytlara aynı anda daldırma (kapsayıcı tamamen doku bölümü karşılamak için yeterli bir çözüm olduğundan emin olun).</li>
	<li>Karanlıkta 37 ° C'de oksijen bir ortamda slaytlar kuluçkaya. Çözüm boyama slayt üstünde ise, slayt buharlaşma önlemek için oksijen bir ortamda yerleştirin.</li>
</ol>5. monitör slaytları
<ol><li>Boyama çözüm dönüşümden görsel denetim tarafından mavi için Sil izlemek. Örnekleri mavilik istenen seviyeye ulaşmış, reaksiyon boyama çözüm kaldırarak durdurur. Not: cilt için 10 dakika yeterlidir. Zaman organ ve enzimatik aktivite bağlı olacaktır.</li>
	<li>Pipetting tarafından slaytlar fosfat tamponlu tuz ile yıkayın (1 mL her slayt için yeterli) veya daldırma. Not: birbirine Karşılaştırılacak herhangi bir örnekleri boyama çözümde aynı süre için muhafaza edilmelidir.</li>
</ol>6. counterstain ve mount
<ol><li>Damlalıklı slayta slaytları mavilik uygun düzeyine ulaştığında counterstain. Not: çekirdeklerin açmak kırmızı veya yeşil Counterstains formazan tarafından precipitant oluşturulan mavi ile iyi kontrast sağlar.</li>
	<li>Sulu ya da sulu olmayan orta22montaj ile bağlayın. 1-3 damla (40-50 µL) montaj orta kapak notu boyutuna bağlı olarak yeterli.</li>
</ol>7. resim slayt ve ölçmek
<ol><li>Resim slaytları ışık mikroskop altında. Deneysel fotoğraflarını ve kontrol örnekleri ve 10 X, 20 X ve 40 X büyütme, tüm negatif kontrolleri al.</li>
	<li>Mavi leke görüntü analiz yazılımı ile farklı bölgelerdeki yoğunluğunu belirlemek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).</li><li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects.">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li><li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues.">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells.">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments.">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482 (2016).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer:+A+systematic+review+with+meta-analysis.">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li><li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies.">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li><li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A:+Therapeutic+potential+in+brain+tumor.">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li><li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+gene:+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure,+function+and+regulation.">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li><li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase.">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li><li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation.">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li><li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism.">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH/NAD(+)+redox+homeostasis+in+cancer+cells.">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer.">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li><li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity.">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li><li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+[1-(1)(3)C]pyruvate.">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).</li><li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation.">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy.">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Burada anlatılan yöntem laktat dehidrogenaz veya NADH ya da NADPH, farklı hücre tipleri bir doku veya bir doku zaman içinde farklı bölümlerini içinde oluşturmak diğer metabolik enzimler etkinliğini izlemek için kullanılabilir. Laktat dehidrogenaz kök hücreler ve tümör biyolojisi anlamak için önemli bir enzimdir ve tek tek hücreler laktat dehidrogenaz etkinliğini izlemek için yeteneği önemli anlayışlar bu enzim fonksiyonu sağlamak olasıdır.
Bir önemli avantaj bu protokolün diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında bu sadece protein bereket yerine, enzimatik etkinliğini izleme yeteneği, sadece laktat dehidrogenaz enzim nerede hakkında daha kesin bilgi neden olabilir Mevcut, ama onlar aslında işlevsel nerede. Böylece seçili bir protein, örneğin, bir hücre lineage işaret düzeyi aynı doku örneklerinde laktat dehidrogenaz aktivitesi olarak belirlenir burada açıklanan yaklaşım immünhistokimya ile birleştirilebilir. Laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme için MRG tabanlı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, gelen doğrulama büyük uzaysal çözünürlük sağlamak ve bir doku içindeki yüksek enzim etkinliğine sahip belirli hücreleri belirlemek için yardımcı bir avantaja sahiptir. . Eşleme metabolizma fluorogenic yüzeyler üzerinde dayalı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, sinyal açıklanan protokol ile tespit autofluorescence1ile sınırlı değildir. Miller ve co-yazar zaman bağımlılığı ve beş farklı enzim substrat bağımlılık benzer bir çözümleme formazan7dönüşüm izleme tarafından yapılır. Tepkiler enzim kinetiği stokiometrik ilkeleri takip için keşfedildi. Miller ve co-yazar ayırt edici mitokondriyal enzimlerin mitokondrial sigara enzimler mitokondri boyama7ile ortak yerelleştirme tarafından gelen. 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium klorür (CTC) hücre altı ortak yerelleştirme analiz7için confocal mikroskobu ardından bir algılama reaktifi olarak kullandılar.
Açıklanan yöntemi de dezavantajları vardır. MRI tabanlı yaklaşımlar-ebilmek var olmak kullanılmış içinde yaşayan organizmalar, dondurulmuş veya taze doku açıklanan yaklaşım gerektirir. Enzimlerin aktivitesini bozulmasına yol açar çünkü zaman içinde bir kaç ay, ne zaman hatta dondurulmuş dokularda sadece uygun dondurulmuş. Substrat fazla sağlandığından, daha fazla, yaklaşım bilgi "etkinliği potansiyel" substrat mevcut olduğunu varsayarak üzerinde sağlar. Substrat düzeyde sınırlama var Eğer bu tahlil ile gözlenen aktivitesi dağıtımı fizyolojik olarak meydana gelen etkinlik olan sapma. Buna ek olarak, aynı enzimatik aktivite gerçekleştirmek farklı izoformlarının aynı enzim varsa, burada sunulan yöntem bunları birbirinden ayırt etmek mümkün değildir. Örneğin, sunulan Yöntem LDHA LDHB karşı faaliyet arasında ayrım yapamaz. Bu sorun genetik olarak kullanmak olacaktır adresi için bir yaklaşım tek enzim izoformu genetik olarak Inaktif olduğu fareler mühendislik.
PMS ile tecrübe var., Elektron transferi NADH ve tetrazolium arasında aracılık eder bir photochemically istikrarlı elektron taşıyıcı23boyuyor. Bazı bilim adamları PMS glikoz 6 fosfat dehidrogenaz aktivitesi inhibe ve PMS yararsızdır5buldum rapor etmiş olsa da, enzim yerelleştirme için değerli olması ve bizim iletişim kuralında dahil PMS bulduk. Bazı diğer yazarlar difüzyon glikoz 6 fosfat dehidrogenaz enzim1sınırlamak için polivinil alkol kullanma bildirdi. Deneylerimiz, biz yardımcı olmak için polivinil alkol bulamadık ve o ortadan.
Bir kaç adım boyama başarısı için önemlidir. Bir önemli konu doku örnekleri düzgün cyromolds içinde yerleştirilir garanti etmektedir. Böylece cilt üzerinde düz dilimler kesip deri bölümleri koydu. Hazır olmak için birden çok bölüm varsa, birlikte aynı slaytta dilimlenmiş bu yüzden aynı cryomold içinde katıştırılmış buna ek olarak, bu idealdir. Bu cryostat ile kesilir slaydın kalınlığı nedeniyle değişim ortadan kaldırmak için yardımcı olacaktır. Doku hala enzimatik aktivite tutar emin olmak önemlidir.
Reaksiyon sona erdirmek için en iyi zaman ampirik olarak tespit edilmelidir. Slaytları yakından kuluçka döneminde izlemek ve counterstain ekleyin ve mavi leke yoğunluğuna göre slaytlar mount için uygun bir zaman belirlemek gereklidir. Örnekleri çok hafif lekeli, etkinliğin nerede belirlemek mümkün olmayacaktır. Örnekleri overstained, faaliyet aslında yüksek belirli alanları tespit zorlaştırır formazan çökelti yayılabilir.
Biz bu protokolü rolü hakkında sorular metabolizmasının geniş bir yelpazesi ile bilim adamları için değerli olacaktır tahmin. Metabolik aktivite ve hücre lineage işaretleri veya nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleri, genetik modelleri, hücre altı yerelleştirme enzimatik aktivitenin değerlendirilmesi ile farklı enzim katkıları değerlendirmek için ortak boyama uygulamaları izleme enzimatik aktivite hastalıklı bir doku veya geliştirme sırasında.

Mekanlar enzimleri yüksek veya düşük aktivite olan dokularda anlamak anlayış geliştirme ve Fizyoloji için esastır. Transkript veya protein düzeyleri kez enzimatik aktivite için vekilleri olarak kullanılır. Bu tür çalışmalar bilgilendirici olabilir, onlar translasyonel modifikasyon, protein kompleksleri veya enzim hücre altı yerelleştirme varlığı gibi bir enzim aktivite belirlemek için kritik olabilir bilgi vermeyin. Enzimatik etkinliğini doğrudan ölçülen zaman, artık bir doku içinde yüksek veya düşük aktivite ile karışım veya kayma dağıtım hücrelerin içindeki tek tek hücreler hakkında bilgi içeren homojenize protein lysates içinde sık sık izlenir.
Biz burada bir doku örneği içinde enzimatik aktivite kayma dağılımını eşlemek için detaylı bir protokol sağlar. Metodoloji önceki çalışmalar tetrazolium tuzları dehydrogenases, redüktaz ve oxidases dondurulmuş doku1aktivite yerelleştirmek için kullanılabileceğini gösteren temel alır. Proton bir tetrazolium tuz2,3' e transfer edildiğinde bu yöntemler ile bir su çözünmez formazan oluşur. Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz NADPH ve bir proton oluşturur ve tetrazolium aktivite ile tespit edilmiştir. Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz içinde Avrupa dere pisisi tetkikine4, alveoler tip 2 hücrelerinde5 akciğer ve böbrek5ın takip. Tetrazolium tuzları da donmuş doku6transketolase etkinliğini izlemek için kullanılmaktadır. Benzer bir yaklaşım son zamanlarda bitişik slayt7aynı doku içinde birden çok dehydrogenases etkinliğini izlemek için kullanıldı.
Biz burada tetrazolium tuzları laktat dehidrogenaz aktivitesi (Şekil 1) kayma dağılımını izlemek için kullanılacak bir yöntem açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz glikoliz laktat ve ters tepki tarafından oluşturulan pyruvate dönüştürebilirsiniz. Laktat dehidrogenaz sonuç olarak pyruvate'nın giriş tricarboxylic asit çevrimi laktat onun salgısı karşı önemli bir belirleyici bir faaliyettir. Kan laktat seviyeleri kez hastalıklar, hastalık veya yaralanma hücreler zarar vermişse ve enzim piyasaya sinyal çünkü kanser8,9,10, dahil olmak üzere bir dizi teşhis etmek için kullanılır.
Dört laktat dehidrogenaz genler vardır: LDHA, LDHB, LDHC ve LDHD11. LDHA ve LDHB bir erken LDHA gen12tekrarını ortaya çıktığı düşünülmektedir. Karaciğer bir tetramer etkindir ve LDHA ve LDHB homotetramers ve heterotetramers birbirleri ile oluşabilir. LDHA LDHB daha yüksek laktat benzeşim ve tercihen laktat pyruvate13için dönüştürmek için rapor ederken pyruvate için daha yüksek ilgi var bildirilmektedir. LDHA organizatörü bağlayıcı siteleri HIF1α, cMYC ve FOXM1 transkripsiyon faktörleri11içerir. Buna ek olarak, birçok diğer glycolytic enzimler14,15gibi karaciğer post-translational modifications tarafından değiştirilebilir. Fibroblast büyüme faktörü reseptörü 1 LDHA tetramer oluşumu teşvik, Y10 veya NADH substrat bağlama16teşvik Y83 fazdan. LDHA-ebilmek da var olmak acetylated17. Bu nedenlerden dolayı sadece karaciğer protein düzeyleri, ama enzim aktivitesi de izleme karaciğer etkinlik tam bir anlayış gerektirir.
Burada mevcut yöntemi yanı sıra diğer yaklaşımlar laktat dehidrogenaz etkinliğini izlemek için kullanılmaktadır. Laktat dehidrogenaz aktivitesi spectrophotometrically homojenize protein lysate izlenebilir. Gibi laktat pyruvate için dönüştürülür NADH nesil 340 absorbans temel alarak ölçülebilir nm, süre gibi pyruvate laktat18için dönüştürülür NADH kaybolması izlenebilir. Laktat dehidrogenaz aktivitesi manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile de izlenir. 13 C-pyruvate idare ve laktat pyruvate dönüşüm oranı olarak izlenebilir [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate. Yüksek oranları [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate kanser dokusu19' gözlemlenmiştir. MRI tabanlı yaklaşımlar laktat dehidrogenaz aktivitesi normal ve hastalık doku üzerinde bilgi sağlayabilir iken, metodolojiler belirli hücrelerdeki faaliyet düzeyi belirlemek için gereken çözünürlük var mı. Burada sağlanan metodoloji laktat dehidrogenaz aktivitesi tek hücre doku alanları ve hatta ilgili bilgi sağlar.
Situ etkinlik testleri kullanarak, laktat dehidrogenaz aktivitesinin fare cilt20saç kökü kök hücrelerde yüksek olduğunu fark ettik. Biz de laktat dehidrogenaz kültürlü embriyonik kök hücre içinde etkinliğini izlemek ve faaliyetin besleyici katman kök hücre içinde daha yüksek olması kurmak için kullanılan yöntem. Son olarak, taze fare aort laktat dehidrogenaz aktivitesinin izlenmeli ve düz kas hücrelerinde boyama görülmektedir. Biz burada donmuş fare cilt laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme için detaylı bir protokol tanımlamak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:312px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;">For collecting skin from euthanized mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9511236</td>
			<td style="width:217px;">For freezing mouse skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9638938</td>
			<td style="width:217px;">For mounting cryomolds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">07-210-106</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polysine Adhesion Slide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-545-78</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">4% formalin</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;">Dilluted in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">vortex</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris base</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NAD</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N7004</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P9625</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Nitrotetrazolium blue chloride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N6876</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lithium L-lactate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">L2250</td>
			<td style="width:217px;">Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">37&#176;C incubator (or tissue culture incubator)</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Braziliant! Counter stain</td>
			<td style="width:164px;">Anatech</td>
			<td style="width:121px;">861</td>
			<td style="width:217px;">Counter stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:164px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:121px;">H-5000&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Cover slips for slides</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-544D</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

Uzay ve zamanın enzimatik aktivite haritalama normal doku ve hastalık hücre davranışı moleküler temeli anlamak için önemlidir. Situ metabolik aktivite deneyleri bir doku içinde metabolik aktivite kayma dağıtımı hakkında bilgi sağlar. Biz burada enzim laktat dehidrogenaz doku örnekleri içinde doğrudan etkinliğini izlemeye yönelik detaylı bir protokol sağlar. Laktat dehidrogenaz olup tüketilen glikoz enerji aerobik veya anaerobik glikoliz yoluyla dönüştürülür önemli bir belirleyici olduğunu. Laktat ve NAD içeren bir çözüm bir donmuş doku bölümüne sağlanır. Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD) NADH ve tespit edilebilir bir proton azaltılmasına dayanan sağlanan aynı anda dönüştürme sırasında hücreleri yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi pyruvate için sağlanan laktat dönüştürme nitrotetrazolium mavi formazan, mavi bir çökelti görüntülenir. Biz fare cilt laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme için detaylı bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı uygulamak, laktat dehidrogenaz aktivitesi yüksek deneniyor saç kökü kök hücreleri cilt içinde olduğunu fark ettik. Protokol kültür fare embriyonik kök hücre için uygulama daha yüksek kültürlü embriyonik kök hücre boyama fare embriyonik fibroblastlar ortaya koydu. Çözümleme taze izole fare aort düz kas hücrelerinde aort için dikey boyama ortaya. Sağlanan metodoloji dağınık şekilde bir proton dondurulmuş ya da taze doku oluşturmak enzim aktivitesinin eşlemek için kullanılabilir.

Biz daha önce fare cilt20 in situ faaliyet deneyleri için sonuçlar bildirdin. Şekil 3' te gösterildiği gibi saç kökü kök hücre yukarıdaki yordamları tarif ederken Folliküler temelini laktat dehidrogenaz aktivitesinin yüksek seviyeleri takip edildi gözlenen. Bu bulgular deri saç kökü kök hücre için sıralama ve yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi kök hücre yerde sıralanmış hücreleri üzerinde etkinlik deneyleri ile teyit floresans aktif hücre tarafından corroborated.
Saç kökü kök hücreler yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi var bizim bulgularına dayanarak, biz çalışmalarımızda kültürlü embriyonik kök hücrelerin genişletilmiş. Fare embriyonik fibroblastlar bir besleyici katman olarak hizmet veren tek başına veya embriyonik kök hücre huzurunda analiz edildi. Kültürlü hücreleri analiz etmek için orta emişli ve hücreleri kısa bir süre sabit ve laktat dehidrogenaz yukarıda açıklandığı gibi çözüm boyama ile inkübe. Embriyonik fibroblastlar (Şekil 4) embriyonik kök hücreleri fare ile karşılaştırıldığında yüksek laktat dehidrogenaz etkinliğinde görülmektedir.
Ayrıca taze izole dokusu ile boyama Protokolü başvurdum. Fare aortas disseke ve açık dilimlenmiş. Damarları açtı ve immobilize böylece iç aortas lümen erişilebilir. Örnekleri Hank'in dengeli tuz Triton-X 10 dk sonra çözüm için 10 dk. laktat dehidrogenaz çözüm boyama boyama laktat dehidrogenaz ile taze doku uygulanan % 0.5 içeren çözüm ile inkübe. Kuluçka sonra düz kas hücrelerinde (Şekil 5) boyama gösterilen görüntü toplanmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig1.jpg"> Resim 1 : Kimyasal etkinlik laktat dehidrogenaz ve onun algılama. Laktat dehidrogenaz laktat + NAD dönüştürür pyruvate + NADH + H+için. Oluşturulan proton nitroblue tetrazolium mavi bir çökelti oluşturacak formazan için azaltır. <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig2.jpg"> Resim 2 : Cryomolds deride fare yönlendirme, şematik. Böylece kesim her bölüm tüm cilt epidermis, dermis, hypodermis ve kas kesiti içerecek fare deri cryomolds içinde odaklı olmalıdır. <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig3.jpg"> Şekil 3 : Laktat dehidrogenaz fare deri boyama saç kökü kök hücreler yüksek aktivite ortaya koymaktadır. Fare cilt cryomolds içinde donmuş ve inkübe laktat dehidrogenaz ile laktat içeren çözüm boyama. Laktat dehidrogenaz aktivitesi saç kökü kök hücre önemli. (A, B) Laktat dehidrogenaz etkinliği tahlil fare deri iki resim. (C, D) İki resim denetiminin tevkif substrat laktat ile boyama. Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig4.jpg"> Şekil 4 : Yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi kültürlü fare embriyonik kök hücre içinde. Kültür fare embriyonik kök hücreleri bir radyoaktif fare embriyonik fibroblast besleyici katman üzerinde yetiştirilen laktat dehidrogenaz aktivitesi için analiz edildi. Yüksek etkinlik ile fibroblastlar göre kök hücre gözlendi. Fare embriyonik fibroblastlar ve ışınlama olmadan boyama benzer düzeyde gösterdi. Görüntüleri bir 20 X amacı ile alındı. Ölçek çubuğu = 50 µm. (A, B, D, E) fare embriyonik fibroblastlar ve kök hücreler. (C, F) Fare embriyonik fibroblastlar yalnız. (A-C) Görüntüleri, kuluçka çözüm boyama ile 7 dakika sonra alındı. (D-F) Görüntüleri, kuluçka çözüm boyama ile 20 dakika sonra alındı. <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig5.jpg"> Şekil 5 : Yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi fare aort çevreleyen düz kas hücrelerindeki. Aortas euthanized fareler izole edildi. Gemiler için % 2 paraformaldehyde 2 dakikada tespit edildi ve 3 x 10 dakika 1 x fosfat tamponlu tuz yıkanmış. Damarları Hank'in %0.5 Triton-X ve yıkanmış 3 x 5 dakika içinde tamponlanmış fosfat salin ile dengeli tuz solüsyonu ile inkübe. Laktat dehidrogenaz çözüm boyama eklendi ve örnekleri 37 ° C'de 10 dakika inkübe ve 3 x 5 dk 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile yıkanır. Örnekler % 2 paraformaldehyde 1 saat sonra tespit edildi, 3 x 5 dk 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile yıkanır ve görüntüsü. (A) laktat içeren laktat dehidrogenaz çözüm. (B) laktat dehidrogenaz çözüm olmadan laktat olarak bir negatif kontrol. Her bölüm için bir alt büyütme görüntü soldaki ve sağdaki daha yüksek büyütme ile belirlenmiş bir alanda gösterilir. (A, B) Laktat içeren tam laktat dehidrogenaz çözüm boyama için kullanıldı. B büyütülmüş görüntü görüntü A. (C, D) laktat dehidrogenaz çözüm olmadan laktat belirtilen alanında bir negatif kontrol boyama için kullanılan var. D C. belirtilen alanda büyütülmüş bir görüntüsüdür A ve C 20 X hedefleri ile alınmıştır (ölçek çubuğu 50 µm =) ve B ve D 40 X amacı ile alınmıştır (ölçek çubuğu 20 µm =). <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

Biz nicotinatmide adenin dinükleotit fosfat (NAD(P)H) + H + doğrudan doku örnekleri '. oluşturmak enzimler için enzimatik aktivite kayma dağıtım eşleştirmek için bir protokol tarif

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

mapping-metabolism-monitoring-lactate-dehydrogenase-activity-directly

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K Görüntüleme.  UCLA. Biz nicotinatmide adenin dinükleotit fosfat (NAD(P)H) + H + doğrudan doku örnekleri '. oluşturmak enzimler için enzimatik aktivite kayma dağıtım eşleştirmek için bir protokol tarif

Video: Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Biyokimya

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine whether there is an imbalance in age-related energy metabolism between mitochondrial oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis. Here, we show the utilization of commercial colorimetric assay kits for lactate and pyruvate in the model organism C. elegans. Recently, the sensitivity and accuracy of the colorimetric/fluorimetric assay kits have been improved greatly by the research and development conducted by reagent manufacturers. The improved reagents have enabled the use of small-scale assays with a 96-well plate in C. elegans. In general, a fluorimetric assay is superior in sensitivity to a colorimetric assay; however, the colorimetric approach is more suitable for the use in common laboratories. Another important issue in these assays for quantitative determination is protein precipitation of homogenized C. elegans samples. In our protein precipitation method, common precipitants (e.g., trichloroacetic acid, perchloric acid and metaphosphoric acid) are used for sample preparation. A protein-free assay sample is prepared by directly adding cold precipitant (final concentration of 5%) during homogenization.

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe a modified small-scale extraction and colorimetric assays of lactate and pyruvate in the nematode C. elegans. When utilizing commercial assay kits, the technical development of their sensitivity and accuracy is important. Protein precipitation in extraction is the most critical step for the quantitative determination of intracellular metabolites.

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Ölçme ve oksijen Tüketim oranları tamamen yorumlama kafa kesimleri sinek

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

Karaciğer Kanserinde SUMO Proteomunun Zenginleştirilmesi, İzolasyon, Tanımlama ve Karakterizasyonu Için Araçlar Olarak SUMO Bağlayıcı Varlıklar (SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is going to move beyond the laboratory and become a widespread and standard just in time manufacturing technology, we must understand the performance limits of these systems. Toward this question, we developed a robust protocol to quantify 40 compounds involved in glycolysis, the pentose phosphate pathway, the tricarboxylic acid cycle, energy metabolism and cofactor regeneration in CFPS reactions. The method uses internal standards tagged with 13C-aniline, while compounds in the sample are derivatized with 12C-aniline. The internal standards and sample were mixed and analyzed by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS). The co-elution of compounds eliminated ion suppression, allowing the accurate quantification of metabolite concentrations over 2-3 orders of magnitude where the average correlation coefficient was 0.988. Five of the forty compounds were untagged with aniline, however, they were still detected in the CFPS sample and quantified with a standard curve method. The chromatographic run takes approximately 10 min to complete. Taken together, we developed a fast, robust method to separate and accurately quantify 40 compounds involved in CFPS in a single LC/MS run. The method is a comprehensive and accurate approach to characterize cell-free metabolism, so that ultimately, we can understand and improve the yield, productivity and energy efficiency of cell-free systems.

Here, we present a robust protocol to quantify 40 compounds involved in central carbon and energy metabolism in cell-free protein synthesis reactions. The cell-free synthesis mixture is derivatized with aniline for effective separation using reversed-phase liquid chromatography and then quantified by mass spectrometry using isotopically labelled internal standards.

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective denaturation of proteins from RNA, 3) ribonuclease inactivation, and 4) removal of contamination from DNA, proteins, and carbohydrates. However, it is very laborious to maintain the integrity of RNA when there are high levels of RNase in the tissue. Spontaneous autolysis makes it very difficult to extract RNA from pancreatic tissue without damaging it. Thus, a practical RNA extraction method is needed to maintain the integrity of pancreatic tissues during the extraction process. An experimental and comparative study of existing protocols was carried out by obtaining 20-30 mg of rat pancreatic tissues in less than 2 minutes and extracting the RNA. The results were assessed by electrophoresis. The experiments were carried out three times for generalization of the results. Immersing pancreatic tissue in RNA stabilization reagent at -80 &#176;C for 24 h yielded high integrity RNA, when the RNA extraction reagent was used as the reagent. The results obtained were comparable to the results obtained from commercial kits with spin column bindings.

The purity and integrity of the isolated RNA is a vital step in RNA dependent assays. Here, we present a practical, rapid, and inexpensive method to extract RNA from a small quantity of undamaged pancreatic tissue.

Rat Pankreas Dokusunun Hızlı ve Uygun Maliyetli RNA Ekstraksiyonu

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains of &#945;1,4-linked glucose residues with branches introduced through the addition of &#945;1,6-linkages. Understanding how the synthesis and degradation of glycogen are regulated and how glycogen attains its characteristic branched structure requires the study of the enzymes of glycogen storage. However, the methods most commonly used to study these enzyme activities typically employ reagents or techniques that are not available to all investigators. Here, we discuss a battery of procedures that are technically simple, cost-effective, and yet still capable of providing valuable insight into the control of glycogen storage. The techniques require access to a spectrophotometer, operating in the range of 330 to 800 nm, and are described assuming that the users will employ disposable, plastic cuvettes. However, the procedures are readily scalable and can be modified for use in a microplate reader, allowing highly parallel analysis.

Techniques to measure the activity of key enzymes of glycogen metabolism are presented, using a simple spectrophotometer operating in the visible range.

Ökaryotik Glikojen Metabolizmasının İncelenmesi için Spektrofotometrik Yöntemler

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...