DOSTUM bir Parkinson İngiltere'de araştırma bursu (grant F1002) tarafından finanse edildi. Bu eser bir MRC yeni araştırmacı araştırma hibe tarafından (Bay/L010933/1) desteklenen bir durumdu ve PAL için ve BBSRC öğrencilik BB/M017222/1-JET tarafından Bay/N026004/1 MRC programı tarafından verin. 2014-15 kohort MPharm Bölüm 1 öğrencilerin üniversite okuma geribildirim ve giriş için bu pratik ve sonraki tabur ilk yinelemesi katılan için teşekkür ediyoruz.

Not: Aşağıdaki protokol iki saat (Tamamlanma sınıfının çalışma sayfalarının dahil) boyunca yapılacak bir amaca öğretim laboratuvarda geliştirilmiştir. Kasıtlı olarak deneysel merdiven were yerine birlikte enzim kinetiği (model verileri kullanarak bu ders kapsamında yürütülen); daha ayrıntılı bir analiz dışlamak için Ancak — tartışmada belirtildiği gibi — protokol zaman, imkanları ve öğrenci ilerilik düzeye bağlı olarak daha gelişmiş analizler için bir şablonu sağlar.
Güvenlik: Bu pratik iyi kimyasal laboratuvar uygulama (GCLP) kurallarına göre yapılmalıdır — sıkıya laboratuvar ceket, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman aşınmış her zaman laboratuvarda .
1. enzim ayıklanıyor
<ol><li>Bir laktaz enziminin bir harç ve havaneli kullanarak bir hatta toz için 200 mg içeren tablet, ezmek.</li>
	<li>Elde edilen toz "askıya alma" etiketli bir 15 mL tüp içine yerleştirin ve 10 mL 100 mM fosfat tamponlu tuz (PBS) resuspend.</li>
	<li>Enzim ayıklama en üst düzeye çıkarmak için 1 dakika için girdap.</li>
	<li>1 mL süspansiyon tortu katı parçacıklar bir 1,5 mL santrifüj tüpü ve 10.000 x g , 1 dk santrifüj içine aktarın.</li>
	<li>500 µL süpernatant, "Laktaz özü" etiketli bir temiz 1.5 mL tüp aktarın.</li>
</ol>2. gözlem kolorimetrik reaksiyon
<ol><li>Yer 390 µL 100 mm PBS 1,5 mL tüp içine "A tepki" etiketli.</li>
	<li>5 mM ONPG çözüm ve mix 100 µL de vortexing tarafından ekleyin. Dikkat: Bu pratik ortho kullanır-Nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) laktoz için bir yedek olarak. Bu yana ONPG fenolik bileşiktir, dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. ONPG ile cilde temas durumunda maruz kalan deri hemen yıkanmalıdır. Herhangi bir sıvı sıçraması hemen uygun atık akımına bertaraf edilecek kağıt havlu ile sildi.</li>
	<li>Tepki A tüp ve karışımı içine ekstresinin 10 µL de vortexing tarafından ekleyin.</li>
	<li>Reaksiyon karışımı 5 dakika boyunca gözlemlemek ve çözüme Renkölçer değişiklikleri not edin.</li>
</ol>3. ölçme enzim aktivitesi
<ol><li>İki 1,5 mL tüpler ayarla: bir "Tepki B", bir etiketli "Denetim" etiketli.</li>
	<li>100 mm PBS 390 µL tepki B tüp, 100 mm PBS denetim tüp için 400 µL ekleyin ve 5 mm ONPG 100 µL her tüp için ekleyin.</li>
	<li>İçeriği tarafından vortexing karıştırın.</li>
	<li>Laktaz ekstresinin 10 µL tepki B tüp eklemek, vortexing tarafından mix ve oda sıcaklığında 1 dk. için devam etmek tepki sağlar.</li>
	<li>1 dk. geçtikten sonra 1 M sodyum karbonat 500 µL böylece tepki sonlandırma pH artırarak Laktaz enzim inhibe her iki tüpler ekleyin.</li>
	<li>500 µL her tüpünden temiz spektrofotometre cuvettes aktarmak ve 420 absorbans ölçmek spektrofotometre kullanarak nm.</li>
	<li>Absorbans tepki B ve kontrol örnekleri için Not ve denetim değeri ONPG hidroliz etkin enzim huzurunda nedeniyle absorbans değişimi türetmek için tepki değerinden çıkarın.</li>
</ol>4. sıcaklık üzerindeki etkisi enzim aktivitesi
<ol><li>Üç kontrol tüpleri ve üç tepki tüpler madde 3 te açıklandığı gibi ayarlayın ve bunlar etiket "4 ° C", "Oda sıcaklığında" ve "37 ° C".</li>
	<li>Enzim ilavesi ayıklamak, buz, oda sıcaklığında, diğeri (önceden ısıtılmış su banyosunda) 37 ° C'de bir tüp kuluçkaya.</li>
	<li>Reaksiyonlar için 1 dk sürdürmek ve her tüp için 500 µL 1 M sodyum karbonat ekleyerek reaksiyon sona erdirmek izin.</li>
	<li>420 absorbans ölçmek için madde 3 te açıklandığı gibi her tüpün nm. Denetim değeri her durumda tepki değerinden çıkarılarak değerlerini kaydedin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red:+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates.">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li><li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression.">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li><li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+(lacZ)+beta-galactosidase.">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li><li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose.">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li><li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body.">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li><li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactose+intolerance.">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li><li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia.">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li><li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance.">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li><li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture.">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li><li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase.">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li><li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+the+Enzyme+Lactase.">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Detaylı bilgi ve anlayış enzim, Enzimatik reaksiyonları ve enzim kinetiği biyoloji, biyomedikal ve farmakoloji kapsayan konular geniş bir yelpazesi için gerekli. Yukarıda açıklanan protokol Laktaz enzim insan sağlığı için ilgili bir örnek olarak daha gelişmiş laboratuar tabanlı deneylerde kullanılan anahtar becerileri sağlayarak enzimatik reaksiyonlar gösteren için kullanır.
Bu iletişim kuralı kasıtlı olarak yorumlanabilir sonuçları kısa bir alanda üretmek için az veya hiç ıslak laboratuvar deneyimi mümkün, izin öğrenciler olarak sağlam olması için dizayn edilmiştir. Reading Üniversitesi School of eczane 2014/2015 öğretim yılında toplam 144 öğrenci 3, gruplar halinde düzenlenmiş, tüm grupları belli bir düzeyde laktaz tabletten enzimatik aktivite tespit etmek mümkün ile "laktaz ölçme" deneme yürüttü ayıklar.
Bu protokol önemli adımlar vardır. İlk olarak, ilk çıkarma verimli, daha sonraki analizler için yeterince etkin enzim solubilization izin önemlidir. Deneyim, ilk yıl lisans öğrencileri bu özetlenen iletişim kuralı takip ederek elde edebilirsiniz; Ancak bazı rehberlik laboratuvar göstericiler gelen bu noktada gerekli oldu. Bu çok aşikar bir nokta gibi görünüyor olsa da, bu protokol başarısında önemli bir faktör dikkatle birimleri ölçmek, doğru tüpler etiket ve yönergeleri izleyin yeteneğidir. Yeterlilik belirli bir düzeyde çok sayıda öğrenci, dikkatli izleme ve öğrencilerin onlar değilseniz durumunda yardım için sormak açık bir istek için kabul edilebilir ne yapacağımı sonraki en büyük başarılı bir tahlil olasılığını sağlar.
Öğrenci değerlendirme deneyler, yorum onların sonuçları ve arka plan bilgi/okuma bağlantı ders malzemesinden verilerden dikkat edilmesi gereken öğrenciler soran sınıfının çalışma sayfası (ek malzeme olarak kullanılabilir), veya daha fazla tarafından yürütülen olabilir ayrıntılı sınıf değerlendirmesi ile sağlanan modeli veri kinetik analizler için çalıştı ve değerlendirilmesi için izin dışarı.
Burada sunulan protokolü bir laktaz aktivitesi tahlil öğretim laboratuvar koşulları altında basit bir örneğidir ve bol bol fırsat daha gelişmiş analizler izin için deney karmaşıklığını artırmak için. Özellikle, sunulan Protokolü enzim kinetiği kavramı bir giriş sağlar ancak deneysel veriler kinetik analizi için izin vermez. Bu nedenle, biz açıklanan protokolü ile ilgilenen özel amaçları ve deneyler taahhüt öğrenci kohort yeteneklerini uygun şekilde adapte kesin detayları ile sınıflar için ilk bir şablon olarak tavsiye ederim. Genişletilmiş deneyler örnekler: tekrarlanan ölçümleri istatistiksel analizi, ile başlayan kinetik, veri çözümlemesi (Biyokimya öğrenciler/majors için uygun) izin vermek için farklı substrat konsantrasyonu kullanarak farklı sıcaklıklarda birkaç farklı tablet ve farklı her (kontrol tabletler, adli tıp öğrencileri/majors için uygun eklenmesiyle) enzim aktivitesinin değerlendirmek öğrenciler, ısı denatürasyon etki değerlendirme veya rekabeti taşıyan laktoz eklenmesi veya laktaz (Tablo 1) inhibitörleri deneyler. Detaylı bir protokol laktaz kinetik analizi için daha önce yayımlanmış12oldu.
Bu protokol önemli bir gücü bu Enzimologiya tıpta bir gerçek vaka çalışması ile Enzimologiya ve enzim kinetiği temel bir giriş birleştirir kaldı. Bu bu laboratuvar yapar deneme ilaç, eczane, biyomedikal Bilimler ve ilgili konuları öğrencilere belirli konu ile ilgili. Önemlisi, ciddi bir tıbbi durumun ve daha yaygın bir diyet sorunu laktoz katabolizma ile ilişkili olduğu gerçeğini çok çeşitli tıbbi ve etik sorunları ile öğrenciler yetiştirmek için fırsat sağlar. Bu gen terapisi ve genetik danışmanlık, hem de kullanımı ve Satılık tıbbi ilave için ilgili tartışmalar ilgili ve tıbbi durumlar için genetik test çevre sorunları içerebilir. Bir büyük protokolü çıkarma için kullanılan başlangıç malzeme nedeniyle enzim konsantrasyon kesin tahmini için izin değil kısıtlamadır. Bunun için hesap için bir değişiklik ancak, reaktif sınıf enzim tayini için kullanmak olacaktır. Önemlisi, bu da kinetik Laktaz enzim için daha kesin hesaplanması için sağlayacak.
Sonuç olarak, etkinliğin raporlaması laktaz bir öğretim laboratuvarda, ortamı bir sağlam, ilgi çekici ve ilginç giriş alanı enzim Biyoloji erken evre için üniversite öğrencileri niteliğindedir.

Özel bir tür yaşam vücudunda kimyasal reaksiyonlar için biyolojik katalizör görevi protein enzimlerdir organizmalar1. Enzimler, kaybı atılması ve organizmaların çalışması izin enerji sağlayan hayat için önemli bir eylemdir. Anlayış enzimler önemlidir, bu nedenle, hayat tam bir anlayış. Böyle bir bilgiye Tıp Bilimleri biyoloji Üniversitesi seviye derecesi programları, geniş bir yelpazesi için esastır. Kataliz ilkeleri enzim aktivitesinin teorik modeller arasında değişen ayrıntılı bir arka plan için öğrencilerin ders kullanarak ve malzeme okuma sağlanabilir iken, enzim reaksiyonları özelliklerini en iyi pratik deneyimi üzerinde eller tarafından anlaşılan enzimler eylem daha önce2gösterdi. Bu iletişim kuralı Laktaz enzim ile insan beslenme ve sağlık ile ilgili etkinlik örneği olarak kullanarak laboratuvar koşullarında enzim etkinliği ölçmek için deneysel paradigma izleyin kolay sağlar.
Glycosidic hidrolaz laktaz (AK 3.2.1.23/26) memeliler3için merkezi beslenme önemli bir enzimdir. Laktaz aktivitesi evrim son derece korunmuş ve enzimler beta galaktozidaz aileden gelen türetir — bir aile Homo sapiens (1 rakam, PDB 1JZ8)4' e Escherichia coli gelen mevcut. Daha sonra vücutta enerji üretmek için kullanılabilir kurucu yaşam bileşenlerinden içine laktoz dökümü izin rolüne laktaz bir insan beslenme ortamda kritik önemini kaynaklanmaktadır. Laktaz tromboksan hidroliz galaktoz ve glikoz (Şekil 2) serbest disaccharide laktoz glycosidic Bond5. Bu bol daha sonra öncelikle nesil adenozin trifosfat (ATP) üzerinden sitrik asit döngüsü ve Oksidatif fosforilasyon6için kullanılır. Yenidoğan ve bebek gelişimi sırasında laktaz son derece insan sindirim sistemi, anne sütü hangi laktoz birincil karbonhidrat bileşeni ve beslenme en önemli kaynaklarından biridir ilk yıllarında alınan laktoz aşağı kırma olarak ifade edilir 7. konjenital laktaz eksikliği (CID), nadir otozomal resesif koşulu laktaz gen (LCT) için Laktaz enzim8kodlama mutasyonlar neden laktaz tıbbi önemi vurgulanır. Yeni doğmuş bebekler suç araştırma departmanı ile çok az laktaz aktivitesi sergi, böylece onlar meme süt, süt ya da laktoz içeren formül başka tür beslenen olamaz.
Çocukluk çağında laktaz ifade normalde azalır; Ancak, bu azaltma sütten kesme takip coğrafi olarak, yaklaşık yetişkin enzim9ifade etmek dünya çapında devam eden % 35 ile değişir. Laktaz kalıcı bilinen laktaz, sürekli ifade bireyler süt ve süt ürünleri kaynakları bir dizi sindirmek devam etmek izin verir. Diğer taraftan, laktaz ifade kaybı laktoz intoleransı, olarak da bilinen yetişkin tipi hypolactasia (ATH), laktoz gut yıkmak için bir yetersizlik nedeniyle yol açabilir. ATH bir yapı tarafından yukarı laktoz laktoz gıda ürünleri içeren sindirim takip kolon ile karakterizedir. Kolon, bağırsak mikrobiyal fauna hidrojen, metan ve karbon dioksit gibi gazlar serbest tarafından birikmiş laktoz fermente. Laktaz enzim eksiklikleri ile bireylerde bu gazların üretimi teşvik abdominal şişkinlik, artan şişkinlik, ağrı, bulantı ve borborygmi (karın guruldama)7. Laktoz sindirim sistemi içinde daha yüksek düzeyde de gevşek dışkı neden olabilir.
LCT gen ekspresyonu kontrolünü yakındaki MCM6 gen intron içinde bulunan polimorfizmleri tarafından modüle. Laktaz sürekli ifade olan bireyler böylece normal sütten kesme sırasında LCT transkripsiyon aşağı karşılayan güçlü distal arttırıcılar LCT gen ifade olarak işlev polimorfizmleri taşımak ve sonuç olarak yetişkinlik3ifadede laktaz sürdürülmesi. Olumlu evcilleştirme, sığır ve deve Orta Doğu'daki aşağıdaki beş bin yıl önce seçilmiştir için önerilen artırıcı polimorfizmleri9,10.
ATH--dan kaynaklanan belirtiler laktoz alımı, örneğin diyet süt ürünleri kaldırarak azaltarak yönetilebilir. ATH için alternatif bir yaklaşım ve CID için tercih edilen yaklaşım laktaz takviyeleri, eczanelerden yaygın olarak kullanılan kullanmaktır. Bu takviyeleri laktaz kaynakları, mantar ve bakteri, ile çekilen veya gıda içeren laktoz eklenen bir sıvı veya hap tabanlı form dahil olmak üzere çeşitli izole sağlar. Ek laktoz mevcut gıda glikoz ve galaktoz ürünleri, böylece kendi emilimi erişimine izin verme ve sindirilmemiş laktoz substrat gut birikimi engelleyen bir kısmı hidrolize.
Laktaz takviyeleri diyet bir yardım olarak kullanmak dayanarak, biz ilk yıl Biyomedikal Bilim veya eczane öğrenciler için uygun bir basit Enzimologiya laboratuvar deneyi geliştirdik. Bu laboratuvar deneyi, piyasada bulunan laktaz takviyeleri ve kullanımları ortho yararlanır-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) ( laktaz tarafından bölünme glycosidic tahvil ölçmek için kolorimetrik bir bitiş noktası sağlamak için Şekil 3)11. ONPG davranır laktaz için yapay bir substrat olan bu enzim tarafından hidroliz tabi D-galaktoz ve Orto-nitrophenol üretir. İkinci ürün bir dalga boyu 420, ışık emici sarı bir renge sahiptir nm. 420 nm şu absorbans herhangi bir değişiklik miktarının tarafından ONPG maruz kalma laktaz, bu enzim aktivitesini tahmin etmek mümkündür. Bu laboratuvar deneyi enzimatik hidrolaz etkinlik gösterimini sağlar. Ek çoğaltır bina ve farklı koşullarda deneyleri yürüten, enzim kinetiği, değerli bir gerçek hayattan örnek eylem insan sağlığı için ilgili enzimlerin sağlayan daha gelişmiş analiz dahil etmek mümkündür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lactase tablet</td>
			<td style="width:71px;">Lamberts</td>
			<td style="width:119px;">8511-60</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Phosphate buffered saline (powdered)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">ONPG</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N1127</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium Carbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">451614</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">De-ionized water</td>
			<td style="width:71px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pestle and mortar</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Jenway 6315</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pipettes</td>
			<td style="width:71px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">15 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td style="width:71px;">Jenway</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Vortex genie 2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Water bath</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Weighing scales</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab

Enzimlerin çalışma şeklini anlamak ve bu gerçek hayattan örnekler için ilgili biyolojik ve Biyomedikal Bilimleri lisans dereceleri geniş bir yelpazesi için önemlidir. Bu takip edilmesi kolay iletişim kuralı ilk yıl lisans eczane öğrenciler için geliştirilmiş ve enzim analizi için enzim reaksiyonları ve analitik işlemleri giriş seviyesi bir giriş sağlar. Bu piyasada bulunan enzim insan hastalık/ilaç uygulama için ilgili bir örnek gösterir gibi seçim laktaz, enzimdir. Laktaz besin takviyesi tabletler ayıklanır ve laktaz için yapay bir substrat hidroliz dayanan kolorimetrik bir tahlil kullanarak değerlendirildi (ortho-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside, ONPG). Orto-nitrophenol ONPG hydrolytic bölünme laktaz tarafından takip sürümü değişiklik 420 absorbans ile ölçülen nm ve sıcaklık etkisi enzimatik reaksiyon reaksiyon buz, oda sıcaklığında ve 37 gerçekleştirerek değerlendirilir ° C. Daha gelişmiş analiz enzim etkinliği farklı koşullar altında değerlendirilmesi ve farklı reaktifler kullanarak bu protokolü kullanarak uygulanabilir.

İletişim kuralı Bölüm 2 için temsilcisi sonuçları Şekil 4Aiçinde gösterilir. Serbest ONPG hidrolize olarak laktaz tablet özü içeren tepki çözüm sarı döner iken Laktaz enzim, yokluğunda denetim tepki açık kalır Orto- nitrophenol. Şekil 4B rasgele birimleri iletişim kuralı, aşağıdaki analiz spektrofotometre kullanarak örnekleri bölüm 4'ten kullanarak miktar gösterir. Reaksiyon 37 ° C'de yürütülürken Orto-nitrophenol reaksiyon buza inkübe zaman en düşük ve en yüksek yapımıdır
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg"> Resim 1 : E. coli beta galaktozidaz. (A)beta-galaktozidaz aktif tetrameric yapısı karmaşık gösterilen Escherichia coli, gelen kristal yapısı. (B) Allolactose (kırmızı ile gösterilen) beta galaktozidaz aktif sitesine bağlanır. PDB 1JZ84oluşturulan görüntüler. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg"> Resim 2 : Laktaz enzim eylem. Laktoz laktaz beta-D-galaktoz ve beta-D-glukoz üretmek tarafından hidroliz. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg"> Şekil 3 : Hidroliz, Orto-nitrophenol - Beta -D-galactopyranoside. ONPG hidroliz beta-D-galaktoz ve Ortopedi-(sarı renkte olan) 420 absorbans ölçümü tarafından tahmin laktaz faaliyet izin nitrophenol, üretmeye laktaz tarafından nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg"> Şekil 4 : ONPG hidroliz. Denetim ve tepki tüpler(a)ve Bölüm 4 Protokolü'nün temsilcisi verileri gösteren ONPG hidroliz temsilcisi sonuçlarını, kaydedilen ham absorbans 420 rasgele daxilində gösteren sınıfındaki sayfalarındaki nm, arka plan için düzeltilmiş ve üç farklı sıcaklıklarda (B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Deneysel durumu</td>
			<td>Deneysel değişkenleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sıcaklık</td>
			<td>0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Substrat konsantrasyonu</td>
			<td>0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rekabetçi inhibisyon</td>
			<td>5 mM ONPG artı 0 mM, 1 mM, 5 mM veya 10 mM laktoz</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zaman bağımlılığı</td>
			<td>0 s, 15 s, 30 s, 1 dk, 5 dk, 10 min, 20 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isı denatürasyon</td>
			<td>Laktaz özü ile 100 ° C arasında 10 dk önceden tahlil için ısıtmalı</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: deneysel durumu genişletilmiş potansiyel. Laktaz biyoloji belirli yönlerini araştırıyor nüsha gerçekleştirilebilmesi için genişletilmiş deneyler önerdi.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab at JoVE.com

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Laktaz enzim aktivitesinin disaccharide laktoz katabolik işleme için gereklidir. Burada, diyet takviyeleri bulunan laktaz aktivitesi kolorimetrik bir tahlil kullanılarak denenecektir. Bu deneysel bir platformla laktaz ve enzim kinetiği etkinliğini anlamak için öğrencilere sağlar.

Laktaz enzim etkinliğin ölçülmesi öğretim laboratuarında

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

measuring-lactase-enzymatic-activity-in-the-teaching-lab

Nanyang Technological University

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Analytical Chemistry

Anatomy and Physiology

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Fundamentals of Chemistry

Energy and Catalysis

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

112.7K Görüntüleme.  University of Reading. Laktaz enzim aktivitesinin disaccharide laktoz katabolik işleme için gereklidir. Burada, diyet takviyeleri bulunan laktaz aktivitesi kolorimetrik bir tahlil kullanılarak denenecektir. Bu deneysel bir platformla laktaz ve enzim kinetiği etkinliğini anlamak için öğrencilere sağlar.

Video: Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

Zebra balığı Lens Nakli ve Göz Mutants Analizi Uygulaması

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Biyoloji

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Hydra Glutatyon kaynaklı Besleme Tepki Ölçüm

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Larvaların Faaliyet Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the mouse provides great potential to explore cardiac function at the molecular level. The mouse&#39;s small size does present some challenges in regards to performing detailed cardiac phenotyping. Miniaturization and other advancements in technology have made many methods of cardiac assessment possible in the mouse. Of these, the simultaneous collection of pressure and volume data provides a detailed picture of cardiac function that is not available through any other modality. Here a detailed procedure for the collection of pressure-volume loop data is described. Included is a discussion of the principles underlying the measurements and the potential sources of error. Anesthetic management and surgical approaches are discussed in great detail as they are both critical to obtaining high quality hemodynamic measurements. The principles of hemodynamic protocol development and relevant aspects of data analysis are also addressed.

This manuscript describes a detailed protocol for the collection of pressure-volume data from the mouse.

Fare Basınç Hacim Döngüler Ölçme

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the ...