HAC fu lo studioso di Milton E. Cassel della Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni per HAC dal National Institute di R01 di scienze mediche generali GM081686, R01 AR070245, Istituto nazionale di generali (Medical Sciences R01 GM0866465, Eli ed Edythe Broad centro di medicina rigenerativa e ricerca sulle cellule staminali Colline di rose e Hal Gaba awards), Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, alla Leukemia Lymphoma Society, impatto Iris Cantor femminile premi da Jonsson Comprehensive Cancer Center a WEL e HAC. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institute del National Institutes of Health, sotto Premio numero P50CA092131. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. HAC è un membro della Eli & Edythe Broad centro di medicina rigenerativa & ricerca sulle cellule staminali, l'Istituto di biologia molecolare di UCLA e il programma interdipartimentale di bioinformatica di UCLA.

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dal comitato di cura animale presso l'Università di California, Los Angeles.
1. generare diapositive della pelle del topo congelati
<ol><li>Eutanasia topi in conformità alla politica di istituzione. Nota: Seguire la politica istituzionale per indumenti di protezione. Tutti i protocolli che coinvolgono gli animali devono essere approvati dal Comitato cura animale istituzionale.</li>
	<li>Rimuovere i capelli del mouse con un trimmer peli di animali.</li>
	<li>Fare delle incisioni nella pelle usando le forbici. Usando il forcipe, sollevare la pelle dal mouse. Utilizzando le forbici, tagliare la sezione di pelle.</li>
	<li>Riempire il cryomold con congelamento reagente composto (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Sezioni di pelle posto in cryomolds riempito usando il forcipe dal naso dell'ago. Orientare la pelle affinché fettine di tessuto genererà una sezione trasversale della pelle dall'epidermide al derma, ipoderma e muscolo (Figura 2). Nota: se possibile, montare sperimentale e topi di controllo insieme alla cryomold stesso modo possono essere sezionati sulla diapositiva stessa ed elaborate insieme. Fare attenzione a non per creare bolle.</li>
	<li>Posto cryomold sulla superficie piana di un blocco di ghiaccio secco in un secchio di ghiaccio e far congelare. Continuare ad osservare l'orientamento della pelle. Regolare se necessario. Nota: Indossare guanti criogenici maneggiare ghiaccio secco.</li>
	<li>Trasferimento cryomolds in un congelatore-80 ° C per la conservazione. I campioni possono essere mantenuti in freezer per circa 3 mesi senza una significativa perdita di attività enzimatica. Sezioni congelate non lasciare asciugare.</li>
	<li>Utilizzando un criostato a-20 ° C, fetta del tessuto per creare sezioni 7-10 µm di spessore per la miglior pelle morfologia21.</li>
</ol>2. preparazione diapositive per la colorazione
<ol><li>Stabilire il set di diapositive da testare. Includono un vetrino di controllo su cui sarà trattenuto il NAD e far scorrere un altro controllo in cui il substrato, lattato, verrà trattenuto. Includere un vetrino di controllo positivo da un blocco di tessuto congelato precedentemente studiato.</li>
	<li>Brevemente Difficoltà diapositive contenente sezioni di pelle con formalina 4% per 5 min da pipettaggio 1 mL di formalina 4% sulla diapositiva, o durante l'elaborazione di più diapositive, immergendo i vetrini in un recipiente contenente formalina 4%. Nota: La fissazione garantirà che la pelle non staccare dalle diapositive durante le seguenti procedure e preservare la morfologia della pelle. Attenzione: La formalina è un agente cancerogeno e pericolose; indossare guanti, non lasciare che toccare la tua pelle ed eseguire questo passaggio in una cappa chimica.</li>
	<li>Lavare i vetrini con il fosfato di almeno 1 mL tampone, pH 7.4, per ogni diapositiva o pipettando o immersione.</li>
</ol>3. preparare la soluzione di colorazione
<ol><li>I reagenti insieme vortice per la colorazione di attività della deidrogenasi del lattato (Tris 50 mM a pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM fenazina methosulfate (PMS), cloruro di nitrotetrazolium blu 600 µM e lattato di 30 mM) in un tubo di dimensione appropriate a seconda della quantità di macchiatura soluzione necessaria. Nota: 1 mL è sufficiente per coprire completamente una diapositiva.</li>
	<li>Preparare una seconda soluzione in cui tutti i reagenti sono presenti tranne NAD. Preparare una terza soluzione in cui tutti i reagenti sono presenti ad eccezione del lattato.</li>
</ol>4. Incubare i vetrini nella soluzione di colorazione
<ol><li>Delicatamente dispensare la soluzione colorante o soluzioni per il controllo sui vetrini preparati che coprono la sezione nella sua interezza (1 mL è sufficiente per una diapositiva). Se più diapositive vengono elaborati insieme, immergere tutti i vetrini nella soluzione colorante allo stesso tempo (assicurarsi che il contenitore è una soluzione abbastanza per coprire completamente la sezione di tessuto).</li>
	<li>Incubare i vetrini in un ambiente umidificato a 37 ° C al buio. Se la soluzione di colorazione è in cima alla diapositiva, è possibile collocare il vetrino in un ambiente umidificato per evitare l'evaporazione.</li>
</ol>5. monitorare le diapositive
<ol><li>Monitorare la conversione della soluzione colorante da chiaro a blu mediante ispezione visiva. Quando i campioni hanno raggiunto il livello desiderato di azzurro, arrestare la reazione rimuovendo la soluzione colorante. Nota: Per la pelle, 10 min è sufficiente. Il tempo dipenderà l'organo e l'attività enzimatica.</li>
	<li>Sciacquare i vetrini con tamponato fosfato salino pipettando (1 mL è sufficiente per ogni diapositiva) o immersione. Nota: Eventuali campioni che saranno confrontati a vicenda devono essere mantenuti nella soluzione colorante per la stessa quantità di tempo.</li>
</ol>6. colorante di contrasto e montare
<ol><li>Dispensare una colorazione sui vetrini quando le diapositive hanno raggiunto un livello adeguato di azzurro. Nota: Coloranti che trasformano i nuclei rossi o verdi fornirà buon contrasto con il blu creato dal formazano precipitante.</li>
	<li>Montare con acquoso o non acquoso montaggio medio22. Una-tre gocce (40-50 µ l) di mezzo di montaggio è sufficiente a seconda delle dimensioni del vetrino coprioggetti.</li>
</ol>7. immagini diapositive e quantificare
<ol><li>Diapositive di immagini al microscopio ottico. Prendere fotografie di sperimentale e campioni di controllo e tutti i controlli negativi a 10x, 20x e 40x.</li>
	<li>Determinare l'intensità della macchia blu in diverse regioni con software di analisi di immagine.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).</li><li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects.">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li><li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues.">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells.">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments.">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482 (2016).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer:+A+systematic+review+with+meta-analysis.">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li><li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies.">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li><li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A:+Therapeutic+potential+in+brain+tumor.">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li><li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+gene:+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure,+function+and+regulation.">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li><li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase.">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li><li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation.">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li><li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism.">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH/NAD(+)+redox+homeostasis+in+cancer+cells.">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer.">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li><li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity.">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li><li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+[1-(1)(3)C]pyruvate.">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).</li><li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation.">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy.">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.

Il metodo qui descritto può essere utilizzato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato o altri enzimi metabolici che generano NADH o NADPH, in diversi tipi cellulari all'interno di un tessuto o di diverse porzioni di un tessuto nel corso del tempo. Lattato deidrogenasi è un enzima importante per la comprensione della biologia delle cellule staminali e tumori, e la capacità di monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato in singole celle rischia di fornire le comprensioni importanti nella funzione di questo enzima.
Uno importante vantaggio di questo protocollo rispetto ad altre metodologie che è la capacità di monitorare l'attività enzimatica, anziché solo abbondanza di proteine, può causare più conclusivi informazioni su non solo dove sono gli enzimi della deidrogenasi del lattato presente, ma dove sono in realtà funzionale. Modo che il livello di una proteina selezionato, per esempio, un indicatore di lineage delle cellule, è determinato negli stessi campioni del tessuto come attività della deidrogenasi del lattato, l'approccio descritto qui può essere abbinato a immunohistochemistry. Rispetto agli approcci basati su MRI per monitoraggio attività della deidrogenasi del lattato, il protocollo fornito ha il vantaggio che può fornire una maggiore risoluzione spaziale e contribuire a determinare le cellule specifiche all'interno di un tessuto che hanno alta attività enzimatica . Rispetto agli approcci al metabolismo di mapping basato su substrati fluorogenici, rilevando il segnale con il protocollo descritto non è limitato da autofluorescence1. Miller e co-autori eseguita una simile analisi della dipendenza dal tempo e dipendenza di substrato degli enzimi differenti cinque monitorando conversione a formazano7. Le reazioni sono state scoperte a seguire stechiometrici principi di cinetica enzimatica. Miller e coautori enzimi mitocondriali distinti da non-mitocondriale enzimi di co-localizzazione con colorazione mitocondriale7. Hanno usato 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium cloruro (CTC) come un reagente di rivelazione seguito da microscopia confocale per co-localizzazione subcellulare analisi7.
Il metodo descritto presenta svantaggi pure. Mentre gli approcci basati su MRI possono essere utilizzati negli organismi viventi, l'approccio descritto richiede tessuto fresco o congelato. Tessuti congelati sono adatti solo per pochi mesi perché l'attività degli enzimi degradano nel tempo, anche quando congelati. Inoltre, poiché il substrato viene fornito in eccesso, l'approccio fornisce informazioni su "potenziale attività" supponendo che il substrato sia presente. Se i livelli del substrato sono limitanti, la distribuzione di attività osservata con questo dosaggio può derogare la quantità di attività che si verifica fisiologicamente. Inoltre, se esistono diverse isoforme dell'enzima stesso che svolgono la stessa attività enzimatica, il metodo presentato qui non è in grado di distinguere tra di loro. Per esempio, il metodo presentato non può distinguere tra l'attività di LDHA contro LDHB. Un approccio all'indirizzo che questo problema sarebbe quella di utilizzare geneticamente ingegnerizzati topi in cui una singolo enzima isoforma è geneticamente inattivata.
Abbiamo sperimentato con PMS, un trasportatore di elettrone fotochimicamente stabili che media il trasferimento di elettroni tra NADH e tetrazolium coloranti23. Mentre alcuni scienziati hanno riferito che il PMS inibisce l'attività del glucosio 6-fosfato deidrogenasi e trovato PMS scortese5, abbiamo trovato il PMS per essere prezioso per la localizzazione dell'enzima e includerlo nel nostro protocollo. Alcuni altri autori hanno segnalato usando alcool polivinilico per limitare la diffusione di glucosio 6-fosfato deidrogenasi enzima1. Nei nostri esperimenti, abbiamo trovato non l'alcool polivinilico per essere disponibile ed eliminato.
A pochi passi sono fondamentali per il successo della colorazione. Una questione importante è garantire che i campioni di tessuto sono posizionati correttamente nella cyromolds. Sezioni della pelle è opportuno piatta in modo che fette tagliate attraverso la pelle. Inoltre, se più sezioni sono di essere preparati, è ideale se sono incorporati all'interno del cryomold stesso modo essi possono essere affettati insieme nella stessa diapositiva. Questo vi aiuterà a eliminare la variazione a causa dello spessore della diapositiva che è tagliata con il criostato. È inoltre importante garantire che il tessuto conserva ancora l'attività enzimatica.
Il momento migliore per terminare la reazione dovrebbe essere determinato empiricamente. È necessario monitorare attentamente le diapositive durante il periodo di incubazione e determinare il momento opportuno per aggiungere colorante di contrasto e montare le diapositive in base all'intensità della macchia blu. Se i campioni sono troppo leggermente macchiati, non sarà possibile determinare dove si trova l'attività. Se i campioni sono overstained, il formazano precipitato può diffondersi, rendendolo difficile da accertare le aree specifiche che sono stati originariamente elevate nell'attività.
Prevediamo che questo protocollo sarà prezioso per gli scienziati con una vasta gamma di domande sul ruolo del metabolismo. Le applicazioni includono co-macchiatura per attività metabolica e gli indicatori delle cellule lignaggio o marcatori di proliferazione, valutare i contributi di diversi enzimi con modelli genetici, valutare la localizzazione subcellulare di attività enzimatica, monitoraggio attività enzimatica nel tessuto malato o durante lo sviluppo.

Capire le posizioni all'interno dei tessuti in cui gli enzimi hanno attività alta o bassa è essenziale per la fisiologia e sviluppo di comprensione. Livelli di trascrizione o di proteine sono spesso utilizzati come surrogati per l'attività enzimatica. Mentre tali studi possono essere ben informativi, non forniscono informazioni che possono essere critici per determinare l'attività di un enzima, quali modificazioni post-traduzionali, la presenza di complessi proteici, o localizzazione subcellulare dell'enzima. Quando l'attività enzimatica è misurata direttamente, spesso è monitorato nei lisati di omogeneizzato proteine che non contengono informazioni su singole celle all'interno della miscela o la distribuzione spaziale delle cellule con alta o bassa attività all'interno di un tessuto.
Forniamo qui un protocollo dettagliato per mappare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica all'interno di un campione di tessuto. La metodologia si basa su precedenti studi che dimostrano che sali di tetrazolio possono essere utilizzati per localizzare l'attività della deidrogenasi, riduttasi e ossidasi in tessuto congelato1. Con questi metodi, un formazan insolubili in acqua si forma quando protoni vengono trasferiti a un tetrazolium sale2,3. Glucosio-6-fosfato deidrogenasi genera NADPH e un protone ed è stata rilevata con attività di tetrazolium. Glucosio-6-fosfato deidrogenasi è stata monitorata epatociti Platichthys flesus4, nelle cellule alveolari di tipo 2 del polmoni5 e nefroni del rene5. Sali di tetrazolio sono stati utilizzati anche per monitorare l'attività di transketolase in tessuto congelato6. Un approccio simile è stato recentemente utilizzato per monitorare l'attività della deidrogenasi multiple nel tessuto stesso su diapositive adiacenti7.
Descriviamo qui un metodo per utilizzare sali di tetrazolio per monitorare la distribuzione spaziale delle attività della deidrogenasi del lattato (Figura 1). Lattato deidrogenasi può convertire piruvato generato da glicolisi di lattato e la reazione inversa. L'attività della deidrogenasi del lattato è di conseguenza un determinante importante dell'entrata di piruvato nel ciclo dell'acido tricarbossilico contro sua secrezione come lattato. Livelli di lattato nel sangue sono spesso utilizzati per diagnosticare una gamma di malattie, compreso cancro8,9,10, perché può segnalare che la malattia o infortunio ha danneggiato le cellule e l'enzima è stato rilasciato.
Ci sono quattro geni di lattato deidrogenasi: LDHA, LDHB, LDHC e LDHD11. LDHA e LDHB sono pensati per risultare dalla duplicazione di un gene di iniziali LDHA12. LDH è attivo come un tetramero e LDHA e LDHB possono formare homotetramers ed eterotetrameri con a vicenda. LDHA è segnalato per avere maggiore affinità per piruvato, mentre LDHB è segnalato per avere maggiore affinità per lattato e preferenzialmente convertire lattato in piruvato13. Il promotore LDHA contiene siti di legame per fattori di trascrizione HIF1α, cMYC e FOXM111. Inoltre, come molti altri enzimi glicolitici14,15, LDH può essere modificato da modificazioni post-traduzionali. Ricevitore di fattore di crescita del fibroblasto 1 può fosforilare LDHA Y10, che promuove la formazione di tetramero, o Y83, che promuove il NADH substrato associazione16. LDHA può anche essere acetilata17. Per questi motivi, una comprensione completa delle attività LDH richiede un monitoraggio non solo i livelli di proteina LDH, ma l'attività dell'enzima pure.
Oltre al metodo che presentiamo qui, altri approcci sono stati utilizzati per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato. L'attività della deidrogenasi del lattato può essere monitorata spettrofotometricamente a lisato proteico omogeneizzato. La generazione del NADH come lattato viene convertito in piruvato può essere misurata basata su assorbanza a 340 nm, mentre la scomparsa del NADH può essere monitorata come piruvato viene convertito in lattato18. L'attività della deidrogenasi del lattato è stata monitorata anche con risonanza magnetica (MRI). 13 C-piruvato può essere somministrato e la conversione di piruvato a lattato possa essere monitorata come il rapporto di [1 -13C] lattato / [1 -13C] piruvato. Elevati coefficienti di [1 -13C] lattato / [1 -13C] piruvato sono stati osservati in cancro del tessuto19. Mentre gli approcci basati su MRI possono fornire informazioni sulle attività della deidrogenasi del lattato nel normale e tessuti malattia, le metodologie non hanno la risoluzione necessaria per determinare il livello di attività in celle specifiche. La metodologia fornita qui può fornire informazioni sull'attività della deidrogenasi del lattato in aree di tessuto e anche in singole cellule.
Usando in situ analisi di attività, abbiamo trovato che l'attività della deidrogenasi del lattato è ricco di cellule staminali del follicolo pilifero di mouse pelle20. Abbiamo anche usato il metodo per monitorare l'attività del lattato deidrogenasi in cellule staminali embrionali coltivate e l'attività è più alto nelle cellule staminali dello strato dell'alimentatore. Infine, abbiamo monitorato l'attività del lattato deidrogenasi nell'aorta del mouse fresco e osservato la macchiatura in cellule di muscolo liscio. Descriviamo qui un protocollo dettagliato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato nella pelle del topo congelati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:312px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;">For collecting skin from euthanized mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9511236</td>
			<td style="width:217px;">For freezing mouse skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9638938</td>
			<td style="width:217px;">For mounting cryomolds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">07-210-106</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polysine Adhesion Slide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-545-78</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">4% formalin</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;">Dilluted in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">vortex</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris base</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NAD</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N7004</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P9625</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Nitrotetrazolium blue chloride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N6876</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lithium L-lactate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">L2250</td>
			<td style="width:217px;">Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">37&#176;C incubator (or tissue culture incubator)</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Braziliant! Counter stain</td>
			<td style="width:164px;">Anatech</td>
			<td style="width:121px;">861</td>
			<td style="width:217px;">Counter stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:164px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:121px;">H-5000&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Cover slips for slides</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-544D</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

Mappatura attività enzimatica nello spazio e nel tempo è fondamentale per comprendere le basi molecolari del comportamento delle cellule nel tessuto normale e malattia. Le analisi in situ attività metabolica possono fornire informazioni sulla distribuzione spaziale delle attività metabolica all'interno di un tessuto. Forniamo qui un protocollo dettagliato per monitorare l'attività dell'enzima lattato deidrogenasi direttamente nei campioni di tessuto. Lattato deidrogenasi è un determinante importante di se consumato glucosio verrà convertito in energia mediante glicolisi aerobica o anaerobica. Una soluzione contenente lattato e NAD è fornita di una sezione di tessuto congelato. Cellule con attività alto lattato deidrogenasi converte il lattato fornito a piruvato, mentre convertendo simultaneamente fornito nicotinamide adenina dinucleotide (NAD) a NADH e un protone, che può essere rilevato sulla base della riduzione di nitrotetrazolium blu di formazan, che è visualizzato come un precipitato blu. Descriviamo un protocollo dettagliato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato nella pelle del topo. Applicazione del presente protocollo, abbiamo trovato che l'attività della deidrogenasi del lattato è alta nelle cellule staminali del follicolo pilifero quiescente all'interno della pelle. Applicazione del protocollo di cellule staminali embrionali di topo coltivate ha rivelato la macchiatura più alto in cellule staminali embrionali coltivate di fibroblasti embrionali del mouse. Analisi dell'aorta del mouse appena isolato ha rivelato la macchiatura in cellule di muscolo liscio perpendicolare all'aorta. La metodologia fornita può essere utilizzata per mappare spazialmente l'attività degli enzimi che generano un protone nel tessuto fresco o congelato.

Precedentemente abbiamo segnalato risultati per analisi di attività in situ in mouse pelle20. Come mostrato nella Figura 3, abbiamo osservato che alti livelli di attività della deidrogenasi del lattato in cellule staminali del follicolo pilifero, alla base del follicolo di capelli quando le procedure descritte sopra sono stati seguiti. Questi risultati sono stati confermati da celle attivate la fluorescenza ordinamento della pelle per le cellule staminali del follicolo pilifero e conferma attività alto lattato deidrogenasi nel compartimento di cellule staminali con analisi di attività sulle cellule ordinate.
Basato sui nostri risultati che le cellule staminali del follicolo pilifero hanno attività alto lattato deidrogenasi, abbiamo esteso i nostri studi delle cellule staminali embrionali coltivate. Fibroblasti embrionali del mouse che serve come uno strato dell'alimentatore sono stati analizzati da solo o in presenza di cellule staminali embrionali. Per analizzare le cellule coltivate, il mezzo è stato aspirato, e le cellule erano brevemente fissi e incubate con lattato deidrogenasi soluzione di colorazione come descritto sopra. Abbiamo osservato alto lattato deidrogenasi attività nelle cellule staminali embrionali rispetto ai mouse fibroblasti embrionali (Figura 4).
Abbiamo anche applicato il protocollo di colorazione al tessuto di recente isolato. Aorte del mouse sono stati sezionati e affettati aperti. Le navi sono state aperte e immobilizzate affinché all'interno lumen di aorte era accessibile. I campioni sono stati incubati con soluzione salina bilanciata di Hank che contiene 0,5% Triton-X per 10 min, poi con la deidrogenasi del lattato soluzione per 10 min. lattato deidrogenasi macchiatura soluzione di colorazione è stato applicato al tessuto fresco. Dopo l'incubazione, le immagini sono state raccolte, mostrando la macchiatura in cellule di muscolo liscio (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig1.jpg"> Figura 1 : Attività chimica di lattato deidrogenasi e la relativa rilevazione. Lattato deidrogenasi converte lattato + NAD in piruvato + NADH + H+. Il protone che viene generato si ridurrà del nitroblue a formazano, che forma un precipitato blu. <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig2.jpg"> Figura 2 : Schematico di orientare la pelle del topo in cryomolds. Pelle del topo deve essere orientata all'interno di cryomolds modo che ogni taglio sezione conterrà una sezione trasversale di tutta la pelle dall'epidermide, derma, ipoderma e muscolo. <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig3.jpg"> Figura 3 : Deidrogenasi del lattato di colorazione della pelle del topo rivela ad alta attività nelle cellule staminali del follicolo pilifero. Pelle del topo è stata congelata nel cryomolds e incubata con lattato deidrogenasi macchiatura soluzione contengono lattato. L'attività della deidrogenasi del lattato era prominente nelle cellule staminali del follicolo pilifero. (A, B) Due immagini di analisi di attività della deidrogenasi del lattato di pelle del topo. (C, D) Due immagini del controllo colorazione con il lattato di substrato trattenuto. Barra della scala = 50 µm. <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig4.jpg"> Figura 4 : Attività della deidrogenasi del lattato elevato in cellule staminali embrionali di topo coltivate. Cellule staminali embrionali coltivati del topo coltivate su uno strato di alimentatore dei fibroblasti embrionali del mouse irradiati sono state analizzate per l'attività della deidrogenasi del lattato. Alta attività è stata osservata nelle cellule staminali rispetto ai fibroblasti. Fibroblasti embrionali del mouse ha mostrato i simili livelli di macchiatura con e senza irradiazione. Immagini sono state scattate con un obiettivo X 20. Barra della scala = 50 µm. (A, B, D, E) fibroblasti embrionali di topo e cellule staminali. (C, F) Fibroblasti embrionali del mouse da solo. (A-C) Immagini sono state scattate dopo 7 minuti di incubazione con la soluzione di macchiatura. (D-F) Immagini sono state scattate dopo 20 minuti di incubazione con la soluzione di macchiatura. <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig5.jpg"> Figura 5 : Attività della deidrogenasi del lattato elevato in cellule di muscolo liscio che circonda l'aorta del mouse. Aorte sono state isolate da topi euthanized. Vasi sono stati fissati per 2 minuti in 2% di paraformaldeide e lavato 3 x 10 minuti in 1 tampone fosfato x Salina. Le navi sono state incubate con soluzione salina bilanciata di Hank con 0,5% Triton-X e lavati 3 x 5 minuti in soluzione salina tamponata con fosfato. Deidrogenasi del lattato soluzione di colorazione è stato aggiunto e campioni sono stati incubati per 10 min a 37° C e lavato 3 x 5 min con soluzione tampone fosfato e 1x. I campioni sono stati quindi corretti per 1 ora a 2% paraformaldeide, lavato 3 x 5 min con 1x tampone fosfato salino ed imaged. (A) della deidrogenasi del lattato soluzione contenenti lattato. (B) della deidrogenasi del lattato soluzione senza lattato come controllo negativo. Per ogni sezione, c'è un'immagine ingrandimento in basso a sinistra e una zona designata è mostrata con maggiore ingrandimento sulla destra. (A, B) Soluzione completa del lattato deidrogenasi contenenti lattato è stata usata per la colorazione. B è che un'immagine ingrandita dell'area interessata in soluzione di lattato deidrogenasi di r. (C, D) di immagini senza lattato è stata utilizzata per la colorazione come controllo negativo. D è un'immagine ingrandita dell'area interessata in C. A e C sono state scattate con obiettivi X 20 (barra della scala = 50 µm) e B e D sono state scattate con un obiettivo 40x (barra della scala = 20 µm). <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Metabolismo di mappatura: Monitoraggio dell'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto

Descriviamo un protocollo per mappare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica per enzimi che generano nicotinatmide adenina dinucleotide fosfato (NAD + H + direttamente nei campioni di tessuto.

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

mapping-metabolism-monitoring-lactate-dehydrogenase-activity-directly

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K Views.  UCLA. Descriviamo un protocollo per mappare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica per enzimi che generano nicotinatmide adenina dinucleotide fosfato (NAD + H + direttamente nei campioni di tessuto.

Video: Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Ricerca

Biochimica

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Definizione attività di Chaperone Redox-regolati di Hsp33 e mappatura cambiamenti conformazionali su Hsp33 usando la spettrometria totale di scambio di idrogeno-deuterio

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine whether there is an imbalance in age-related energy metabolism between mitochondrial oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis. Here, we show the utilization of commercial colorimetric assay kits for lactate and pyruvate in the model organism C. elegans. Recently, the sensitivity and accuracy of the colorimetric/fluorimetric assay kits have been improved greatly by the research and development conducted by reagent manufacturers. The improved reagents have enabled the use of small-scale assays with a 96-well plate in C. elegans. In general, a fluorimetric assay is superior in sensitivity to a colorimetric assay; however, the colorimetric approach is more suitable for the use in common laboratories. Another important issue in these assays for quantitative determination is protein precipitation of homogenized C. elegans samples. In our protein precipitation method, common precipitants (e.g., trichloroacetic acid, perchloric acid and metaphosphoric acid) are used for sample preparation. A protein-free assay sample is prepared by directly adding cold precipitant (final concentration of 5%) during homogenization.

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe a modified small-scale extraction and colorimetric assays of lactate and pyruvate in the nematode C. elegans. When utilizing commercial assay kits, the technical development of their sensitivity and accuracy is important. Protein precipitation in extraction is the most critical step for the quantitative determination of intracellular metabolites.

Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Quantificazione di Hypopigmentation attività In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Misurare e interpretare i tassi di consumo di ossigeno in tutto Vola testa segmenti

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

Entità DI legame SUMO (SUBE) come strumenti per l'arricchimento, l'isolamento, l'identificazione e la caratterizzazione del proteoma SUMO nel cancro al fegato

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is going to move beyond the laboratory and become a widespread and standard just in time manufacturing technology, we must understand the performance limits of these systems. Toward this question, we developed a robust protocol to quantify 40 compounds involved in glycolysis, the pentose phosphate pathway, the tricarboxylic acid cycle, energy metabolism and cofactor regeneration in CFPS reactions. The method uses internal standards tagged with 13C-aniline, while compounds in the sample are derivatized with 12C-aniline. The internal standards and sample were mixed and analyzed by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS). The co-elution of compounds eliminated ion suppression, allowing the accurate quantification of metabolite concentrations over 2-3 orders of magnitude where the average correlation coefficient was 0.988. Five of the forty compounds were untagged with aniline, however, they were still detected in the CFPS sample and quantified with a standard curve method. The chromatographic run takes approximately 10 min to complete. Taken together, we developed a fast, robust method to separate and accurately quantify 40 compounds involved in CFPS in a single LC/MS run. The method is a comprehensive and accurate approach to characterize cell-free metabolism, so that ultimately, we can understand and improve the yield, productivity and energy efficiency of cell-free systems.

Here, we present a robust protocol to quantify 40 compounds involved in central carbon and energy metabolism in cell-free protein synthesis reactions. The cell-free synthesis mixture is derivatized with aniline for effective separation using reversed-phase liquid chromatography and then quantified by mass spectrometry using isotopically labelled internal standards.

Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective denaturation of proteins from RNA, 3) ribonuclease inactivation, and 4) removal of contamination from DNA, proteins, and carbohydrates. However, it is very laborious to maintain the integrity of RNA when there are high levels of RNase in the tissue. Spontaneous autolysis makes it very difficult to extract RNA from pancreatic tissue without damaging it. Thus, a practical RNA extraction method is needed to maintain the integrity of pancreatic tissues during the extraction process. An experimental and comparative study of existing protocols was carried out by obtaining 20-30 mg of rat pancreatic tissues in less than 2 minutes and extracting the RNA. The results were assessed by electrophoresis. The experiments were carried out three times for generalization of the results. Immersing pancreatic tissue in RNA stabilization reagent at -80 &#176;C for 24 h yielded high integrity RNA, when the RNA extraction reagent was used as the reagent. The results obtained were comparable to the results obtained from commercial kits with spin column bindings.

The purity and integrity of the isolated RNA is a vital step in RNA dependent assays. Here, we present a practical, rapid, and inexpensive method to extract RNA from a small quantity of undamaged pancreatic tissue.

Estrazione rapida ed economica dell'RNA del tessuto pancreatico ratto

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains of &#945;1,4-linked glucose residues with branches introduced through the addition of &#945;1,6-linkages. Understanding how the synthesis and degradation of glycogen are regulated and how glycogen attains its characteristic branched structure requires the study of the enzymes of glycogen storage. However, the methods most commonly used to study these enzyme activities typically employ reagents or techniques that are not available to all investigators. Here, we discuss a battery of procedures that are technically simple, cost-effective, and yet still capable of providing valuable insight into the control of glycogen storage. The techniques require access to a spectrophotometer, operating in the range of 330 to 800 nm, and are described assuming that the users will employ disposable, plastic cuvettes. However, the procedures are readily scalable and can be modified for use in a microplate reader, allowing highly parallel analysis.

Techniques to measure the activity of key enzymes of glycogen metabolism are presented, using a simple spectrophotometer operating in the visible range.

Metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...