Bu çalışmada, NINR (F32NR013611) finansal destek aldı. Ayrıca, kabul ve AnalyzeSkeleton(2D/3D) ve FracLac geliştiriciler teşekkür etmek istiyoruz (Arganda Carreras vd ve Karperien vd., sırasıyla) hangi burada açıklanan analiz mümkün olmazdı olmadan.

Tüm deneyler tarafından onaylanmış ve Arizona Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanmak Komitesi ve bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı için NIH kurallar tarafından kurulan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen. Bakım hayvan ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için çekildi. Ötanazi yöntemleri için onaylanmış bir protokol according ve servikal işten çıkarma isoflurane anestezi altında oluşur.
1. doku hazırlık
Not: microglia morfoloji Analizi hücre morfolojisi korumak için sabit, cryoprotected doku örnekleri üzerinde yürütmek. Birini hazırlamak ve doğrudan sabit doku floresans IHC için dilim için standart bir protokoldür.
<ol><li>Fare ya da sıçan beyin euthanized bir hayvandan istenen deneme sonra ve bir Standart laboratuvar protokolüne göre kaldırın. 5 mL 24 h 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde çözüm de içeren bir 10 mL flakon beyin yerleştirin Sonra durulama ve 5-10 mL % 30 sükroz fosfat yerine çözüm (PBS, 0.01 M) için 72 h 4 ° C'de arabelleğe alınmış Bir microtome ile kesit bütün beyin doku cryostat ile kesit kadar-80 ° C'de veya 4 ° C'de saklayabilirsiniz. Not: Bu protokol henüz parafin gömülü dokudan dilimlenmiş doku kullanarak test edilmemiştir.</li>
	<li>Bölüm beyin dokusu istenen bölüm kalınlığı ve bir cryoprotection çözüm (50 mM PBS, etilen glikol, gliserol) ya bir cryostat ya da microtome ve mağaza serbest yüzer bölümlerinde-20 ° C'de kullanarak Yönlendirme Not: Bu protokol başarıyla 50 µm için 200 µm arasında değişen kalınlıkta, koronal doku bölümlerinde yapılmıştır. Doku bölümleri daha az 50 µm microglia süreçler, kalın doku bölümlerde tam yayılımı yakalamak değil daha IHC boyama doku içine antikor penetrasyon nedeniyle kusurlu olabilir. Doku ya kesitli bir koronal veya sagittal yönlendirme olabilir ve bu seçim belirlenmesi için deneysel hedef ve beyin region(s) üzerinde bağlıdır.</li>
</ol>2. immünhistokimya
Not: Floresan veya 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) IHC iskelet ve Fraktal analiz yöntemleri uygulanabilir. Aşağıda bir standart floresan IHC protokolüdür ve gerektiği gibi yerine olabilir. Floresans IHC DAB IHC karşılaştırıldığında hücre süreçlerin üstün görselleştirme verir.
<ol><li>Doku bölümler 4 mL Cam şişe (ilâ 15 fare beyin bölümleri/flakon) yerleştirin ve 1 mL solüsyon kadar % 10 at serum, PBS (0.01 M), %0,5 Triton, 1 h için (23 ° C) Oda sıcaklığında %0,04 NaN3 içeren ile kuluçkaya.</li>
	<li>Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>1 mL içeren PBS (0.01 M), %0,5 Triton, %0,04 NaN3ve (NaN3 etkinliğini korumak için) kaplı çözeltisi içinde 72 h için oda sıcaklığında birincil antikor (Iba1, 1:1, 000) ile kuluçkaya.</li>
	<li>Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>4 h 1 mL içeren PBS (0.01 M), %0,5 Triton, %0,04 NaN3 çözeltisi içinde için oda sıcaklığında kapalı ikincil antikoru (Anti-tavşan 488, 1:250) ile kuluçkaya
</li>
	<li>Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Beyin dokusu bölümler (sayı ve tercihine göre yönlendirme) subbed slaytlara monte, bir yumuşak-set Montaj araç slayta uygulamak ve coverslip doku yerleştirin. 4 ° C'de slaytları depolama Not: 1,5 cam coverslip kalınlığı confocal görüntüleme için gereklidir. Yumuşak-set bir tercih edilen montaj orta yüksek viskozite doku sıkıştırmak değil ve en iyi zaman hard-set montaj medyaya göre morfolojisi korur çünkü.</li>
</ol>3. görüntüleme
<ol><li>Iba1 pozitif hücrelerinin beyin doku kısmındaki bir 20 X objektif veya daha büyük kullanarak bir z-yığın alma yeteneği vardır alan parlak veya confocal mikroskop kullanarak görüntü. Not: düşsel parametreleri ve yazılım kurulumu tüm photomicrograph toplama bir deneyde sabit olması gerekir. Mükemmel süreç detay bir 40 X veya 63 X objektif kullanarak elde edilir. Burada tüm bir photomicrograph veya bir çok hücreli yatırım getirisi daha büyük bir photomicrograph içinde açıklanan iskelet çözümleme protokolü uygulamak mümkündür.<ol>
<li>8-bit görüntüleri elde etmek belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı için özel uygun yazılım ayarları kullanarak. Not: Dosyaları dönüştürme 8-bit sonrası satın alma için veri toplama bozabilir.</li>
		<li>En az bir 30 µm z-deste belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı için özel uygun yazılım ayarları kullanarak görüntüleri 2 µm aralığını en fazla ile kazanmak. Not: Mikroskop ve yazılım bir X, Y ve Z eksenindeki resim alma için izin vermelisiniz. Bir z-yığın artırılabilir ve aralığı ek microglia ayrıntı sağlamak için azalabilir. Buna karşılık, saat görüntüleme artacaktır. Nyquist örnekleme floresan mikroskopi için mümkün olduğunda kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TIF dosyaları olarak ya da belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı tarafından gerekli tüm dosyaları kaydedin.</li>
	<li>Açık belgili tanımlık TIF eğe içinde ImageJ ve görüntü tıklayarak kanalları ayırmak için araç çubuğunu kullanın | Renk | Split kanallarıve görüntü tıklayarak görüntüleri yığını | Yığınlar | Proje x | Maksimum yoğunluk projeksiyon uygun olduğunda. .Tif dosyaları olarak kaydedin.</li>
</ol>4. iskelet Analizi
<ol><li>Download FIJI ya da ImageJ gelen < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. Bireysel eklentileri AnalyzeSkeleton(2D/3D) üzerinden download < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>15 ve FracLac üzerinden download < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>16. Not: bir photomicrograph ikili bir skeletonized görüntüye dönüştürme tüm süreç az 1 dk sürer.</li>
	<li>Floresan photomicrograph kullanıyorsanız, görüntü 8 bit olduğundan emin olun ve en iyi tüm olumlu boyama görselleştirmek için gri tonlamaya dönüştürmek. Araç çubuğunu kullanın ve görüntü tıklayın | Arama tabloları | Greys. Kullanarak bir DAB alan parlak fotoğraf, ilk kullanımda FFT bant eklenti filtre ( süreci tıklatarak araç çubuğunu kullanarak | FFT | Bant Filtre) ve daha sonra gri tonlamaya dönüştürme. Not: Bu protokol, ImageJ varsayılan ayarları bir FFT bant filtre için yeterli (filtre) 40, hiçbir şerit bastırma 3 piksele kadar amaçlıdır. Bir FFT bant filtre uygulayarak görüntünün genel olarak daha büyük yönlerini koruyarak gürültü (küçük Özellikler) kaldırır. Bu özellikle parlak alan görüntülerde kullanışlıdır nerede böler ve çatlaklar doku arka plan olarak görünür ve böylece iskelet analiz18zorlaştırıyor.</li>
	<li>Parlaklığı ayarlayın ve görüntü çok karanlık ise kontrast ve microglia işlem görüntülenir. Araç çubuğunu kullanın ve görüntü tıklayın | Ayarlamak | Parlaklık/kontrast. Minimum veya maksimum kaydırıcıları, histogram ama hayır daha fazla kenarlarına kadar gerektiği gibi ayarlayın. Not: ImageJ, parlaklık ve kontrast piksel değerlerini değiştirilmemiştir böylece resmin arama tablosu (LUT), güncelleştirme tarafından değiştirilir. Max ve min kaydırıcıları görüntü aralığı piksel değerleri 255 beyaz görünen yukarıda ve aşağıda görünen siyah180 piksel değerleri ile alt ve üst sınırları kontrol. En az kaydırıcıyı microglia lekeli DAB photomicrographs için kullanılacak ise floresan photomicrographs durumunda, maksimum kaydırıcıyı, kullanılmalıdır.</li>
	<li>Daha da işlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak karşıtlığı artırmak için Keskinliği Azaltma Maskesi filtresi çalıştırmak | Filtreler | Keskinliği Azaltma Maskesi. Bu iletişim kuralı, ImageJ'ın varsayılan ayarları amacıyla (3 piksel yarıçapı ve maske 0,6 ağırlığını) kullanılır. Not: Keskinliği Azaltma Maskesi keskinleştirir ve orijinal görüntüden (Keskinliği Azaltma Maskesi) bulanık bir sürümünü çıkarılarak ve sonuçta elde edilen görüntü orijinal görüntünün yüksek karşıtlık sürümü birleştirme tarafından görüntünün kenar özelliklerini geliştirir. Bu nedenle, Keskinliği Azaltma Maskesi filtresi ayrıntılarını oluşturmaz ancak yerine bir resimde varolan ayrıntı açıklar. (Ve böylece ne kadar bulanıklık kaldırılacak) ayarlarında değişiklikler nasıl bulanık Keskinliği Azaltma Maskesi RADIUS olacağını ve maske ağırlık ayarlama değişiklikleri Keskinliği Azaltma Maskesi ile birleştirilmiş karşıtlık derecesini (ve böylece son resmin zıtlığını ayarlar).</li>
	<li>Keskinliği Azaltma Maskesi tarafından oluşturulan salt-and-pepper gürültü çıkarmak için bir despeckle adımı gerçekleştirin. Araç çubuğunu kullanın ve işlemi tıklatın | Gürültü | Gürültüyü Temizleme. Not: Lekeleri temizlemek her piksel, 3 × 3 mahallede medyan değeri değiştirerek salt-and-pepper gürültü kaldırır. Kenarları18netliği etkilemeden outliers yoğunluğu içinde medyan piksel tarafından değiştirilir etkisidir.</li>
	<li>Görüntü tıklayarak araç çubuğunu kullanarak ikili görüntü dönüştürmek | Ayarlamak | Eşik. Not: Eşik özellikleri arka plan karşı ilgi içine gri tonlamalı görüntüler stratifies ve görüntü ikili18dönüştürür.</li>
	<li>Despeckle, yakın-, uygulamak ve aykırı işlevler kaldırmak: kadar elde edilen ikili görüntüde tek piksel arka plan gürültü ve süreçler arasındaki boşluklar olabilir.<ol>
<li>İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak despeckle işlevi uygular | Gürültü | Gürültüyü Temizleme. Not: Uygulama lekeleri temizlemek için ikili resim siler kalan tek piksellik gürültü yapmayın.</li>
		<li>İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak yakın işlevi uygular | İkili | Yakın. Not: Bu eklenti ilâ 2 piksel ayrılırlarsa iki karanlık piksel bağlanır.</li>
		<li>İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak kaldır outliers işlevi uygular | Gürültü | Outliers kaldırmak. Not: Bu protokol amacıyla, 2 piksel yarıçapı ve bir eşik 50 ile parlak outliers hedeflenir. Bu eklenti tarafından belirli bir değeri (eşik)18değerinden fazla sapma çevresindeki medyan piksel bir parlak ya da ölü aykırı piksel yerini alır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gelecekteki kullanımı ve/veya fractal analiz için ayrı bir dosya olarak kaydetmek ve işlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak görüntü skeletonize | İkili | Skeletonize.</li>
	<li>Skeletonized görüntüyü seçin ve çalışma plugin eklentileri tıklatarak araç çubuğunu kullanarak AnalyzeSkeleton(2D/3D) | İskelet | İskelet analizve şube bilgileri kutusunun işaretlenmesi. Not: Görüntü işleme en iyi duruma getirme ile ekleme ya da silme yukarıda önerilen adımlardan gerektirecektir olasıdır. Bu süreçte skeletonized görüntüleri bir bindirme iskelet ve orijinal görüntü oluşturarak doğruluk için değerlendirilir. Somas merkezden yayılan işlemleri ile tek kökenli puan olmalıdır; dairesel somas verileri yıkmak ve protokol ayarı kaçınılmalıdır. Tek bir noktadan dairesel somas karşı örneği Şekil 1' de gösterilmiştir.</li>
</ol>Temsilcisi olmayan iskeletler kaynaklanan ve çözümler önerdi ortak sorunları:
<ul><li>Görüntü çok karanlık: gri tonlama için dönüştürmek, Parlaklık/kontrast kaydırıcıları ayarlayın ve/veya Keskinliği Azaltma Maskesi uygulama</li>
	<li>Çok fazla arka plan: Parlaklık/kontrast kaydırıcıları ayarlayın, Despeckle uygulamak ve/veya kaldırmak aykırı</li>
	<li>(Özellikle floresans görüntüler için) skeletonized görüntüdeki dairesel somas: FFT bant filtre ve/veya Keskinliği Azaltma Maskesi uygulamak</li>
	<li>Çatlaklar (özellikle alan parlak görüntüler için) bir doku: FFT bant filtre uygulamak ve/veya gürültüyü Temizleme</li>
</ul><ol start="10"><li>Tüm verileri sonuçlarından kopyalayın ve şube bilgi veriyor ve verileri bir Excel elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz.</li>
	<li>Excel'de, IHC ve görüntü alma neden iskelet parçaları kaldırmak için veri kırpın.<ol>
<li>İskelet analiz ham veri çıktısı deney kitabıyla çoğaltmak ve dosya adına TRIM ekleyin. Tüm sonraki veri düzeltme gelecekteki kullanım ve referans için ham verileri korumak için çoğaltılmış çalışma kitabındaki gerçekleşmelidir.</li>
		<li>Hangi parçaları uzunluğu ImageJ içinde skeletonized görüntüyü açıp, çizgi aracını seçerek veri kümesinden kırpılacağı belirlemek. Çeşitli parçaları ortalama uzunluk, not alma, ölçmek ve kesme biçimi değerini üzerinde karar verin. Not: burada sunulan veri, istenmeyen parçaları için kesme uzunluğu 0.5 amaçlıdır. Bu değer bir veri kümesi tutarlı olmalıdır.</li>
		<li>Özel sıralama Excel elektronik tablo tıklayarak Sırala ve Filtre Uygula tarafından | Özel sıralama. "Son nokta voxels" büyükten küçüğe ve yeni bir düzeye, tarafından "Mx şube pt" Büyükten Küçüğe Sırala.</li>
		<li>Kesme biçimi değerini daha az en büyük şube uzunluğunda 2 bitiş noktaları içeren her satır kaldırmak (i.e., 0.5). Para bitiş noktaları toplam sayısını hesaplamak için bitiş noktası sütundaki verileri görüntüden toplamış.</li>
		<li>Şube bilgileri veri için tekrar ediyorum: 'şube boyla' en küçük gelen büyüğe sıralamak. Kaydırma üzerinden veri ve bir dal kesme biçimi değerini daha az uzunlukta her satırını kaldırmak(i.e., 0.5). Tüm dalları görüntüden toplanan toplam uzunluğunu hesaplamak için şube uzunluk sütunundaki değerlerin toplamı.</li>
		<li>Tüm veriler kesilmiş ve özetlenebilir kadar adımları 4.11.3-4.11.5 her görüntü/sayfası için yineleyin.</li>
		<li>(Uç noktalarının sayısını toplanır ve branş uzunluğu toplamı) her görüntü verilerinden microglia somas karşılık gelen görüntü sayısı bölün. Son verileri (bitiş noktaları/hücre & dal uzunluğu/hücre) istatistiksel yazılım girin. Not: Toplam şube uzunluğu/hücre veri uzunluğu, pixel dönüştürme mikron gerektirebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. fractal analiz
Not: FracLac bir dizi değil kaplıdır farklı şekil analizleri bu protokol için çalıştırmak yapabiliyor. FracLac daha ayrıntılı bir açıklama çeşitli işlevler için FracLac el kitabı, bkz: < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> ve ilişkili başvurular 2,16,19. Fraktal Çözümleme Protokolü 4.1-4.7 yukarıda açıklanan adımları kullanır.
<ol><li>Tüm fractal analiz için kullanılan YG boyutunu belirler. ROI çizmek için Dikdörtgen aracını kullanın. Kutuyu hücrenin tamamını yakalamak için yeterli büyüklükte ve veri kümesi tutarlı kalır emin olun. Not: dikdörtgen seçimi yerine serbest seçim tüm ROIs aynı boy dikdörtgen, ve bu nedenle, hücreleri aynı ölçeğe sahip sağlamak için kullanın. Serbest seçim ImageJ çünkü otomatik ölçek farklı boy dikdörtgen windows farklı ölçeklerde hücrelerle sonuçlanan sığacak şekilde kare bir yatırım getirisi kullandıysanız bu durumda olmazdı. Fraktal şekiller ölçekli bağımsız olmakla birlikte, FracLac ImageJ için kullanarak fractal analiz süreci ölçek16tarihinde bağlıdır. Böylece, veri toplama boyunca sürekli olarak ölçekli bir yatırım getirisi için gerek yoktur.</li>
	<li>Rastgele microglia fractal analiz için her photomicrograph ve karşılık gelen ikili resim seçin. ROI Yöneticisi penceresinde ROI hücrenin konumunu kilitlemek için güncelleştirme seçin. CTRL + üst karakter + D alanı içinde yeni bir pencere olarak yatırım getirisi çoğaltmak için kullanın ve kırpılmış hücre kaydedin. (İskelet analizinden) karşılık gelen ikili görüntü üzerinde alan ROI Yöneticisi'ni kullanarak aynı hücre ile yinelenen. Hücreleri yeterli sayıda fractal analiz için rasgele seçilmiş ve tüm dosyalarını kaydetmek kadar yineleyin. Not: Bir rasgele sayı üreteci ve numaralandırılmış Kılavuzu rastgele hücreleri seçmek için kullanılabilir.</li>
	<li>İkili resim ile bireysel hücreyi aç. Boya Fırçası aracını çift tıklatın, siyah rengi ayarlamak ve fırça genişliği gerektiği gibi ayarlayın. Eşleşen photomicrograph referans olarak kullanarak, bitişik hücre süreçleri kaldırmak, parçalanmış işlemleri bağlamak ve hücre ilgi yalıtmak için boya fırçası kullanın. İkili hücre izole edildikten sonra ikili dosyayı kaydedin. Not: 'alt' basılı (siyah) ön plan renginden boya fırçası arka plan rengine (beyaz) geçiş yapar.</li>
	<li>Anahat araç yolu ile işlemi kullanarak ikili hücre dönüştürmek | İkili | Anahat. Not: FracLac görüntü j-ebilmek var olmak kullanılmış her iki katı şekillerdeki veya şekil özetliyor, ancak, Şu anki şekli kullanmak için16özetliyor kuralıdır.</li>
	<li>Araç çubuğunda, eklentileri tıklatarak araç çubuğunu kullanarak FracLac açın | Fractal analiz | FracLac ve BC (sayma kutusu)seçin. Kılavuz tasarım ayarlarında, Num G 4 olarak ayarlayın. Grafik seçenekleri'nin altında analiz dışbükey hull ve hücre sınırlayıcı daire için ölçümleri kutuyu işaretleyin. Bittiğinde, Tamam' ı seçin. Not: Num G sayısı kutusuna tarama sırasında kullanılan ızgara yönelimleri sayma ve Num G için önerilen Aralık 4-12. Num G ayarı ve önerilen Aralık iyice FracLac el ile16' kevgirden geçirilir. NUM G artan hesaplama kez önemli ölçüde yavaşlatabilir. FracLac ayarlarını yalnızca bir kez oturum başına ayarlamak gerekir. Ayarları girdikten sonra tarama düğmesi kullanılabilir hale gelir.</li>
	<li>Seçili resmin üzerine kutusunu sayma tarama çalıştırmayı tarama düğmesini seçin. Not: Tarama veri çıkışları olan üç windows oluşturur: gövde ve daire sonuçları, kutu sayısı Özeti dosya ve tarama türleri. Tarama türleri penceresinde kullanılan ayarları günlüğünü içerir, yanı sıra standart sapmalar kesin ölçer. Bu iletişim kuralının amacı gereği, tarama türleri penceresindeki kullanılmaz ve kapalı veya olabilir için gelecek bahsetme kurtarmak.</li>
	<li>Gövde ve Daire sonuçları penceresindeki istenen tüm veri kopyalamak (i.e., yoğunluk, yayılma oranı ve döngü) sonuçları. Kutu sayısı Özeti penceresindeki istenen verileri kopyalamak (i.e., Fraktal boyut ve lacunarity) sonuçları. Kopyalanan verileri bir Excel dosyası veya istatistiksel yazılım aktarın. Not: FracLac tam bir listesi çıktı veri sağlanan ve iyice FracLac ImageJ el ile16için açıklanmıştır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis.">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).</li><li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+microglia:+a+morphological+definition.">Rod microglia: a morphological definition.</a> PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients,+Impairs+Microglial+Motility,+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis/Microglial+Phagocytosis+Uncoupling.">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).</li><li>Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+Epilepticus+Triggers+Time-Dependent+Alterations+in+Microglia+Abundance+and+Morphological+Phenotypes+in+the+Hippocampus.">Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus.</a> Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).</li><li>Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microglia+analyses+reveal+diverse+morphologic+responses+in+the+rat+cortex+after+diffuse+brain+injury.">Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury.</a> Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+spatiotemporal+analysis+of+microglia+morphology+during+ischemic+stroke+and+reperfusion.">A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion.</a> J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).</li><li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors.">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Enrichment+Potently+Prevents+Microglia-Mediated+Neuroinflammation+by+Human+Amyloid+beta-Protein+Oligomers.">Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers.</a> J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).</li><li>Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+response+to+Alzheimer's+disease+is+differentially+modulated+by+voluntary+wheel+running+and+enriched+environments.">Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments.</a> Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).</li><li>Soltys, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+morphological+study+of+microglial+cells+in+the+ischemic+rat+brain+using+principal+component+analysis.">Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis.</a> J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).</li><li>Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+of+microglia+in+the+postnatal+rat+brain.+A+quantitative+study.">Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice.">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li><li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+histological+sections:+Application+to+mammary+gland+tissue.">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li><li>Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microglia+activation:+a+spatial+statistics+approach+to+maximize+information+extraction.">Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction.</a> Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).</li><li>. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2014)</li><li>Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractal,+Multifractal,+and+Lacunarity+Analysis+of+Microglia+in+Tissue+Engineering.">Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).</li><li>Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+quantitative+analysis+of+microglial+morphology.">3D quantitative analysis of microglial morphology.</a> available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).</li><li>Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Morphological+Categorization+in+a+Rat+Model+of+Neuroinflammation+by+Hierarchical+Cluster+and+Principal+Components+Analysis.">Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis.</a> Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Microglia hücreleri ince fizyolojisi ve patoloji mikro-etki alanları içinde ayarlanan ve türleri morfoloji2 çeşitli bir yelpazede ince7,14 ve brüt yaralanma8. ImageJ iletişim kurallarının kullanımını microglia morfoloji miktar platformu olarak tüm laboratuvarlar için erişilebilir yapar ve eklentileri bir açık kaynak görüntü işleme yazılımı vardır. Açıklanan protokol görüntü işleme ve analiz bu yazılımı kullanarak üzerinde odaklanmış iken, veri toplama, geçerlilik ve güvenilirlik tutarlılığını mükemmel IHC ve mikroskobu ile başlar. Bu iletişim kuralı ikili, iskelet ve tüm photomicrographs ve tek hücre anahat gösterimleri geliştirmek için kullanılır ama zavallı IHC boyama yer alamaz ve düşük kontrast içinde sonuç mikroskobu bulanık veya görüntü bozuk. Bir ek dikkate, değiştirilemez bir şekilde portaldan microglia morfoloji değiştiren beyin dokusu Muhafazası kesit, öncesinde sırasında değil düzleştirmek için özen göstermelidir. Son olarak, her deneme içinde aynı ölçek gibi aynı mikroskop kullanarak microglia yansıması gerekir. Araçları, amaçları ve yazılım benzer hedefleri rağmen farklı büyüklükteki photomicrographs neden ve detay yanı sıra her çerçeve içinde hücre sayısını değiştirmek mikroskoplar arasında değişir. Örneğin, iki kez sayı hücre ve edinimi Zeiss 880 kullanma daha ayrıntı daha az 40 X objektif bir Leica SPII kullanarak resim alma sonuçlanır. Bu veri örnekleme bir sorun olduğunda bu özellikle tek bir hücre yerine tüm çerçeve toplanan hücre yaklaşım veri için önemlidir.
Genel olarak, hangi tüm photomicrograph iskelet analiz tek hücre fractal analiz iki nedenden dolayı önce gelir. Belirleyici hücre yaklaşım bir photomicrograph tüm hücreleri tek hücre fractal analiz için karşılaştırıldığında ve saat bir faktör ise bir tarama aracı olarak düşünülebilir hızlı. Buna ek olarak, iskelet çözümleme sırasında elde edilen ikili görüntüleri fractal analiz için kullanılır. Yansıma sonra iskelet Çözümleme sonuçlarını etkilemek ve Kullanıcı-etkisi tanıtmak kritik adımlar vardır. Kullanıcılar arasında en değişken Protokolü adımlar adım 4.2 (artan görüntü parlaklığını) ve 4.5 (eşik belirleme) adım. Mümkün olduğu durumlarda, (max veya min kaydırıcısını 0-255 arasında) artırmak için en uygun bir numarası belirler ve tüm görüntüler ve kullanıcılar için sabit tutulan. Görüntü değişkenlik büyük olduğunda, Kullanıcı yerine görüntüler arasında değişir bir parlaklık seçebilirsiniz. Alternatif olarak, görüntüleri parlak ve kontrast yüksek ise, parlaklık artan atlanabilir ve eşik standardize özel eşik filtre kullanarak (Örn., Huang) daha değişken varsayılan yerine. Bir kez en iyi duruma getirilmiş, parametreler için ek Kullanıcı-etkisi en aza indirmek için yapıştırılır.
Bir örnek Kullanıcı değişkenlik Şekil 5' te gösterilmiştir. Veri değerleri Kullanıcı 1 Kullanıcı 2 karşı artmış ve eğer Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 veri toplama için katkıda bu nedenle değişkenlik yükseltilmiştir. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 ikili ve skeletonized görüntüleri farklılıkları örneği olan vurgulanır renkli daireler (Şekil 5). Bu durumda, hem kullanıcılar hem de microglia sınırlı uzmanlık ile kısaca eğitimli lisans öğrencileri vardı. Normal gözetim ve bir microglia ile birlikte artan Protokolü eğitim2 uzman tarafından danışmanlık arası Kullanıcı değişkenliği azaltır. İkili hücreleri el ile ve tek tek izole microglia şekiller belirlemek için yalnızca eşik güvenmek yerine bir photomicrograph olduğundan burada değerlendirildi değil, fractal analiz arası Kullanıcı değişkenlik tabi daha az olsa da. Ancak, tüm yöntemler bazı değişkenlik kullanıcılar arasında bulunur. Bu nedenle, tek bir Kullanıcı (ideal olarak, microglia hücrelerde bazı uzmanlık eğitim) tüm veri kümesinin veri toplama tamamlamak.
Ek değişiklikler bu iletişim kuralı için kolayca yapılabilir ve görüntü kalitesi ve gürültüyü azaltmak ve işlem bağlantısını sağlamak için harcanan çabaları bağlı olacaktır. Örneğin, kontrast yeterli ise, o zaman Keskinliği Azaltma Maskesi gerekli değildir ve atlanabilir. En iyi duruma getirme ve görüntüler, deneysel çalışmaları ve bütün bir set veri toplama önce denetimleri, belirli bir kümesi için protokol sonlandırmak akıllıca olur. Son olarak, ek eklentileri diğerleri yerine açıklamak veya bu protokol için açıklanmayan görüntüleri netleştirmek için kullanılabilir dilate veya keskinleştirme gibi.
Bu iletişim kuralı avantajları onun evrensel kullanılabilirlik ve uyum vardır. Buna ek olarak, AnalyzeSkeleton kullanarak hücre yaklaşım değerlendirirken hızlı ve tüm photomicrograph için geçerli. Çok hücreli analiz yaklaşımı tek hücre yerine bir bütün bölge odaklanmak şeydir. Bu nedenle, hızlı bir şekilde, resmin içinde tüm microglia (bitiş noktaları ve işlem uzunluğu) açısından yaklaşım ortalama değerlendirmek mümkündür. İskelet çözümlemesi sağlayan birden çok hücre Analizi: veri örnekleme tarafından fractal analiz tek photomicrographs hücrelerden yalıtmak için gerekli zaman yatırım nedeniyle eşleştirilemeyen hücre sayıları açısından. Nerede bu en uygun olabilir bir örnek microglia türleri proximities fokal bir sakatlık içinde morfoloji eleme olurdu. IHC photomicrographs iskelet modeller oluşturmak için tüm alan görüntü işleme için daha zaman alıcı tek hücre yaklaşım karşılaştırıldığında kusurlu bir kısıtlamadır. Buna ek olarak, bir bölge analiz nerede microglia türleri morfoloji aynı alanda bulunan büyük ölçüde farklı koşullara uygun değil. Son olarak, bu analiz yöntemi hücre sayısı, deneysel koşullar arasında farklı olabilir bir parametre bağlıdır.
Fractal analiz tek bir hücre üzerinde yapılır ve bu nedenle iskelet çözümlemesinden ortalama hücre yaklaşım veri çıkışı tamamlar. Her ne kadar çok daha zaman alıcı, bu yatırım çok çeşitli xarakteristikaları veri verir. Örneğin, yoğunluk, yayılma oranı, hücre ve döngü veri boyutu, uzama ve hücre anahattının şeklini sırasıyla açıklanmaktadır. Fraktal boyut ve lacunarity hücre karmaşıklığı ve şekil heterojenite, anılan sıraya göre özetler. Her parametre nasıl hesaplanır ve nasıl veri yorumlanır daha ayrıntılı bir özetini içinde etkileşimli el ile16 sağlanır ve bu ayrıntı özel araştırma soru ile ilgili olarak düşünülmelidir. Hassas araçları fizyolojik ve patolojik koşullarda oluşabilir 2D microglia türleri morfoloji küçük değişiklikleri ölçmek için açıklanan protokol sonuçlarında. Sağlamlık, gönderilir ve form faktörü16,20 gibi ek xarakteristikaları analiz 3D şekiller oluşturmak mümkün olabilir.
İletişim kuralı geliştirme ve uyum sürekli ve Kullanıcı tarafından. Bu floresan8 ' den DAB/parlak-alan resim7 ama henüz katıştırılmış doku alkol için kapsayacak biçimde genişletilmiştir. Buna ek olarak, bu ek analiz için Imaris gibi özel mülk yazılım ile birlikte kullanılabilir. Bu iletişim kuralı Fizyoloji çeşitli için uygulanabilir ve microglia için sınırlı değildir ancak herhangi bir hücre veya doku belirli desen veya IHC yöntemlerle tespit şekilleri ile uygulanabilir. Son olarak, yeterli örnek boyutu ile birden fazla varyasyon veya küme analizi microglia göre morfolojisi12,21tabakalaşmak uygulanabilir; microglia morfoloji microglia işlevleri ve yanıt çevreleri için çok önemli bir göstergesi olarak bu anlamlı bilgi yok. Mikroglial morfolojik çeşitlilik için takdir genişleyen ve tam olarak sağlık ve hastalık sırasında nöron-glia-vasküler etkileşimleri anlamak önemlidir. Bu alanda büyüme ölçmek ve microglia morfoloji birden çok sürekli değişken kullanarak özetlemek için iyi gelişmiş, kullanımı kolay ve tekrarlanabilir protokolleri tarafından geliştirilmiştir.

Microglia beyin fizyolojisi1 olanakları bir süreklilik boyunca hiper yaklaşım ve son derece karmaşık türleri morfoloji arasında değişen de-ramified ve protozlar türleri morfoloji2 için değişiklikler için bir acil ve çeşitli morfolojik tepki var . Microglia3polarize ve çubuk şeklinde de olabilir. Microglia hücre yaklaşım yaygın olarak birden çok işlem sahip karmaşık bir şekil tanımlanır ve genellikle bitiş noktası başına hücre sayısı ve hücre süreçleri uzunluğu bildirilir. Microglia ince ayarlı beri nöronal ve gliyal işlevi ile sürekli hücre-hücre çapraz-hadis ve in vivo hareketliliği4,5, microglia türleri morfoloji farklı hücre işlevler ve işlev bozuklukları göstergeleri olarak hizmet verebilir beyinde. Yeterince tarif bu morfolojik değişiklikler çeşitliliği ve (epilepsi5,6 gibi ince fizyolojik rezonans meydana ramified hücreleri arasındaki farkları ayırt etmek için nicel bir yaklaşım gereklidir ve beyin sarsıntısı7) ek olarak (örneğin, kontur8) Brüt yaralanma. Morfoloji miktar7,8,9,10,11,12,13,14 kullanımının artmasıyla microglia türleri morfoloji tam çeşitliliği sağlık ve hastalık sırasında ortaya çıkaracaktır. ImageJ eklentileri microglia floresan veya floresan photomicrographs üzerinden microglia morfoloji özetlemek gerekli kademeli kullanımı sabit kemirgen dokusunda immünhistokimya (IHC) sonra elde mevcut çalışma ayrıntıları.
Burada açıklanan analiz teknikleri için 2010 yılında büyük meme yapıları, ölçmek için geliştirilmiş ImageJ eklentileri AnalyzeSkeleton (2D/3D)15ve ImageJ ve Fraktal analizi için entegre 2014 yılında geliştirilen FracLac16, Merkez bireysel microglia şekiller ölçmek. Bu eklentileri microglia yaklaşım tüm photomicrographs içinde hızlı bir analiz veya birden çok microglia bir photomicrograph içinde tanımlanmış bir yatırım getirisi sağlar. Bu analiz tek başına veya tamamlayıcı fraktal analizi ile kullanılabilir. Tek hücreli fractal analiz (FracLac) zaman bir yatırım gerektirir ama microglia karmaşıklığı, şekli ve boyutu ile ilgili birden çok morfoloji çıkış sağlar. Her iki araç kullanımı gereksiz değil, hücre yaklaşım hücre karmaşıklığı için tamamlayıcı ve birden çok parametre birleşimini farklı microglia türleri veri kümeleri12,17içinde morfoloji arasında ayırt etmek için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">primary antibody anti-IBA1</td>
			<td style="width:173px;">Wako&#160;</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td style="width:167px;">rabbit host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield soft mount</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunorResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>donkey host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 mL glass vial</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>UX-08923-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

Microglia beyin homeostazı katılmak ve sürekli çevreleri disfonksiyon, yaralanma ve hastalık için anket beyin fagositler vardır. İlk müdahale olarak microglia nöron ve glia fonksiyon bozukluğu azaltmak için önemli işlevleri vardır ve bu süreç içinde onlar çok çeşitli morfolojik değişiklikler tabi. Microglia türleri morfoloji açıklayıcı kategorize edilebilir veya alternatif olarak, hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekil gibi parametreleri için sürekli bir değişken olarak sayılabilir. Tek Kişilik hücrelere microglia miktarının yöntemleri uygulanırken, tüm bir photomicrograph içinde birden çok microglia birkaç teknikleri uygulamak. Bu yöntemin amacı çoklu ölçmek etmektir ve tek hücreler hazır ImageJ protokolleri kullanarak. Bu iletişim kuralı adımları bir özetidir ve floresan ve alan parlak photomicrographs temsilcisi ikili ve skeletonized görüntülere dönüştürmek için ve çözümlemek için önerilen ImageJ eklentileri kullanarak yazılım eklentileri AnalyzeSkeleton (2D/3D) ve FracLac Morfoloji veri toplamak için. Bu eklentiler çıkış işlemi bitiş noktaları, kavşaklar ve uzunluğu yanı sıra karmaşıklığı, hücre şekil ve boyut tanımlayıcıları açısından hücre morfolojisi özetler. Burada açıklanan iskelet Çözümleme Protokolü bir bütün photomicrograph veya bölge (ROI) ilgi içinde birden çok microglia bir bölgesel analizi için uygun ise FracLac bir tamamlayıcı tek hücre analizi sağlar. Kombine, protokol bir amaç, çeşitli microglia türleri morfoloji sağlıklı ve yaralı beyin mevcut arasında tabakalaşmak için kullanılan hassas ve kapsamlı değerlendirme aracı sağlar.

Burada açıklanan microglia morfoloji Analizi iletişim kuralları işleme floresan ve DAB photomicrographs xarakteristikaları analiz için yararlı adımları özetler. Aşağıdaki adımları görsel Şekil 2 ' de özetlenmiştir ve Şekil 3. Öyle ki birikmiş veri geçerli uygun şekilde orijinal photomicrograph modelleri bir temsilcisi ikili ve skeletonized görüntüsünü oluşturmada adımları hedefidir. İletişim kuralı uygulamadan sonra AnalyzeSkeleton eklenti sonuçları hangi etiketli bir iskelet görüntü bitiş noktaları ve şube sayısı (i.e., süreç) lengthcan elde edilen çıktı dosyalarından özetlenen. Bitiş noktaları ve işlem uzunluğu veri daha sonra microglia yaklaşım photomicrograph veya ROI ölçüde tahmin etmek için kullanılır. Şekil 4 ve iletişim kuralı uygulama olmadan toplanan elde edilen veriler (bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücre) özetler. Benzer eğilimler var, rakam 4F içinde özetlenen veri daha az değişken daha fazla Şekil 4Eolan vardır. Buna ek olarak, bu veri iletişim kuralı uygulandığında gruplar arasındaki farklılıkları algılamak için artan duyarlılık göstermek. Son olarak, Uygulama Protokolü'nün arası Kullanıcı değişkenliği ile ilgili özen göstermelidir. Bu tür farklılıklar nerede aynı veri kümesi olarak yukarıda özetlenen özdeş bir protokol başvurusu iki bağımsız kullanıcılar tarafından analiz edildi Şekil 5 tarafından özetlenir.
Ek morfoloji veri iletişim kuralı uygulama sırasında oluşturulan ikili görüntülerden izole tek hücrelerden toplanır. Önce microglia Morfoloji ve FracLac eklenti Şekil 6' özetlenir kullanarak çözümlemek için protokol adımları. Biz her iki yaralı (Şekil 6A) bu analizde göstermek ve (Şekil 6B) doku yaralandı. İkili, anahatlı, dışbükey hull/daire ve kutusu sayım örnekleri iletişim kuralı uygulama Şekil 6C-F. içinde gösterilir ve her hücre ile analiz için Kapsüllenen temsilcisi görüntüleri Şekil 6Giçinde özetlenmiştir morfoloji veri farklılıkları kökenleri göstermek için bu görüntüler Yardım.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> Şekil 1. Skeletonized microglia karşı (en iyi) bir tek kökenli soma ve karşılık gelen bindirme skeletonized hücre ile orijinal photomicrograph arasındaki bir dairesel soma (suboptimal) ile illüstrasyonlar. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> Şekil 2. Protokol uygulamaya floresan photomicrographs. Ayrıntıları göstermek için illüstrasyonlar floresan photomicrograph tek bir hücre ile uygulanan iskelet Çözümleme Protokolü'nün kırpılmış. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> Şekil 3. İletişim kuralı uygulamaya alan parlak DAB photomicrographs. Tek bir hücre ayrıntıları göstermek için kırpılmış alan parlak DAB photomicrograph uygulanan iskelet Çözümleme Protokolü'nün illüstrasyonlar. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> Şekil 4. Veri analizi ve iletişim kuralı uygulama olmadan. (A) Floresan IHC ve kırpılmış hücre (B) sarı kutusuna karşılık gelen bir örnek photomicrograph. Örnek ikili ve skeletonized görüntüleri ile (C) ve (D) açıklandığı gibi uygulanan protokol olmadan. Microglia bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücrenin özet verileri (beyaz) yaralanmamış ve (gri) (E) ile kortikal doku yaralandı ve protokol (F) uygulanır. İstatistiksel analiz kullanarak bir öğrenci t-testi ve n = 3, ** p < 0,01 gösterir. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> Şekil 5. İletişim kuralı uygulama ile Kullanıcı farklılıkları. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 ikili ve iskelet görüntüleri orijinal bir görüntü ve protokol dönüştürme örneği. Renkli daireler eşleme ile iki resim arasındaki farklar vurgulanmıştır. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 yaralı ve yaralı beyin bölgelerinde microglia bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücre veri Özet grafikleri. İstatistiksel analizi ANOVA ve örnek boyutudur n = 3; p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> Şekil 6. Fractal analiz ve iletişim kuralı uygulama olmadan. Microglia zarar görmemiş (A) ve karşılık gelen ikili (C) ve ile ve uygulanan protokol olmadan neden anahat (D) görüntüleri ile yaralı (B) korteks kırpılmış photomicrographs örneği. İlişkili dışbükey hull (mavi) ve karşılık gelen anahat şekilleri (E) için (pembe) Daire içine alarak şekil yoğunluğu hesaplamak, oranı ve döngü (G) için kullanılır. Sayım yöntemi kutusu (F) resimli ve Fraktal boyut (DB) ve (G) lacunarity (λ) hesaplamalar için kullanılır. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ at JoVE.com

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia anket ve değişmiş beyin fizyolojisi kantitatif değerlendirilecek morfolojik değişiklikleri ile tepki beyin bağışıklık hücreleri vardır. Bu iletişim kuralı özetliyor bir ImageJ microglia morfoloji hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekli gibi ölçümleri göre sürekli veri olarak temsil etmek için analiz protokolüne dayalı.

ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

quantifying-microglia-morphology-from-photomicrographs

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

65.9K Görüntüleme.  University of Arizona. Microglia anket ve değişmiş beyin fizyolojisi kantitatif değerlendirilecek morfolojik değişiklikleri ile tepki beyin bağışıklık hücreleri vardır. Bu iletişim kuralı özetliyor bir ImageJ microglia morfoloji hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekli gibi ölçümleri göre sürekli veri olarak temsil etmek için analiz protokolüne dayalı.

Video: Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Nörobilim

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, L-lösin metil ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during development, homeostasis, and disease. Although macrophages have been studied in detail for decades, specialized features of microglia, the tissue-resident macrophages of the CNS, have remained largely mysterious, in part due to limitations in the ability to recapitulate mature microglial properties in culture. Here, we illustrate a straightforward procedure for the rapid isolation of pure microglia from the mature rodent brain. We also describe serum-free culture conditions that support high levels of microglial viability over time. Microglia cultured under these defined-medium conditions exhibit elaborate ramified processes and dynamic surveillance behavior. We illustrate some effects of serum exposure on cultured microglia and discuss how these serum-free cultures compare to both serum-exposed cultures as well as microglia in vivo.

Efforts to understand microglial function in detail have been hindered by the lack of microglial culture models that recapitulate the properties of mature in vivo microglia. This protocol describes an isolation and culture approach designed to maintain robust survival of highly ramified mature rat microglia under defined-medium conditions.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

Lucifer Sarı İontoforez kullanarak Astrosit Morfolojisini Görselleştirme

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.