Bu eser Christopher ve Dana Reeve Vakfı Uluslararası Araştırma Konsorsiyumu Medulla Spinalis Yaralanmalarında, Dr Miriam ve Sheldon G. Adelson tıbbi araştırma Vakfı, JPB Vakfı, Novartis temel Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenen, cömert katkıları Vincent ve Stella Coates ve Damon Runyon'un Kanser Araştırma Vakfı (DRG-2125-12).

Kemirgenler ilgili tüm yordamlar için ulusal ve devlet yasaları ve politikaları ile uyumlu Stanford Üniversitesi yönergeleri standartlarla uyumlu. Tüm hayvan yordamları laboratuar hayvan bakım Stanford Üniversitesi'nin Yönetim Panel tarafından kabul edildi.
Not: Tüm çözüm ve tampon besteleri Tablo malzemeleritemin edilmektedir.
1. CD11b Immunopanning (gün 0) için bir petri hazırlayın
Not: her 1-2 çocuk sıçan beyin yerine 1 immunopanning yemek hazırlamak.
<ol><li>25 mL 50 mM Tris pH 9,5 çözüm için 15 cm Petri kabına ekleyin.</li>
	<li>Keçi Anti-fare IgG (H + L zincirler) yemek 6 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Eşit dağıtmak için plaka girdap.</li>
	<li>Yemek için 1-3 h 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Durulama yemekleri üç kez ile DPBS++ (fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) Ca2 + ve Mg2 +ile), daha sonra 1 µg/mL OX42 antikor içeren arabellek kaydırma bir çözüm ile değiştirin. Gecede, oda sıcaklığında bulaşıkları düz bir yüzeye bırak.</li>
</ol>2. doku koleksiyonu (1 gün)
Not: Bu protokol ~ 3-4 h almalıdır.
<ol><li>Başlamadan önce tüm çözümler steril ve soğutulmuş buz üzerinde olduğundan emin olun. Tüm aletleri buz üzerinde sakin ve etanol ile kullanmak için önceden sterilize.</li>
	<li>Aşağıdaki uygun yasal prosedürleri, karbon dioksit boğulma tarafından bir çocuk laboratuvar sıçan kurban. Not: Alternatif olarak, ketamin/xylazine (100-200 µL 24 mg/mL ketamin bas, 2.4 mg/mL xylazine) öldürücü bir doz ile genç hayvanlar kurban. 14 günden daha az sürede hayvanlardır ketamin/xylazine kullanılmalıdır. Birden fazla hayvan kullanıyorsanız, bir hayvandan dokuya ayıklamak ve buz sonraki hayvanlar geçmeden önce önceden soğutulmuş DPBS++ yerleştirin.</li>
	<li>Bir hindpaw tutam ve devam etmeden önce hayvan tam yanıt vermeyi durdurma sorununu sağlamak.</li>
	<li>Transcardially buz gibi perfüzyon arabellek arabellek açık bitene 27½-G iğne kullanarak 10-30 mL hayvanla sıvı. Not: Perfüzyon arabellek hacmi hayvan boyutu/yaş bağlı olarak değişir.</li>
	<li>Hemen perfüzyon sonra hayvan başkanı kaldırın. Omurilik oksipital düzgün her iki tarafta diseksiyon makasla kesme gelen, beyin zarar vermemeye dikkat et. Kesmek sonra her tarafı dikkatle, Paryetal ve frontal kemik Burun kemiği doğru boyunca parça parça kesin. Forseps ile dikkatli bir şekilde geri kafatasının üst çekin, hızlı bir şekilde beyin (veya ilgi CNS yapıları) kaldırmak ve önceden soğutulmuş DPBS++ buzda yerleştirin.</li>
	<li>Tüm kalan hayvanlar için yineleyin. Not: Tüm devam etmeden adımları laminar akış başlıklı uygun steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.</li>
</ol>3. mekanik ayrışma (1 gün)
<ol><li>Tüm beyin topladıktan sonra bir beyin bir soğuk neşter bıçakla buzda Petri kabına 1 mm3 parçalar halinde doğrayın ve bir buz gibi dounce homogenizer 5-7 mL buz gibi douncing arabellek ile aktarın. Bir beyin bir zaman ayırmak.</li>
	<li>10-20 nazik ve eksik vuruş ile gevşek-montaj dounce homogenizer kullanarak doku ayırmak. Değil doğrudan homogenizer alt doku ezmek, ama bunun yerine doku piston kenarlarına ve homogenizer arasındaki boşluğu ile itmek için dikkat ediniz.</li>
	<li>Pistonlu Hava kabarcıkları giriş önlemek için dikkatli bir şekilde çıkarın. Kötü Disosiye doku parçaları homogenizer altına yerleşmek izin ve süpernatant bir yeni soğutulmuş 50 mL konik tüp için transfer.</li>
	<li>Kaldırılan birimin taze douncing arabellek ile değiştirin ve 3,2 3,3 için toplam 3-4 tur veya tüm doku ayrışmış kadar aygıtlarından. Her beyin için yordamı yineleyin.</li>
</ol>4. miyelin kaldırma (1 gün)
Not: Miyelin kaldırma microglia hayvanlardan P12 büyük yalıtım için kullanılır.
<ol><li>Hücre süspansiyon 25 mL pipet kullanarak 50 mL konik tüp hacmi ölçmek, sonra buz gibi douncing arabellek 33,5 ml toplam ses seviyesini ayarlamak için ekleyin.</li>
	<li>Miyelin ayrılık arabellek (MSB) 10 mL hücre süspansiyon için iyice tüp birkaç kez ters çevirme tarafından ekleyip karıştırın. Bu da % 23 bir son konsantrasyon MSB 43,5 mL hacminde yol açar.</li>
	<li>Hücreleri 500 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi. Not: Santrifüj yaklaşık 1,5-2 yavaşlatmak için dakika sürer. Bu miyelin ve ölü hücre artıkları, biraz bulanık süpernatant ve canlı hücreler için zenginleştirilmiş bir daha küçük Pelet üst tabakası oluşturur.</li>
	<li>Miyelin/enkaz ve süpernatant bir pipet ile üst katmanı kaldırın. Daha bunun mümkün olduğunca kaldırılır olarak sağlamak için üst tabaka kaldırırken ilgilen.</li>
	<li>Hücre Pelet arabellek kaydırma 12 mL içinde resuspend. Yavaşça kalmış olabilecek hücreleri herhangi bir kümeleri kadar kırmak için hücre süspansiyon triturate.</li>
</ol>5. Immunopanning (1. gün)
<ol><li>Hücre süspansiyon büyük enkaz veya hücre kümeleri kaldırmak için 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.</li>
	<li>Üç kez DPBS++ile OX42 kaplı kaydırma çanak durulayın. Plakasına izin vermeyen yıkar arasında tamamen kuru.</li>
	<li>Son DPBS++ yıkama dökün ve filtre uygulanmış hücre süspansiyon kaydırma yemek için geçerlidir. Yavaşça hücreleri dağıtmak için plaka girdap, sonra plaka hücreleri bağlı kalmak izin vermek 20 dakika oda sıcaklığında düz bir yüzey üzerinde kuluçkaya. 20 dk daha uzun kuluçkaya değil veya hücreleri yemek kurtarmak çok zor olacak.</li>
	<li>DPBS++ ile kaydırma çanak yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için 10 kez yıkayın. Microglia-ecek var olmak sıkıca plaka bağlı, bu yüzden diğer yapışık olmayan hücreleri kaldırılmasını sağlamak için her durulama ile plaka girdap.</li>
	<li>Son DPBS++ yıkama dökün ve 15 mL DPBS++ ve 200 μL tripsin (%1.25 stok çözelti) adıyla değiştirin.</li>
	<li>Yemek için ≤10 min trypsinize için % 10 CO2 37 ° C'de kuluçkaya. Not: 10 dk daha uzun süre devam etmeyin veya microglia kaldırmak zor olacak.</li>
	<li>Trypsinization, 10 dakika sonra microglia hala plakasına kalmış olacak. 2 x tripsin kaldırmak, buz gibi microglia büyüme orta (MGM) 12 mL ile değiştirmek için DPBS++ ile nazikçe yıkayın ve tripsin/DPBS++ dökün.</li>
	<li>Hücre/substrat etkileşim zayıflatmak ve yemek emin olun yardım için tabak 2 min için buz üzerinde kaydırma kaydırma çanak alanlarında kurumasını önlemek için düz yerdir.</li>
	<li>Şiddetle kaydırma çanak hücreleri kurtarmak için bir 10 mL pipet ve damlalıklı denetleyicisinde yüksek hız ile pipet. 16 x 16 kılavuz sıvı akışı ile denemek ve tüm hücre kaldırma pipet çizin.</li>
	<li>Hücreleri tabaktan ayırdıktan emin olmak için 20 X büyütme, mikroskop altında hücreleri denetleyin. Mark noktalar nerede hücreleri hareketsiz şaşırıp kalmış yemeğin üstüne ve tekrar bu alanlarda pipetting.</li>
	<li>Hücre süspansiyon ve aliquot 3-4 mL başına 15 mL konik tüp süpernatant toplamak. 500 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika çevir. Not: microglia küçük bir birim aracılığıyla iplik için hücre kurtarma maksimum sağlar.</li>
	<li>MGM 0.5 mL ile hücre Pelet bırakarak süpernatant, Aspire edin.</li>
	<li>Her Pelet içinde kalan MGM resuspend ve tüpler hücrelerden Havuzu.</li>
	<li>Hemasitometre içeren hücreleri saymak.</li>
	<li>Adım 6 - 7 uygulamaya bağlı olarak açıklandığı gibi plaka hücreleri.</li>
	<li>Kültür hücreleri 37 ° c % 10 CO2. Not: Hücreler kültür için ilâ 3-4 hafta düzenli medya değişikliklerle veya medya değişiklik ile bir hafta olabilir.</li>
</ol>6. spot doku kültürü plakaları/Coverslips (gün 1) kaplama
<ol><li>Kollajen IV kaplama doğrudan bir 24-şey Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü tabak merkezinde 15 µL plaka ( Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız) ve % 10 CO237 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.</li>
	<li>Hemasitometre hücrelerle sayım sonra 2.3 x 105/mL MGM hücrelere oranında seyreltin. Kollajen IV spot ve hemen plaka 15 µL hücre süspansiyon bu noktaya Aspire edin; Bu 3,5 x 103 hücreleri/spot verecektir. 5-10 dk 37 ° c % 10 CO2 hücreler uygun, TGF-B2/IL-34/kolesterol içeren büyüme orta (TIC) CO2-500 µL equilibrated eklemek izin vermek için hafifçe kuyuya kuluçkaya.</li>
	<li>Eğer coverslips, ilk kat steril cam coverslips ile 10 µg/mL manevra-D-lizin (PDL) H2O RT, 1 h için kaplama 3 kez H2ile O yıkama ve bir başlık UV ışık altında kurumaya bırakın. Coverslips üzerine spot kaplama coverslips kuru olduğunda, adım 6.2 içinde açıklandığı gibi devam edin.</li>
</ol>7. RNA/Protein izolasyon kaplama
<ol><li>104 hücreleri/iyi CO2 gün 1, bir 24-şey Anyonik/Katyonik tüm alan doku kültürü plaka kollajen IV kaplama ile kaplı ve için 10 dk - 1 h % 10 CO2, 37 ° C'de kuluçkaya sonra kaldırmak ve hemen 3-5 x plakası kat equilibrated TIC medya.</li>
	<li>2 günde bir % 50 medya değişiklik her biri için de bir gün sonra hazırlık yapmak. Ölü hücreleri iyi ortasında küme, bu yüzden oradan medya almak eğilimindedir.</li>
	<li>Kültürleri korumak için 2-3 günde bir % 50 medya değişiklik yapmak. Ortam değişikliğine kültürler için istenmeyen bir değişken varsa, hücreleri yaklaşık 1 hafta 3 hafta düzenli bakım ile karşı herhangi bir medya değişiklik olmadan hayatta kalamaz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier.">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages.">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486 (2015).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System.">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li></ol>

Yazarlar araştırma potansiyel bir çatışması olarak yorumlanamaz herhangi bir ticari veya mali ilişkileri yokluğunda yapılmıştır bildirin.

Microglia sentinel bağışıklık hücreleri MSS gördükleri için çevresel değişiklikler oldukça tepkili olduklarını; Bu nedenle, büyük bir özenle hücrelerindeki inflamatuar yanıt onların izolasyon ve kültür8sırasında en aza indirmek için gereklidir. Bu hız ve sıcaklık bu protokolüyle içinde gerçekleştirilir. Böylece tüm Santrifüjü adımları 4 ° C'de gerçekleşmesi mümkün büyük ölçüde harekete geçirmek, azaltır zaman buz üzerinde veya 4 ° C'de hücreler tutmak, hayvanlar ile buz gibi perfüzyon tampon periosteum ve protokol doku arasındaki süreyi en aza indirmek için düzenlenmiştir çıkarma ve hücreleri kültür. Gen ifade desenleri taze izole hücre değerlendirmek, hücre lysates doğrudan doğruya--dan CD11b immunopanning yemek trypsinization en azından yalıtım kaynaklı değişiklikleri tutmak için önce hasat. Bu unutulmamalıdır bu bile dikkatli bir şekilde izole microglia hemen sonra muhtemelen nedeniyle tanıma özünde yalıtım yordamı ile ilişkili hasar ilişkili sinyallerin ılık sıcaklıklarda yerleştirilen bir enflamatuar yanıt yürütmek. Protokol başarıyla gerçekleştirildi, 2.5-5 x 105 hücreleri/çocuk sıçan bekleniyor.
Hücre izolasyon Protokolü burada son derece belirli hücreleri CD11b + perfused CNS9yalıtmak için sağlanan. Her ne kadar bu hücre nüfus ağırlıklı olarak microglia oluşan, Ayrıca diğer myeloid nüfus Perivasküler makrofajlar, meninjeal makrofajlar, choroid plexus makrofajlar, monosit ve nötrofil10gibi düşük seviyelerde içerir. Koroid ilişkili Miyeloid hücreleri aslında tanıma ve doku ayrılma öncesinde choroid plexus kaldırılması ortadan kaldırılabilir. Meninkslerde de bir ölçüde kaldırılabilir, ama tüm meninjeal doku ortadan kaldırılması tam burada açıklanan hızlı yalıtım için hedeflenen zaman dilimleri içinde pratik değildir. Bu nedenle, değişkenlik meninkslerde eksik kaldırılması nedeniyle sınırlamak için biz meninkslerde kaldırmaz. Monosit/nötrofil izole malzeme içinde dolaşan sayısını en aza indirmek için aynı zamanda temiz bir perfüzyon önemlidir ve biz genellikle kötü derin doku atın. Bile mükemmel perfüzyon ile izni kan varlığı eritrositler arıtma boyunca hücre topakları içinde küçük bir miktar ile belirgin olarak mutlak değildir. Böylece, nötrofil ve monosit küçük seviyesini co saflaştırılmış ve farklı bir imza taze izole hücre transcriptomic profillerde katkıda bulunmak. Ancak, hücre dolaşan serum-Alerjik TIC medyada hızla ölecek ve onlar hayatta ve kültürleri içeren serum çoğalırlar devam edebilirsiniz, ancak kalıcı kirleticiler, temsil etmemektedir.
Sağlıklı, canlı bir kültür elde etmek için başka bir önemli nokta mekanik ayrışma adımları sırasında dikkat çekmek için olduğunu. Douncing birçok nöronlar, glia ve diğer öldürürken CNS hücreleri, microglia (microglia da bitti-douncing tarafından öldürülmüş olabilir rağmen) nispeten zarar görmeden bu ayrılma hayatta. Eğer doğru yapılırsa, bu iletişim kuralı hücre verimleri o proteolitik ayrılma kullanarak elde edilen karşılaştırılabilir sonuçları, potansiyel olarak doku inflamatuar değişkenleri semptomlarıdır ise yanıt-e doğru yüksek sıcaklıklardaki kaçınılmalıdır. Mekanik doku ayrışma birbirini izleyen eksik mermi gerçekleştirerek, tek hücre süspansiyon genel kültür üzerindeki mekanik stres miktarını en aza indirerek hasat edilebilir.
Burada açıklanan immunopanning Protokolü microglia yalıtmak için bir güvenilir ve tekrarlanabilir bir yoldur, ama diğer benzer yöntemleri kullanılabilir. Manyetik izolasyon ile manyetik aktif hücre miyelin tükenmesi ve CD11b seçimi sıralama kullanarak benzer sonuçlar elde etmiş olursunuz. En yüksek kalite Kültür tarihi için sağlamıştır, daha az özel ekipman için ve hemen önce kültür hücreleri antikor demir oksit Birleşik giriş gerektirmez çünkü burada immunopanning yöntemi üzerinde odaklanmıştır. Mikroglial yalıtım için yaygın olarak kullanılan başka bir bona fide microglia yüzeyi kullanarak diğer CD11b + Miyeloid kirletici üzerinden arınma için protokoller bulunmaktadır o güncel yaklaşımlar üzerinde büyük bir avantaj olan Akış Sitometresi yaklaşımdır TEMEM1198gibi imza işaretleri karşı antikor. Floresans aktif hücre sıralama sonuçlar son derece saf hücre popülasyonda rağmen aynı zamanda hücreleri için ek stresleri dayatır ve daha düşük canlılık kültürler veya düşük verimleri neden olabilir. Genel olarak, tekrarlanabilirlik ve saflık hücre nüfusunun en üst düzeye çıkarmak için etiket içermeyen yoğunluğu Santrifüjü ve shake-off hazırlıkları üzerinde antikor tabanlı yöntemleri üzerinde odaklanıyoruz.
Bu iletişim kuralı Juvenil sıçan microglia kültür için optimize edilmiş iken, microglia çeşitli çağlardan kültür için kullanılabilir; Toplam hücre verimleri maksimal mikroglial genişleme zirvesine geçtikten sonra 1 - 2-hafta-yaşlı fareler ve daha önce büyük doku hücrelerinin kurtarma çalışmasına engel yapısal düzenlemeler vardır. Microglia Ayrıca, izole ve fare ve insan dokusu ile fare veya insan epitopları için belirli bir uygun Monoklonal antikor CD11b antikor değiştirerek kültürlü. Fare ve insan microglia Bu kültür koşullarda hayatta kalmak, onlar ne zaman fare hücrelere göre morfolojik farklılıklar gösterir. Fare hücreleri ramified Morfoloji korur ancak insan hücreleri izole ve bu prosedüre göre kültürlü neredeyse tek tip bir protozlar Morfoloji varken süreçler, ayrıntılı bir şeyin yok.
İzole microglia gerekli deneyleri bağlı olarak farklı şekillerde kaplama. (Olarak canlı/ölü deneyleri ve morfolojik filmler burada gösterilen resimli) en iyi sonuçlar için 3.5 x 103 hücreleri kollajen IV bir 10dk kaplama sonra 24-şey Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü plaka kuyusu ortasına kaplama "nokta" Yukarıdaki Protokolü nitelendirdi. Alternatif olarak, çok sayıda bir yalıtım RNA gibi hücrenin gerektiren deneyler için 3-5 x 104 hücreleri 24-şey plaka kuyu 10 dakika sonra 1 h kollajen IV kaplama kaplama. Biraz daha düşük canlılık gösterdi daha yüksek yoğunlukları hücreleri kaplama ve spot hücrelere kıyasla daha az karmaşık Morfoloji, muhtemelen inflamatuar sinyalleri yanıt yalıtım olarak salgılanan etkisi nedeniyle tedavi. İmmünhistokimya veya cam coverslips gerektiren görüntüleme, hücreleri en iyi hayatta kalma sergi ve coverslips ilk ne zaman Morfoloji PDL ile kaplı sonra yukarıda açıklandığı gibi kolajen IV kaplı. Çok sayıda koşulları gerektiren deneyleri için hücre canlılığı da 96-şey veya 384-şey kolajen kaplı levha yüksektir. Her koşulda, hücreleri yuvarlak veya bipolar başlayın, gün 3-4, etrafında süreçleri elde etmek ve almak 5-10 Resim 1 ve film 1' de gösterildiği sonuna kadar ramified Morfoloji sergilemek yaşam başlar.
Dinamik gözetim davranış ve Morfoloji microglia vivo içindedinlenmek için benzer sergileyen bir kültür bu protokol sonuç varken bu hücreler microglia vivo içindeözel gen ifade imzası tam olarak korumak başarısız. Çok kültürlü hücrelerde gözlenen kalıcı gen değişiklikleri genellikle embriyonik veya kızarmış CNS9' da görülen değişiklikleri yansıtır. Bu nedenle, bu iletişim kuralı bir adım microglia gerektiren kültür ve serum uyarılmış değişiklikleri hayatta kalmak için koşullar anlamada gösterir, ancak ileri çalışmalar mikroglial ince ayar MSS tarafından sağlanan dışsal sinyalleri anlamak için gerekli özellikleri ve gen ifadesi.

CNS parankimi makrofajlar microglia nöronal devreler ve gliyal sinyal ağları geniş bir dizi ile etkileşim. Geliştirme ve homeostasis sinaptik budama, apoptotik hücre Gümrükleme ve nöronal işlemleri1,2geçici etkileşimleri aracılığıyla beynin hayati rol oynarlar. Microglia nörolojik yaralanmaları, erken müdahale uzun, ince süreçlerinin lezyon siteler inflamatuar yanıt koordine etmek ve kanama3,4sınırlamak için uzanan vardır. Mikroglial morfoloji ve işlev değişiklikleri akut ve kronik CNS yaralanmaları her yerde vardır ve Morfoloji, Yerelleştirme ve hastalık Birleşik1çeşitli bir yelpazede inflamatuar aracılar ifade microglia sergi değişmiş. Nörodejeneratif hastalıklar için risk alter mutasyonlar kez ağırlıklı olarak veya sadece hastalık patogenezinde veya ilerleme5 microglia için kritik bir rol işaret olduğu gibi MSS microglia tarafından ifade edilir insan genetik çalışmalar göstermektedir . Yaralanma ve hastalık onların önem dikkate alındığında, mikroglial Biyoloji anlayışı sürdürmek yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için bir yüksek önceliktir.
Mikroglial Biyoloji anlayış için birçok kritik gelişmeler teknikleri ve kültür yöntemleri, gen ifade profilleri ve işlev tanımları da dahil olmak üzere diğer makrofaj nüfus çalışmalarda keşfetti mekanizmaları extrapolating tarafından ortaya çıktığı / morfolojik Birleşik. İşlevler genellikle oynamaya CNS manzara içinde şaşırtıcı şekilde makrofaj Genelleştirilmiş, microglia olmakla birlikte, kendilerini son derece uzmanlaşmış, ramified bir morfoloji ve onları diğer doku dışında setleri benzersiz gen ifade imza sergilenmesi makrofajlar6. Microglia--dan en diğer doku makrofajlar ayrı bir soy var; MSS ilkel hematopoiesis bir erken embriyonik dalga sırasında kolonize ve hayatı, bağımsız olarak kesin hematopoiesis7katkıları boyunca kendini yenilemek. Yetişkin microglia tam olgun gen ifade imza kadar ikinci doğum sonrası hafta8elde değil. Çevreleyen doku çevre ipuçları MSS sınırlı maruz kalma kan - beyin bariyerini9tarafından verilen kan kaynaklı faktörler içeren özel doku makrofaj özellikleri6, dikte içinde önemli bir rol oynamaktadır.
CNS homeostazı ve hastalığı mikroglial katkıları tam olarak anlamak için bir engel olduğunu olgun microglia görülen vivo içinde arıtılmış hücreleri ile özel özelliklerini recapitulating zorluk tüp bebek. İzole etmek için pek çok yöntem geliştirilmiştir ve kültür olduğu gibi microglia ama çoğu yaklaşımlar hücre survival desteklemek için serum güveniyor. Biz doğal olarak değişken bir reaktif biyoaktif molekülleri geniş bir dizi içeren, protozlar bir Morfoloji teşvik çünkü nükleer silahların yayılmasına karşı microglia ile çalışma artış özellikle sorunlu olduğunda, serum, bu ek göstermiştir ve microglia maruz kaldığında faktörlerin kan - beyin bariyerini bozulma sonra bulaşan kan için artan fagositoz9 vivo içinde sık görülen. Bu ölçümler tarafından serum Günese maruz kalan hücreleri microglia yaralanma veya hastalık durumlarında benzer ama tür değişiklikler azalır ne zaman microglia kültürlü CSF-1 (veya IL-34) içeren tanımlanmış büyüme orta, TGF-β, kolesterol ve selenit.
Bu iletişim kuralı Juvenil sıçan microglia kısa bir süre önce iş9' a ilgili serum-Alerjik koşullar altında kültür için ayrıntıları sağlar. Bu iletişim kuralı için rats postnatal gün 21-30 (P21 - P30) gelen aerodinamik ancak verim ve genel canlılığı türler ve hayvan yaş bağlı olarak değişir ama microglia sıçanlar ve fareler her yaştan itibaren yalıtmak için adapte edilebilir. Azami verimi ve biraz çocukça microglia kullanırken en iyi canlılık elde edilir (~ P9), verimleri ve yavaş yavaş biraz daha düşük seviyeleri yetişkin hayvanlarda sivrilen canlılığı ile. Microglia de fare ayrılmış olabilir ama biz fare hücreleri anlamlı olarak daha yüksek verimleri, canlılık ve ramified türleri Morfoloji, karmaşıklığı fare hücre kültürlerinde serum-Alerjik karşılaştırıldığında gösterir ki bulduk. Hayvanlar P50 daha büyük yaş bu iletişim kuralıyla değerlendirilmemiştir. Bu immunopanning yalıtım yordamı sırasında yalıtım mikroglial transkripsiyon profilleri değişiklikleri en aza indirmek için ve hücrelerin aşağı akım canlılığı en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir. Bu teknikleri ve medya formülasyonları kullanılarak, yüksek-canlılık birincil kültürler hafta boyunca sürekli olabilir. Bu koşullar altında kültürlü Microglia son derece ramified bir Morfoloji hızlı uzantısı ve geri çekme işlemleri içeren sergi ve nispeten düşük oranları yayılması. Biz serum-pozlama bu özellikler üzerinde önemini vurgulamak ve diğer yaklaşımlar göre bu yöntemin zayıf ve güçlü tartışıyorlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rat: Sprague-Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Cat# 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# MCA275R</td>
			<td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polycolonal anti-Iba1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# AB5076</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Ki67&#160;</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Cat# AB15580</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11055</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-21203</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-31573</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 28313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td>Galen Laboratory Supplies</td>
			<td>Cat# GAG-HS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat# M3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from milk solids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# P6838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 100-35B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>Cat# 5195-ML/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>Cat# 700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 354233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 90260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 20606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# E1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# DPRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat# 17-5445-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 21041-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S-5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>Cat# 0100-20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat# 62406-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:25,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid/Gondoic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 50 &#956;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Douncing Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 200 &#956;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panning Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglia Growth Medium (MGM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &#956;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &#956;g/mL insulin, 100 &#956;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite 
			Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV Coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing 2 &#956;g/mL collagen IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Seperation Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &#956;L 1 M CaCl2, 5 &#956;L 1 M MgCl2 
			Comments: Mix well after the addition of&#160; CaCl2 and MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &#956;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &#956;g/mL heparan sulfate, 0.1 &#956;g/ml oleic acid, and 0.001 &#956;g/ml gondoic acid 
			Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &#176;C and do not add more than 1.5 &#956;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

Microglia tüm merkezi sinir sistemi (MSS) hücreleri % 5-10'u temsil ve geliştirme, homeostasis ve hastalık sırasında önem onların katkıları nedeniyle giderek çizim. Makrofajlar ayrıntılı olarak incelenmiştir rağmen yıl, özel şekil-in microglia, MSS doku yerleşik makrofajlar, kısmen olgun mikroglial özetlemek için yetenek sınırlamaları nedeniyle büyük ölçüde gizemli kalmıştır Kültür özelliklerinde. Burada, saf microglia--dan olgun kemirgen beyin hızlı yalıtım için basit bir yordam gösterilmektedir. Biz de mikroglial canlılık yüksek düzeyde zaman içinde destek serum serbest kültür koşulları tanımlamak. Bu tanımlanan-orta koşullar altında kültürlü Microglia sergi ayrıntılı ramified süreçleri ve dinamik gözetim davranış. Biz kültürlü microglia serum maruz kalma bazı etkileri göstermek ve nasıl bu serum-Alerjik kültürler hem serum maruz kültürler gibi microglia içinde vivokarşılaştırmak tartışıyorlar.

Bu iletişim kuralı Juvenil sıçanlarından emir kültür yüksek saflıkta ramified microglia için bir yöntemi açıklar. Benzer sonuçlar olgunlaşmamış, perinatal ve Yetişkin Hayvanlar, kullanarak aşağıda anlatıldığı gibi alınabilir. Hücre izolasyonların genellikle ince nüanslar ve hücreleri ölmek için birçok fırsat içerir beri kalite kontrol denetim noktaları çeşitli adımlar başarı belirlemenize yardımcı olması için kullanılır. Genellikle birden çok adımda yalıtım Protokolü (şekil 1A) adlı bir hemasitometre kullanarak hücre süspansiyonlar izlenir. Başarılı izolasyonların 2.5-5 x 105 hücreleri/çocuk hayvan verim. 2. 5 x 105 hücreleri/hayvan için verimleri daha yakın hayvanlardan P30 büyük izole hücreleri gösterir, ancak P7 - P15 hayvanlardan verimleri daha yakın 5 x 105 hücreleri/hayvan, göster. Toplam hücre izleme ötesinde sayar Protokolü ' nün boyunca bu şekilde izole microglia var çünkü yuvarlak veya bipolar Morfoloji kültüründe ilk birkaç gün boyunca zor olabilir izole hücre, genel sağlık belirlemek önemlidir . Burada, biz P25 microglia görüntülerini faz kültüründe yalıtım TIC ve % 10 fetal buzağı serum (FCS) (şekil 1B) içeren TIC sonra ilk 6 gün boyunca eklemiş.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57122/57122fig1.jpg"> Şekil 1: hücre sağlık yalıtım protokol sırasında ve 6 gün kültür değerlendirilmesi. (A)faz kontrast görüntüler hücre izolasyon yordam belirtilen adımları gösteren kalite kontrol noktalarında. Hücresel süspansiyonlar hücresel süspansiyon 9 µL % 0,4 trypan mavi bir hemasitometre üzerine yüklemeden önce 1 µL ile karıştırılarak görüntüsü. Kaydırma çanak diğer resimleri göster ve tüm görüntüleri 20 X büyütme, tek bir alan olarak gösterilir. Ölçek çubuğu, 200 µm. MGM, microglia büyüme orta. (B) saat ders mikroglial morfolojik değişiklikler ve nükleer silahların yayılmasına karşı 6 gün kültür Serumda serum-Alerjik TIC büyüme orta veya TIC artı % 10 fetal buzağı (FCS). CD11b-immunopanned hücreleri spot kollajen kaplı Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü plaka üzerinde kaplama ( Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız), ve aynı alanda faz-kontrast her 24 h ölçek bar, 100 µm. TIC, TGF-B2/IL-34 tarafından yansıma / Kolesterol içeren büyüme orta. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57122/57122fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Rutin değerlendirme sağlık ve canlılık izole hücre tekrarlanabilirlik ve deneyler başarısı için önemlidir. İşte MGM, TIC veya 7 gün vitro (DIV) bir canlılık tahlil ile sonra % 10 FCS ile desteklenmiş TIC kültürlü bir P21 hayvan izole microglia göstermektedir. Yalıtım başarılı olursa, kültürler arasında % 80-90 canlılığı ancak bu yapay olarak her ikisi için de hızlı yayılması şişirilir 7 DIV. varlığında serum sonunda kültürlü hücreleri bu ölçü tarafından % 100 canlılığı yakınındaki tırmanmaya sonra TIC içinde göster Serum Günese maruz kalan hücreleri ve hızlı fagositoz ölü hücre içinde bu kültürler (şekil 2A). Ek olarak güçlü hayatta kalma, kültürlü TIC hücreleri de hücreleri (şekil 2B, C) bir ramified Morfoloji FCS için karşılaştırıldığında tedavi gösterir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57122/57122fig2.jpg"> Şekil 2: yaşama microglia MGM, TIC veya TIC + FCS yedi gün içinde kültür. (A)hücreleri P21 sıçanlarından emir izole edildi ve kültürlü microglia büyüme orta (MGM), TGF-B2/IL-34/kolesterol içeren büyüme orta (TIC), veya TIC + % 10 fetal buzağı serum (FCS). Her zaman noktada kültür orta calcein AM (1.33 µM final) ve etidyum homodimer (2.5 µM son) canlı hücreleri ve ölü hücreleri sırasıyla etiketlemek 15 dakika ile takıma. Hücreleri otomatik bir ImageJ komut dosyası kullanarak her alanda sayıldı. (B ve C) 7 DIV, sonra herhangi bir medya değişiklik ile hücreleri yetişen TIC (B) veya % 10 FCS (C) ile desteklenmiş TIC yukarıdaki gibi canlı ve ölü hücreleri etiketlemek için lekeli. Temsilcisi görüntüleri 10 X (sol) veya 40 X (sağda) amacı istimal alındı. Ölçek çubuğu, standart hata (SEM) ortalamaya 40 µm. hata çubukları temsil eder. Bu rakam Bohlen ve ark. güncellenmiştir 9 ve izni ile kullanılır. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57122/57122fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Başarılı izolasyonu ve kültürü son derece saf microglia göstermek için biz microglia P21 fareler gelen izole ve TIC veya % 10 FCS ile 8 gün boyunca takıma TIC bu hücreler kültürlü. Hücreler daha sonra sabit ve mikroglial işaretleri (Iba-1 ve CD11b) ve nükleer silahların yayılmasına karşı marker (Ki67, şekil 3A) ile lekeli. Hücre işaretler için boyama ek olarak, RNA-seq taze izole hücreleri üzerinde hücrelerin RNA profil değerlendirmek için güçlü ve hassas bir araç sağlar ve kültürlerin başlangıç saflık bilgilendirmek yardımcı olabilir. CD11b immunopanning genellikle CD11b küçük bir yüzdesi sonuç+ CD11b ek olarak nötrofil/monosit ertelenmiş+ microglia (şekil 3B). Bu hücreler TIC içinde bir kaç gün sonra ölecek ama daha önceki zaman noktaları analizlerini karmaşık hale getirebilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57122/57122fig3.jpg"> Şekil 3: saflık biçilen immünhistokimya ve RNA-devamı olarak kültürlü hücrelerinin (A)Microglia PDL/kolajen kaplı cam coverslips kaplama ve TGF-B2/IL-34/kolesterol içeren büyüme ortamda (TIC) 8 gün boyunca kültürlü P21 fareler, yalıtılmış. Hücreleri % 4 paraformaldehyde (PFA) oda sıcaklığında 10 dakika ile sabit ve bağışıklık lekeli Iba-1 ile (1:500), CD11b (1:1500) ve Ki67 (1:500). Kısaca, sabit hücrelerin % 0,1 deterjan ile bloke edildi (Ayrıntılar için yöntemleri tabloya bakın) ve % 10 normal eşek serum (NGS) oda sıcaklığında 1 h için. Hücreleri sonra birincil antikor NGS gecede 4 ° C'de % 1 ile % 0,1 deterjan ile inkübe Hücreleri 5 dk her PBS için üç kez yıkanmış. Hücreleri sonra tüm %1:500 1 ile % 0,1 deterjan ikincil antikorlar ile inkübe NGS oda sıcaklığında 1 h için. Hücreleri olduğunu tekrar PBS içinde üç kez yıkanmış ve montaj orta DAPI içeren monte. Temsilcisi görüntüleri 40 X büyütme oranında alındı. Ölçek bar, 50 µm. (B) temsilcisi hücre tipi belirli transkript taze izole ve kültürlü hücreleri tarafından ifadesi. Microglia P21 sıçanlarından emir izole ve doğrudan doğruya--dan immunopanning çanak RNA izolasyonu için lysed ve en az kirlenme diğer büyük CNS hücre tiplerinin (astrocytes, nöronlar, oligodendrocytes ve endotel hücreleri) RNA-seq. işaretleyicileri göster CD11b-immunopanned hücreleri. Nötrofil işaretleri taze izole hücrelerde (siyah) tespit edilir, ancak serum-Alerjik kültürlerde (gri) kazandı. Kültürlü hücreleri ortak makrofaj işaretleri düzeyi yüksek hızlı, ama özel mikroglial imza tanımlama işaretleri, hızlı bir şekilde downregulated kültürlü hücreleri tarafından vardır. Hata çubukları standart hata ortalamaya (SEM) temsil eder. Veri Bohlen ve ark. değiştirilir 9 ve izni ile kullanılır. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57122/57122fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Canlılık ve hücre işaretçileri için boyama hayatta kalma belirlenmesi ve saflık hücrelerin sağlar, ancak sınırlı bilgi kültür dinamikleri üzerinde sağlar. Burada 14 DIV TIC sonra P21 sıçan microglia hızlandırılmış bir film hazırladık. İki hafta sonra serum-Alerjik kültürleri ile hızlı işlem uzantıları ve retractions yemek boyunca dinamik gözetim davranış göstermek ( film 1bakınız). Ayrıca, biz daha önce serum pozlama bunlar devlet özelliklerini microglia, dinlenme dönüşümleri kalıcı morfolojik ve fagositik değişiklikler sonucu bulduk. Biz TIC içinde microglia 5 gündür kültürlü bir film dahil sonra % 10 FCS maruz ( Film 2bakınız).
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57122/57122mov1.jpg"> Film 1: tanımlanan-orta microglia kültürler göstermek ramified Morfoloji dinamik süreçler ile. Microglia Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü kolajen kaplı plakalar kaplama ve 14 gün boyunca TIC kültürlü P21 ispiyoncu, spot yalıtılmış. 14 DIV görüntüleri her 3 dakikada toplanmıştır. 6 kare/s film çalış ve zaman damgası sağ alt köşedeki görüntüleme süresini gösterir h:min. içinde film Bohlen ve ark. yeniden oluşturulur 9 ve izni ile kullanılır. Bu videoyu izlemek için <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57122/Movie_1.avi" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57122/57122mov2.jpg"> Movie 2: Serum pozlama tetikler tanımlanan-orta mikroglial kültürlerde hızlı bir morfolojik değişim. Microglia Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü kolajen kaplı plakalar kaplama ve 5 gün boyunca TIC kültürlü P21 ispiyoncu, spot yalıtılmış. 5 DIV, görüntüleri her 5 dk. hareketliliği/Morfoloji, sonra 2:55 at (2 saat, 55 dk) kaydedildi temel toplanmıştır, % 50 medya Değiştir % 10 son bir konsantrasyon FCS eklemek gerçekleştirildi. Hücre için bir ek 7 h görüntüsü. 6 kare/s film çalış ve zaman damgası sağ alt köşesinde h:min. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57122/Movie_2.avi" target="_blank">Bu videoyu izlemek için buraya tıklayın lütfen görüntüleme süresini gösterir. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

isolation-culture-rodent-microglia-to-promote-dynamic-ramified

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.8K Görüntüleme.  Stanford University. Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Video: Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Çoklu Ölçeklerde Sayısallaştırılmış Nöronal Morfoloji Otomatik Sholl Analizi

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

Dissected Serebral Kortikal Eksplantlarından ile kullanım için Kemirgen Embriyolar arasından Beyin Omurilik Sıvısı İzolasyonu

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain processing is present in many chronic pain conditions and can influence responses to specific therapies. Thus, the ability to precisely describe the state of central pain processing has profound clinical significance in both prognosis and prediction. Because it is not practical to record neuronal firings directly in the human spinal cord, surrogate behavior tests become an important tool to assess the state of central pain processing. Dynamic QST is one such test, and can probe both the ascending facilitation and descending modulation of incoming nociceptive signals via TS and CPM, respectively. Due to the large between-individual variability in the sensitivity to noxious signals, standardized TS and CPM tests may not yield any meaningful data in up to 50% of the population due to floor or ceiling effects. We present methodologies to individualize TS and CPM so we can capture these measures in a broader range of individuals than previously possible. We have used these methods successfully in several studies at the lab, and data from one ongoing study will be presented to demonstrate feasibility and potential applications of the methods.

By assessing pain in response to repetitive or different types of standardized stimuli, dynamic quantitative sensory testing (QST) can reveal changes in the central processing of pain. We present methods to optimize and individualize two dynamic QST measures: temporal summation (TS) and conditioned pain modulation (CPM).

Dinamik Kantitatif Duyusal Test Merkezi Ağrı İşleme karakterize etmek

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...