Diese Studie erhielten finanzielle Unterstützung von NINR (F32NR013611). Wir möchten weiter bestätigen und danken den Entwicklern von AnalyzeSkeleton(2D/3D) und FracLac (Arganda Carreras Et Al. und Karperien Et Al., beziehungsweise) ohne den hier beschriebene Analyse nicht möglich wäre.

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis.">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).</li><li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mikroglia-Zellen sind abgestimmt auf die Physiologie und Pathologie innerhalb ihrer mikrodomänen und ein breites Spektrum von Morphologien2 im subtilen7,14 und grober Verletzung8anzeigen. Die Verwendung von ImageJ Protokollen macht Mikroglia Morphologie Quantifizierung als Plattform für alle Laboratorien zugänglich und Plugins sind ein Open-Source-Bildbearbeitungsprogramm. Während die beschriebene Protokoll auf Bildverarbeitung und-Analyse mit dieser Software gerichtet ist, beginnt die Konsistenz der Datensammlung, Validität und Reliabilität mit ausgezeichneten IHC und Mikroskopie. Dieses Protokoll wird verwendet, um binäre, Skelett und Gliederung Darstellungen der gesamten Mikrofotos und Einzelzellen zu verbessern, aber kann nicht an die Stelle der Armen IHC beflecken und Mikroskopie, die Ergebnisse in geringem Kontrast, unscharf oder verzerrt Bilder. Als eine weitere Überlegung muss darauf geachtet werden, nicht auf das Hirngewebe während der Lagerung vor dem Schneiden, glätten, das Mikroglia Morphologie unwiderruflich verändert. Zu guter Letzt muss innerhalb jedes Experiment Mikroglia abgebildet werden mit der gleichen Skala sowie die gleichen Mikroskop. Instrumentierung, Ziele und Software variieren unter Mikroskopen die führen zu unterschiedlicher Größe Mikrofotos trotz ähnlicher Zielsetzung und ändern Sie die Details sowie die Anzahl der Zellen in jedem Frame. Bildaufnahme mit einem 40 X Objektiv auf eine Leica SPII ergibt beispielsweise zweimal die Anzahl der Zellen und weniger Details als Erwerb mit einem Zeiss-880. Dies ist besonders wichtig für die Zelle Verzweigung Daten aus den gesamten Rahmen, anstatt eine einzelne Zelle, da dies ein Problem der Daten Probenahme wird.
In der Regel vorausgeht Skelett Analyse, die die gesamte Mikrophotographie nutzt die einzelne Zelle Fraktal-Analyse aus zwei Gründen. Bestimmende Zelle Verzweigung aller Zellen in einem Mikrophotographie ist schnell im Vergleich zu der einzelnen Zelle Fraktalanalyse und als ein Screening-Instrument angesehen werden, kann wenn Zeit ein Faktor ist. Darüber hinaus werden die binären Bildern abgeleitet während Skelett Analyse für Fraktalanalyse verwendet. Sobald ein Image erstellt, gibt es eine Reihe von kritischen Schritte, die Einfluss Skelett Analyseergebnisse und Benutzer-Einfluss vorstellen kann. Die Protokoll-Schritte, die meisten variabel zwischen Benutzern sind Schritt 4.2 (zunehmende Helligkeit) und 4,5 (Bestimmung des Schwellenwerts). Soweit möglich, wird eine optimale Anzahl Erhöhung der Helligkeit (Max oder min Schieberegler zwischen 0-255) bestimmt und für alle Bilder und Anwender konstant gehalten. Wo Bild Variabilität groß ist, können die Benutzer stattdessen eine Helligkeit, die zwischen den Bildern variieren. Alternativ, wenn Bilder hell sind und Kontrast hoch ist, dann Helligkeit erhöhen kann weggelassen werden und Schwellwerte kann mithilfe eines Filters Spezialität Schwelle standardisiert werden (zB., Huang) anstatt die variablere Standard. Sobald optimiert, sollte die Parameter eingehalten werden um zusätzliche Benutzer-Einfluss zu minimieren.
Ein Beispiel für Benutzer Variabilität ist in Abbildung 5dargestellt. Datenwerte wurden in User 1 versus User 2 erhöht und daher würde die Variabilität erhöht werden, wenn Benutzer 1 und Benutzer 2 zur Datenerhebung beigetragen. Ein Beispiel für die Unterschiede in der Benutzer 1 und Benutzer 2 binäre und skelettierten Bilder sind deutlich durch farbige Kreise (Abbildung 5). In diesem Fall waren beide Benutzer kurz ausgebildeten Studenten mit begrenzten Expertise in der Mikroglia. Regelmäßige Kontrolle und Betreuung durch einen Experten zusammen mit erhöhten Protokoll Training2 Mikroglia können Inter Benutzer Variabilität reduzieren. Obwohl hier nicht bewertet, ist Fraktalanalyse weniger anfällig für Inter Benutzer Variabilität da binäre Zellen einzeln und manuell von einem Mikrophotographie, anstatt allein auf Schnittstellenüberwachung Mikroglia Formen bestimmen isoliert sind. Alle Methoden besitzen jedoch eine gewisse Variabilität zwischen den Nutzern. Daher ein einzelner Benutzer (im Idealfall ausgebildet durch einiges an Fachwissen in Mikroglia-Zellen) sollte die Datensammlung für eine gesamte Dataset abgeschlossen.
Zusätzliche Änderungen dieses Protokolls leicht erfolgen können und hängt die Bildqualität und die Bemühungen zur Reduzierung von Lärm und Prozess-Konnektivität zu gewährleisten. Zum Beispiel, wenn Kontrast ausreicht, dann Unscharf maskieren ist nicht notwendig und kann weggelassen werden. Es ist ratsam, zu optimieren und das Protokoll für eine bestimmte Gruppe von Bildern, experimentelle Fälle und Kontrollen, vor dem Sammeln von Daten aus einem ganzen Satz abzuschließen. Zu guter Letzt zusätzliche Plugins verwendet werden, anstelle von anderen zu formulieren oder zu schärfen Bilder, die in diesem Protokoll nicht beschrieben wurden wie zu dehnen oder zu schärfen.
Vorteile dieses Protokolls sind seine universelle Verfügbarkeit und Anpassungsfähigkeit. Darüber hinaus ist die Beurteilung Zelle Verzweigung mit AnalyzeSkeleton schnell und auf eine gesamte Mikrophotographie anwendbar. Ein Vorteil der multizelle Analyseansatz ist der Fokus auf einer ganzen Region anstatt einzelner Zellen. Daher ist es möglich, die durchschnittliche Auswirkung (in Bezug auf die Endpunkte und Prozess-Länge) alle Mikroglia im Bild schnell zu beurteilen. Skelett-Analyse liefert eine Analyse mehrerer Zellen: eine Auswahl der Daten in Bezug auf die Anzahl der Zellen, die nicht von Fraktalanalyse aufgrund der erforderlichen Zeit Investitionen, einzelne Zellen von Mikrofotos isolieren abgestimmt werden. Eine Instanz, wo dies am besten geeignet sein könnte, wäre in screening-Mikroglia Morphologien in Nähe einer fokalen Verletzung. Eine Einschränkung ist, dass das ganze Feld Bildrendering Skelettmodelle IHC Mikrofotos erstellen unvollkommen im Vergleich zu der zeitaufwändiger Einzelzelle Ansatz ist. Darüber hinaus sind eine regionsanalyse nicht Umständen angemessen Mikroglia Morphologien drastisch unterschiedlich im gleichen Bereich. Zu guter Letzt ist diese Analysemethode abhängig von Zellzahl, ein Parameter, der zwischen experimentellen Bedingungen abweichen.
Fraktalanalyse erfolgt auf eine einzelne Zelle und ergänzt somit die durchschnittliche Zelle Verzweigung Datenausgabe aus dem Skelett Analyse. Obwohl viel mehr zeitaufwendig, verschiedenste morphometrische Daten diese Investition bringt. Z. B. Zelle Dichte, Span-Verhältnis und Zirkularität Daten beschreiben die Größe, die Dehnung und die Form der Zelle Gliederung, beziehungsweise. Fraktale Dimension und Lacunarity fassen die Zelle Komplexität und Heterogenität der Form, beziehungsweise. Eine ausführlichere Zusammenfassung der wie jeder Parameter berechnet wird und wie Daten interpretiert werden können finden Sie in der interaktiven manuelle16 und so detailliert betrachtet werden, in Bezug auf die spezifische Fragestellung. Das beschriebene Protokoll führt zu empfindlichen Werkzeuge, kleine Änderungen in 2D Mikroglia Morphologien zu quantifizieren, die unter physiologischen und pathologischen Bedingungen auftreten können. Zusätzliche morphometrische Analyse wie Solidität, Konvexität und Form Faktor16,20 wenn 3D-Formen erzeugen möglicherweise.
Protokollentwicklung und Anpassung ist kontinuierlich und nutzerorientierten. Es wurde von Fluoreszenz8 DAB/Hellfeld Bilder7 aber noch nicht zu paraffin eingebettete Gewebe ausgedehnt. Es außerdem für zusätzliche Analysen in Verbindung mit proprietärer Software wie Imaris einsetzbar. Dieses Protokoll kann auch auf eine Vielzahl von Physiologie und beschränkt sich nicht auf Mikroglia aber angewandt werden, um jede Zelle oder eines Gewebes mit bestimmten Mustern oder Formen, die mit IHC Methoden identifiziert werden können. Mit ausreichender Stichprobengröße kann schließlich eine Multivariate oder Cluster-Analyse angewendet werden, um Schichten Mikroglia nach Morphologie12,21; Dies ist sinnvolle Informationen wie Mikroglia Morphologie ein wichtiger Indikator der Mikroglia Funktionen und Reaktionen auf ihre Umgebung ist. Die Wertschätzung für die Mikroglia morphologische Vielfalt ist expandierenden und zum Verständnis wichtig Neuron-Glia-Kreislauf Interaktionen in Gesundheit und Krankheit. Wachstum in diesem Bereich wird ergänzt durch gut ausgebaute, einfach zu bedienen und reproduzierbare Protokolle zu quantifizieren und Mikroglia Morphologie mit mehreren kontinuierlichen Variablen zusammenfassen.

Mikroglia haben eine sofortige und vielfältigen morphologischen Antwort auf Veränderungen im Gehirn Physiologie1 entlang eines Kontinuums von Möglichkeiten dieses Bereichs von hyper-Verzweigung und hochkomplexe Morphologien, de-verzweigten und amöboiden Morphologien2 . Mikroglia kann auch polarisiert und stabförmige3geworden. Mikroglia Zelle Verzweigung wird im Allgemeinen als eine komplexe Form mit mehreren Prozessen definiert und wird oft als die Anzahl der Endpunkte pro Zelle und die Länge der Zelle Prozesse berichtet. Da Mikroglia sind abgestimmt auf neuronalen und Gliazellen Funktion durch kontinuierliche Zellezelle Übersprechen und in Vivo Motilität4,5, können als Indikatoren für verschiedene Zellfunktionen und Dysfunktionen Mikroglia Morphologien dienen. im Gehirn. Ein quantitativer Ansatz ist notwendig, um die Vielfalt dieser morphologischen Veränderungen angemessen zu beschreiben und die Unterschiede zwischen den verzweigten Zellen zu unterscheiden, die mit subtilen physiologische Störungen (z. B. Epilepsie5,6 auftreten und Gehirnerschütterung7) zusätzlich zu grobe Verletzungen (z. B. Takt8). Ein vermehrter Einsatz von Morphologie Quantifizierung7,8,9,10,11,12,13,14 zeigen die ganze Vielfalt der Mikroglia Morphologien in Gesundheit und Krankheit. Die vorliegende Studie Details der schrittweise Einsatz von ImageJ Plugins notwendig, Mikroglia Morphologie von Leuchtstofflampen oder nicht-fluoreszierende Vergößerung der Mikroglia zusammenfassen in festen Nagetier Gewebe nach Immunhistochemie (IHC) erworben.
Im Mittelpunkt stehen, die Analyse-Techniken, die hier beschriebenen die ImageJ Plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, entwickelt im Jahr 2010 auf große Mamma Strukturen, zu quantifizieren und FracLac16, entwickelt im Jahr 2014 auf ImageJ und Fraktal-Analyse zu integrieren einzelnen Mikroglia Formen zu quantifizieren. Diese Plugins bieten eine schnelle Analyse der Mikroglia Verzweigung im gesamten Mikrofotos oder mehrere Mikroglia einen definierten ROI innerhalb einer Mikrophotographie. Diese Analyse kann alleine oder in Ergänzung mit Fraktalanalyse verwendet werden. Die einzelligen Fraktalanalyse (FracLac) erfordert eine Investition von Zeit, sondern bietet mehrere Morphologie Ausgaben bezüglich Mikroglia Komplexität, Form und Größe. Die Verwendung beider Tools ist nicht überflüssig, als Zelle Verzweigung ist komplementär zur Zelle Komplexität und die Kombination von mehreren Parametern verwendet werden, zu unterscheiden zwischen verschiedenen Mikroglia Morphologien in Datasets12,17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">primary antibody anti-IBA1</td>
			<td style="width:173px;">Wako&#160;</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td style="width:167px;">rabbit host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield soft mount</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunorResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>donkey host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 mL glass vial</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>UX-08923-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

Mikroglia sind Gehirn Fresszellen, die im Gehirn Homöostase teilnehmen und kontinuierlich vermessen ihr Umfeld für Funktionsstörungen, Verletzungen und Krankheiten. Als die first Responder Mikroglia haben wichtige Funktionen, Neuronen und Glia Dysfunktion zu mildern, und in diesem Prozess durchlaufen sie eine breite Palette von morphologischen Veränderungen. Mikroglia Morphologien können deskriptiv eingestuft werden oder alternativ als eine kontinuierliche Variable Parameter wie Zelle Verzweigung, Komplexität und Form quantifiziert werden können. Während Methoden zur Quantifizierung der Mikroglia auf einzelne Zellen angewendet werden, gelten einige Techniken für mehrere Mikroglia in eine gesamte Mikrophotographie. Der Zweck dieser Methode ist, mehrere zu quantifizieren und Einzelzellen mit leicht verfügbaren ImageJ-Protokolle. Dieses Protokoll ist eine Zusammenfassung der Schritte und ImageJ Plugins empfohlen, Fluoreszenz und Hellfeld Vergößerung in repräsentativen binäre und skelettierten Bilder umzuwandeln und zu analysieren mit Software-Plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) und FracLac für die Datenerfassung der Morphologie. Die Ausgänge dieser Plugins zusammenfassen Zellmorphologie Prozess Endpunkte, Kreuzungen, und Länge sowie Komplexität, Zelle Form und Größe Deskriptoren. Das Skelett Analyse Protokoll beschriebenen eignet sich gut für eine regionale Analyse von mehreren Mikroglia innerhalb eines gesamten Mikrophotographie oder Region of Interest (ROI), während FracLac eine ergänzende individuelle Zellanalyse bietet. Kombiniert, sieht das Protokoll ein objektives, sensible und umfassende Bewertungswerkzeug, das verwendet werden, um zwischen vielfältigen Mikroglia Morphologien im Gehirn gesund und Verletzten zu Schichten.

Die Mikroglia Morphologie Analyseprotokolle beschriebenen zusammenfassen Schritte bei der Bearbeitung von Leuchtstofflampen und DAB Mikrofotos für morphometrische Analyse hilfreich. Diese Schritte werden in Abbildung 2 optisch zusammengefasst und Abbildung 3. Das Ziel dieser Schritte ist ein repräsentatives Bild der binären und skelettierten erstellen, das entsprechend der ursprünglichen Mikrophotographie Modelle, so dass die angesammelten Daten gültig sind. Nach Protokoll Anwendung ergeben das AnalyzeSkeleton-Plugin tagged Skelett Bilder aus denen die Anzahl der Endpunkte und Zweig (dh., Prozess) Lengthcan von daraus resultierenden Ausgabedateien zusammengefasst werden. Endpunkte und Länge Prozessdaten werden dann verwendet, um das Ausmaß der Mikroglia Verzweigung in der Mikrophotographie oder ROI zu schätzen. Abbildung 4 fasst die resultierenden Daten (Endpunkte und Prozess/Länge/Zelle) mit und ohne Protokoll Anwendung. Während ähnliche Tendenzen vorhanden sind, sind die Daten zusammengefasst in Abbildung 4F weniger Variable als in Abbildung 4E. Diese Daten veranschaulichen darüber hinaus erhöhten Empfindlichkeit zur Erkennung Unterschiede zwischen den Gruppen, wenn das Protokoll angewendet wird. Zu guter Letzt muss darauf geachtet werden, über Inter Benutzer Variabilität in der Anwendung des Protokolls. Solche Unterschiede sind in Abbildung 5 zusammengefasst wo demselben Datensatz durch zwei unabhängige Benutzer, die Anwendung eines identischen Protokolls wie oben zusammengefasst analysiert wurde.
Zusätzliche Morphologie Daten werden aus einzelnen Zellen isoliert von den binären Bildern während der Protokoll-Anwendung erstellt. Die Protokoll-Schritte zu analysieren, Mikroglia Morphologie vor und mit das FracLac-Plugin sind in Abbildung 6zusammengefasst. Wir illustrieren diese Analyse in beide unverletzt (Abb. 6A) und (Abb. 6 b) Gewebe verletzt. Repräsentative Bilder von binären, skizzierte, konvexen Rumpf/Verkapselung Kreis und Feld zählen Beispiele für jede Zelle analysiert mit und ohne das Protokoll Anwendung sind in Abbildung 6–F. Diese Bilder helfen, die Ursprünge der Unterschiede in der Morphologie Daten veranschaulichen, die in Abbildung 6zusammengefasst sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> Abbildung 1: Abbildungen der skelettierten Mikroglia mit einer kreisförmigen Soma (suboptimale) im Vergleich zu einem einzigen Ursprung Soma (optimal) und die entsprechende Überlagerung zwischen der skelettierten Zelle und die ursprüngliche Mikrophotographie. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> Abbildung 2: Protokoll Anwendung auf fluoreszierende oberflächenmustern. Abbildungen des Protokolls Skelett Analyse auf eine fluoreszierende Mikrophotographie mit einer einzelnen Zelle angewendet abgeschnitten, um Details anzuzeigen. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> Abbildung 3. Protokolls Anwendung Hellfeld DAB oberflächenmustern. Abbildungen des Protokolls Skelett Analyse angewendet, ein Hellfeld DAB Mikrophotographie mit einer einzelnen Zelle beschnitten, um Details anzuzeigen. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> Abbildung 4. Datenanalyse mit und ohne Protokoll Anwendung. (A) ein Beispiel Mikrophotographie fluoreszierende IHC und beschnittenen Zelle, die den gelben Kasten unter (B). Binäre und skelettierten Beispielbilder mit (C) und ohne (D) das Protokoll angewendet wie beschrieben. Zusammenfassung der Daten der Mikroglia Endpunkte und Prozess/Länge/Zelle in unverletzt (weiß) und verletzte (grau) kortikalen Gewebe mit (E) und ohne (F) das Protokoll angewendet. Statistische Analyse mit Hilfe des Student t-Test und n = 3, ** p < 0,01 bezeichnet. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> Abbildung 5. Benutzer-Unterschiede mit Protokoll Anwendung. Ein Beispiel für ein original Bild und Protokoll Umstellung auf binäre und Skelett Bilder von Benutzer 1 und Benutzer 2. Unterschiede zwischen den beiden Bildern sind mit passenden farbigen Kreise hervorgehoben. Zusammenfassende Graphiken von Mikroglia Endpunkte/Zelle und Prozessdaten Länge/Zelle in unverletzt und Geschädigten Hirnregionen von Benutzer 1 und Benutzer 2. Statistische Auswertung ANOVA mit Probe beträgt n = 3; p < 0,05, **p < 0,01 ***p < 0,001. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> Abbildung 6. Fraktalanalyse mit und ohne Protokoll Anwendung. Beispiel für verkürzte Vergößerung der Mikroglia im unverletzten (A) und verletzte (B) Kortex mit entsprechenden binären (C) und Gliederung (D) Bilder, die mit und ohne das Protokoll angewendet ergeben. Die damit verbundenen konvexe Hülle (blau) und umschließenden Kreis (rosa) für die entsprechende Kontur Formen (E) werden verwendet, um Form Dichte berechnen, erstrecken sich über Verhältnis und Zirkularität (G). Feld Zählmethode ist illustriert (F) und für die Fraktale Dimension (D-B) und Lacunarity (λ) Berechnungen (G) verwendet. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Mikroglia sind immun Gehirnzellen, die Umfrage und reagieren auf veränderte Gehirnphysiologie durch morphologische Veränderungen, die quantitativ ausgewertet werden kann. Dieses Protokoll beschreibt eine ImageJ basierte Analyse Protokoll, Mikroglia Morphologie als kontinuierliche Daten nach Metriken wie Zelle Verzweigung, Komplexität und Form darzustellen.

Quantifizierung der Mikroglia Morphologie von Mikrofotos von Immunohistochemistry vorbereitet Gewebe mit ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

quantifying-microglia-morphology-from-photomicrographs

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

65.9K Aufrufe.  University of Arizona. Mikroglia sind immun Gehirnzellen, die Umfrage und reagieren auf veränderte Gehirnphysiologie durch morphologische Veränderungen, die quantitativ ausgewertet werden kann. Dieses Protokoll beschreibt eine ImageJ basierte Analyse Protokoll, Mikroglia Morphologie als kontinuierliche Daten nach Metriken wie Zelle Verzweigung, Komplexität und Form darzustellen.

Serie: Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Forschung

Neurowissenschaften

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Selektive Depletion von Mikroglia von Kleinhirn-Körnerzellkulturen Mit L-Leucin-Methylester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during development, homeostasis, and disease. Although macrophages have been studied in detail for decades, specialized features of microglia, the tissue-resident macrophages of the CNS, have remained largely mysterious, in part due to limitations in the ability to recapitulate mature microglial properties in culture. Here, we illustrate a straightforward procedure for the rapid isolation of pure microglia from the mature rodent brain. We also describe serum-free culture conditions that support high levels of microglial viability over time. Microglia cultured under these defined-medium conditions exhibit elaborate ramified processes and dynamic surveillance behavior. We illustrate some effects of serum exposure on cultured microglia and discuss how these serum-free cultures compare to both serum-exposed cultures as well as microglia in vivo.

Efforts to understand microglial function in detail have been hindered by the lack of microglial culture models that recapitulate the properties of mature in vivo microglia. This protocol describes an isolation and culture approach designed to maintain robust survival of highly ramified mature rat microglia under defined-medium conditions.

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Luzifer gelben Iontophorese

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.