Bu eser Sheila ve David Fuente Nöropatik ağrı araştırma programı yüksek lisans bursu (için J.M.B.) tarafından desteklenmektedir, Lois Pope LIFE Fellows programı (CL, Y.Z. ve J.M.B. için) Snyder-Robinson Vakfı HGUGM Bursu (için CL), Dr. John T . Macdonald Vakfı (na CL), (için R.G.Z.), Ulusal Enstitüleri (NIH) sağlık HHSN268201300038C, R21GM119018 ve R56NS095893 gelen hibe sözleşmeleri ve Taishan bilim adamı projeye (Shandong Eyaleti, Çin Halk Cumhuriyeti) (R.G.Z.) tarafından.

1. dikkat edilmesi gereken noktalar ve görüntü analiz deney tasarımı için hazırlıklar
<ol><li>Örneğin 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), membran işaretleri, yerelleştirilmiş floresan kazanmakla uygun anatomik, cep veya farklı örnekler üzerindeki bir bölge (ROI) ilgi standartlaştırılması için simge olarak hizmet için hücre altı işaretleyicileri protein, vb
</li>
	<li>Ayrık puncta faiz yapısı için arka plan düzeyleri ötesinde sınırlandırabilirsiniz bir floresan işaretleyiciyi seçin. Not: Bu protokol proteinaceous yapıları (Örneğin, misfolded protein toplamları) ve membran bağlı organelleri (Örneğin, autophagy muhabir) için optimize edilmiştir. Protein toplama görselleştirmek için kullanılan5insan Htt proteini bir RFP öğesini N-terminal parçası 138 yineler (RFP-hHttQ138) bir patojen polyQ yolu ile yapıldı. Mutant Htt protein elav GAL45,6gibi nöronal belirli sürücüleri altında ifade sitoplazmik toplamları oluşturur. Aktin-GAL4 autophagosome-lysosome akı görselleştirmek için ubiquitously ifade bir tandem mCherry-GFP-Atg8a muhabir sürücü için kullanıldı. mCherry ve GFP pozitif puncta gösterir autophagosomes ve GFP floresans bozulmuş7proteindir kadar nerede asit-duyarlı mCherry kalır lysosome, asidik ortamda söndürülür gibi akı izlenir. Ratiometric analiz için tutarlı bir belirtecidir yapısı tek bir kanal bölümleme için kullanılan, veya yine de açıkça açıklanan bu protokol için uygunsa, iki veya daha fazla kanalı bir projeksiyon yapıları, betimlemek için kullanılabilir. Örneğin, asit-duyarlı ve akı ile yol boyunca yerde kalacaktır gibi mCherry Atg8 pozitif parçacıklar, bölümleme için kullanılır.</li>
	<li>Açık kaynak görüntü analiz platformu ImageJ veya Fiji karşıdan yükleyip — eklentileri2,3ImageJ ile tercih edilen dağıtım birlikte.</li>
	<li>H-maxima etkileşimli dönüm noktası için eklenti. Not: Fiji bu iletişim kuralını kullanır; ek eklentileri ImageJ için gerekli olabilir. Benoit Lombardot SCF-MPI-CBG için tarafından geliştirilen eklenti kullanılabilir çevrimiçi (https://imagej.net/Interactive_Watershed) olur.</li>
	<li>Gidin "yardım | Güncelleştirmek", seçmek"Yönet güncelleştirme siteleri""ImageJ Güncelleyici"dan SCF-MPI-CBG update sitesini listeden seçin ve sonra kapatın ve Fiji yeniden başlatın.</li>
</ol>2. beyin diseksiyon ve ayirt boyama
<ol><li>
Silikon elastomer kaplı diseksiyon yemekleri yapmak.
	<ol>
<li>Silikon elastomer bileşenleri bir ölçek üretici ve iyice karışık kadar heyecan tarafından belirtildiği şekilde dökün.</li>
		<li>5 cm doldurmak için bir pipet kullanın doku kültürü yemekleri üçte biri yarısına tam (yaklaşık 10 mL elastomer karışımı). Yüzeye çıkmak ve kağıt mendil ile yavaşça kaldırmak için herhangi bir baloncuklar izin. Bulaşıkları kapak ve 48-72 saat oda sıcaklığında (RT) tedavisi için düzey bir yüzeye koyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kopyalayabilmek Drosophila beyin ve gerekirse görsel sistem.
	<ol>
<li>Drosophila beyin diseksiyon yukarıda açıklanan8,9olarak gerçekleştirin. Diseksiyon elastomer kaplı diseksiyon yemekleri, zarar verici doku veya forseps önlemek için beyin dengelemek için bir elastomer alt kullanarak gerçekleştirin.</li>
		<li>Lamina diseksiyon sırasında korumak için iki forseps retina altında slayt ve yavaşça retina kaldırmak için göz ortasından yırtıyorsun. Lamina yüzeyine paralel düzenlenen forseps ile lamina için bağlı retina herhangi bir doku uzağa çek. Not: Artık pigment aşağıdaki adımlarda yıkayın ve genellikle boyama ve görüntüleme antikor ile müdahale değil.</li>
		<li>Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (% 3.7 son bir konsantrasyon içinde 500 µL microcentrifuge tüp kullanmadan önce taze yapmak için PBS) içinde formaldehit % 37 oranında seyreltin. Microcentrifuge tüp düzeltme çözümü ile disseke beyin aktarmak ve hafif sallanan ile 15 dakika RT, kuluçkaya. Not: Formik asit üreten formaldehit okside doğal bir eğilim vardır. Bu nedenle, aliquot %37 formaldehit depolama için önerilen ve sulu taze her kullanımdan önce % 3.7 için. Aşırı fiksasyon veya altında fiksasyonu doku ve floresan10bütünlüğünü etkileyecektir.</li>
		<li>3 kez ile PBTx yıkama (PBS % 0,4 ile Triton X-100) 15 dakika.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İmmünhistokimya gerçekleştirmek ve numuneler monte edin.
	<ol>
<li>Antikor boyama gerekirse PBTx kaldırmak, birincil antikor PBTx içinde % 5 normal keçi serum ile seyreltilmiş eklemek ve gecede 4 ° C'de aliquot bir karıştırıcı üzerinde kuluçkaya</li>
		<li>Birincil antikor kaldırmak ve 3 kez 15 dk her PBTx ile yıkayın. İkincil antikor PBTx içinde % 5 normal keçi serum ile seyreltilmiş ekleyin ve RT, 1 h için kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de 3 kez 15 dk her PBTx ile yıkayın.</li>
		<li>DAPI boyama gerekirse PBTx kaldırmak, DAPI çözüm eklemek (stok çözüm: 5 mg/mL, seyreltik bir çalışma konsantrasyonu PBTx 15 µg/ml) ve 10 dakika dik yıkama 15 dakika PBTx ile 3 kez kuluçkaya.</li>
		<li>Doku temizlemek için bir damla montaj orta mikroskobu slayt merkezi rondela açık teyp her iki tarafta bir tabaka ile üzerine yerleştirin. Beyin üzerine montaj orta damla aktarmak ve beyin saydam hale gelene kadar için 1-2 dakika bekleyin. Bir pipet ile montaj orta dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
		<li>Takmak için slayt üzerinde taze montaj orta beyin üzerine bir damla uygulanır. Dikkatle kabarcıklar kaçınarak bir cam kaplar. Kenarları kauçuk çimento ile mühür ve 20 dk. devam etmek için resim alma en iyi sonuç için RT kuruması.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. resim alma
<ol><li>Dahil olmak üzere uzamsal çözünürlük, amaç, zoom, tarama hızı, mikroskop satın alma parametrelerini optimize etmek ve boyutu görüntü analizi sırasında yarı otomatik bölümleme kolaylaştırmak için çözünürlük ilgi yapıların en üst düzeye çıkarmak için adım. Not: Bir örnek görüntü yakalama ve yarı otomatik bölümleme (içinde adım 5 Bu protokol) tüm deneysel örnekleri Imaging önce sınamak yararlı olabilir. Böylece analitik araçlar ilgi biyolojik yapısını kolayca ayırt edebilirsiniz bu şekilde Kullanıcı görüntüleme ayarlarını yapın.</li>
	<li>
En yüksek sinyal gürültü oranı ve yüksek dinamik Aralık örnek yakalamak için görüntü algılayıcısı kontrolleri ayarlayın.
	<ol>
<li>Piksel Doygunluk (pozlama çok yüksek) veya (Şekil 3B, kırmızı bir Hi-Low LUT tarafından piksel doygunluk gösterir) ayarlarını yapma sırasında undersaturation (sapma çok düşük) gösterir bir LUT (tablo arama) kullanın.</li>
		<li>Deneysel manipülasyonlar olası faiz yapısı olarak kazanç ve mahsup hesabı ayarları tüm deneysel grupları için uygun olduğunu doğrulayın. Not: Aynı ayarları tüm gruplar için nicel karşılaştırma yapmak için kullanılır zorunludur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm verileri elde etmek için doku görüntü. Not: Kullanılabilir verilerin tümünü bir görüntüleme oturumu sırasında yakalamak ve gerekirse 4. adımda ROI seçimi sırasında daha kesin bir alanını tanımlamak için önerilir.</li>
	<li>Edinme parametreleri ve kayma kalibrasyon gibi meta verileri korumak için düşsel bilgisayar yazılımı tarafından desteklenen dosya türü olarak kaydetmek. Görüntü deneysel Tarih, genetik arka plan ve floresan gazetecilere, antikorlar da dahil olmak üzere bir dosya adıyla kaydedin veya kanallara karşılık gelen boyalar taranan [deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _Ch1. gibi [Fluorophore-hedef /Dye]_Ch2.[fluorophore-Target/dye], vb
</li>
</ol>4. Fiji/ImageJ görüntü alma ve yatırım getirisi seçimi
<ol><li>Bir görüntüyü Fiji'de açın. "Bio-formatları içe aktarma seçenekleri" iletişim kutusu, seçmek "görünümü yığınıyla: Hyperstack" ve "renk modu: gri tonlama". Not: Bu kayma kalibrasyon Fiji okuyabilir gibi meta veriler olarak mikroskop dosya türünü açmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>
Bir alanı tek bir z uçağı veya standart bir yatırım getirisi örnekler arasında (Şekil 1, yatırım getirisi seçimi) kullanılabilir işaret kanal (lar) temel alan bir projeksiyon tanımlayın.
	<ol>
<li>1.1. adımda belirlenmiş marker(s) yakalamak için kullanılan kanal (lar) görüntülemek için "C" kaydırma çubuğunu kullanın.</li>
		<li>Odak uçaklar taşımak için "Z" kaydırma çubuğunu kullanın. Tek bir dilim seçin veya birden çok dilim bir projeksiyon tıklatarak oluşturun "görüntü | Yığınlar | Z Projesi"ve set"Başlat dilim"ve"Stop dilim"ROI kapsayacak şekilde. Not: "projeksiyon türü ayarı" olsa bu tüm uygulamalar için uygun olmayabilir "Max şiddeti" "Z Projesi" iletişim kutusu genellikle en iyi yapıları için bölümleme Bölüm 5 ' daki vurgulamak için uygundur. Başka tür bir projeksiyon analizi için gerekliyse, kaydetmek ve bu nedenle Bölüm 6 ve/veya 7 özellik çıkarma için bu dosya belge için özen gösterin.</li>
		<li>Kanal (lar) ve görüntü analizi iletişim kuralı aşağıdaki adımları basitleştirmek ilgi odak plane(s) içeren yeni bir resim oluşturur. Seçin "görüntü | Yinelenen", istenen"Kanallar"(c) ve"Dilim"(z) ayarlayabilir ve değiştirebilirsiniz (Örneğin, [deneysel grup adı] _ [örnek adı] [deneme date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]). seçiminizi yansıtmak için dosya adı</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir "seçim araçları" Fiji araç çubuğundaki el ile standart bir yatırım getirisi 4.2. adımda belirlenen seçim ölçütlerine dayanarak seçmek için kullanın.</li>
	<li>ROI ROI Yöneticisi'ne tıklayarak ekleme "Analyze | Araçlar | ROI Yöneticisi "ve"Ekle"ROI Yöneticisi menüsünde'ı tıklatın. ROI ROI Yöneticisi menüsünden tıklatarak kaydedin "daha | Kaydetmek"ve ROI yansıtmak için dosya adı (Örneğin, [deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanal] _ [z-plane(s)] _ [ROI Açıklama]). Not: Bu Fiji'de daha sonraki analizler için açılabilir veya diğer kanalları veya olduğu gibi Bölüm 5.3 görüntü uygulanabilir.</li>
</ol>5. ön işleme ve segmentasyon h-maxima Watershedding ile
<ol><li>
Faiz yapılarının yakalamak için kullanılan kanal ön işleme gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Resim dosyasının birden çok kanal oluşuyorsa, tıklatarak kanalları ayırmak "görüntü | Renk | Kanalları Böl"kanal ilgi izole etmek.</li>
		<li>Gürültü veya tıklatarak düzeltme için Gauss Bulanıklığı azaltmak için bir Medyan filtresi gibi bir filtre uygula "süreci | Filtreler | "Filtre türü" (Örneğin, "Medyan filtresi" veya "Gaussian Blur").<ol>
<li>Farklı filtre tadın ve parametreleri imge--dan her deney grubu üzerinde filtre uygulayabilirsiniz. Adımda 6.2 bölümleme performansını kontrol etmek için her grup temsil edici bir örnek ile devam edin. Filtre ve segmentasyon ilgi yapıların kolaylaştırmak ayarlarını seçin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Filtre ve ayarları kaydedin. Bu parametreler deneysel grupları arasında geçerlidir.</li>
		<li>Başvuru için uygulanan filtre kapsayan bir TIFF dosyası olarak görüntünün bir kopyasını kaydedin. [Deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanal] _ gibi detaylı bir ad kullanın [z-plane(s)] _ [süzgeç parametreleri ile].</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Segmentasyon yapıları etkileşimli h-maxima dönüm noktası aracı ile ilgi oluşturulan ve 5.1. adımda kaydettiğiniz Önişlenmiş görüntü üzerinde gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Fiji'de etkin Önişlenmiş görüntü ile h-maxima etkileşimli havza aracı tıklatarak başlatmak "SCF | Etiketleme | Etkileşimli H_Watershed". Not: Bu eklenti ilk dönüm noktası hesaplar ve yerel maxima ve segmentasyon bir anında Güncellenme Zamanı çıkış görüntü yoluyla eşik seçenekleri etkilerini araştırmak kullanıcının izin verir.</li>
		<li>Denetim Masası'ndan, tohum dinamikleri (s), yoğunluğu eşik (T) ve en yüksek (%) bölümleme optimize etmek için sel ayarlayın. Not: Her zaman raw resim bölümü el ile ilgi yapıların bölümleme performansını incelemek için 4.2 ön işleme önce bakın.</li>
		<li>Segmentasyon sonuçlardan memnun, "bölgeler maske ver"'i seçin ve "Dışa aktar" ı seçin. Bu dönüm noktası sonuçları (Şekil 1, bölümleme) ikili bir görüntüsünü oluşturur.</li>
		<li>Segmentasyon parametreleri kayıt; Bu parametreler nicel karşılaştırmalar için deneysel grupları genelinde uygulanması gereken. İkili sonuçlar maskesi için başvuru adı [deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanallar] _ gibi ayrıntılı segmentasyon parametrelerle istenirse kaydeder [z-plane(s)] [süzgeç parametreleri ile] _ [H_Watershed parametreleri].</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Faiz yapılarının havza sonuçlarından ayıklayın.
	<ol>
<li>Kaydedilmiş ROI adım 4.4, ROI Yöneticisi'nde açın. Adım 5.2.4'ten aktif ikili bölgeleri maskeyle ROI ROI Yöneticisi özellik çıkarma Standart yatırım getirisi için sınırlamak için resme uygulamak için seçin.</li>
		<li>Yatırım getirisi üzerinde ikili dönüm noktası maskesi etkin ile seçin "Analyze | Parçacıklar "Eklemek için Yöneticisi ile" özellikleri ayıklamak için iletişim kutusunda seçilen analiz". Not: Bu segment için yatırım getirisi Yöneticisi sırasında belirlenen her yapısı için bir parçacık tanımlayıcı ekler. Boyutu veya Analize dahil yapıları iyileştirmek için gerekirse Döngüsellik temel özellikleri dışlamak için bu menüdeki seçenekler kullanılabilir.</li>
		<li>Parçacıklar tıklayarak kaydetmek "daha | «««Kaydet"ROI Yöneticisi menüsünden. Tanımlayıcıları seçili ve tüm parçacıklar tek bir zip dosyasında kaydedilir sağlamak. [Deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanallar] _ gibi detaylı bir ad kullanın [z-plane(s)] _ [süzgeç parametreleri ile] _ [H_Watershed parametreleri] _ [yapıları].</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. miktarı, alan ve yoğunluk miktar ve analiz
<ol><li>Oluşturulan ve 4.2. adımda kaydettiğiniz raw resim açın. Faiz yapılarının yakalamak için kullanılan kanala ilerleyebilir. Not: Yoğunluk ölçümleri Ham görüntü (ön işleme önce) piksel değerlerini filtre adım 5.1 değişiklikleri uygulama olarak almak için önemlidir.</li>
	<li>Özellik çıkarma 5.3. adımda elde edilen parçacıklar açın ve "Tümünü göster" ROI Yöneticisi'nden seçin. Not: Bu eylem her parçacık "ROI Yöneticisi hakkında" görüntü üzerine bir taslağını yerleşimi ve ilgi (Şekil 1, özellik çıkarma) yapıları kenarları aynı olmalıdır.</li>
	<li>Tıklatarak istediğiniz ölçüleri ayarlayın "Analyze | Ölçümleri kümesi?". Not: Alan, yoğunluk ve parçacık yoğunluğu "alan" ve "entegre yoğunluk" seçerek ölçülebilir. Entegre yoğunluk seçildiğinde, Fiji iki değer üretecek: 'yoğunluğu entegre' hesaplanan alan ve ortalama gri değeri ve 'Ham yoğunluk piksel değerlerinin toplamı olarak ölçülen entegre' ürün olarak. Parçacıklar floresan protein yoğunluğu alanına göre bölünmüş piksel değerlerinin toplamı olarak hesaplanır. 5.3. adımda oluşturulan parçacıklar ROI 4.4. adımda tanımlanan doku içinde parçacıkların miktarı gösterir.</li>
	<li>"Ölçü" ROI Yöneticisi menüsünden seçin. Fiji'de görüntüleme yazılımdan türetilen dosya ölçümler alınır sürece sonuçları kalibre birimler cinsinden ifade edilir. Sonuçları sonuçları penceresinden kopyalayın ve derleme ve daha fazla hesaplamalar için elektronik tablo yazılımı içine yapıştırın.</li>
</ol>7. Ratiometric miktar ve veri analizi
<ol><li>6.1 ve 6.2 parçacık tanımlayıcıları ilgi ilk ham kanal açmak için adımları izleyin.</li>
	<li>Tıklatarak istediğiniz ölçüleri ayarlayın "Analyze | Ölçümleri kümesi?". Not: Parçacık başına ortalama yoğunluğu "Demek gri değeri" seçerek ölçülebilir.</li>
	<li>ROI Yöneticisi'nden "Ölçü birimi" seçin. Sonuçları penceresinden veri kopyalama ve elektronik tablo yazılımı yapıştırın.</li>
	<li>"C" kaydırma çubuğu ilgi, GFP (Şekil 4A), bu örnekte ham ikinci kanala geçin ve adımları 7.2. ve 7.3. Not: 5.3. adımda kaydettiğiniz parçacıklar kanal ve dilim oluşturulan varsayılan olacaktır. Parçacıklar faiz doğru kanala uygulanır sağlamak için özen gösterin.</li>
	<li>Bir kanaldan yoğunluğu içinde elektronik tablo yazılımı her parçacık saniyeliğine yoğunluğu için oranını hesaplamak.</li>
	<li>
Bir dağılım çizim görselleştirmek ve kişisel değişiklikler temel biyolojik süreçleri yansıtıcı sergi fluorophores ratiometric verileri ölçmek için kullanın.
	<ol>
<li>Bir dağılım çizim grafik yazılımı oluşturmak. Not: Her bir veri noktası burada ilk fluorophore ilgi yoğunluğunu "x değeri", ikinci fluorophore yoğunluğunu "her parçacık ölçülen y değeri" faiz yapısını temsil eder.</li>
		<li>Çeyrek dairelerin tanımlamak her fluorophore için eşikler çoğunluğuna ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fluorophore yoğunluğu faiz yapısı arasında görselleştirmek için satır profili kullanın.
	<ol>
<li>5.3. adımda oluşturulan bir yatırım getirisi seçin ve yatırım getirisi ile düz bir çizgi çizmek için araç çubuğunda düz çizgi aracını kullanın. Hat yatırım getirisi yatırım getirisi Yöneticisi'ne ekleyin.</li>
		<li>Her kanal hattı aktif, yatırım getirisi ile ilgi için seçin "Analyze | «««Çıkart"profili. Not: Arsa profil işlev bir çubuk grafik arsa ve hat boyunca yoğunluk değerlerinin bir tablosu üretir. Her kanal ve hamur içine her iki kanal hattı boyunca gösterilen bir çizim oluşturmak için elektronik tablo yazılımı üzerinden ölçülen sonuçlar kopyalayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Erkkinen, M. G., Kim, M. -. O., Geschwind, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Neurology+and+Epidemiology+of+the+Major+Neurodegenerative+Diseases.">Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671 (2012).</li><li>Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+to+monitor+autophagy+in+Drosophila.">Assays to monitor autophagy in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 134-139 (2014).</li><li>Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -. C. M., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+aggregation+kinetics+and+their+pathological+role+in+a+Drosophila+Huntington's+disease+model.">Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model.</a> Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain.">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).</li><li>DeVorkin, L., Gorski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+autophagy+in+Drosophila+using+fluorescent+reporters+in+the+UAS-GAL4+system.">Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).</li><li>Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+adult+Drosophila+brains.">Dissection of adult Drosophila brains.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+fixation.">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).</li><li>Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optic+lobe+of+Drosophila+melanogaster.+I.+A+Golgi+analysis+of+wild-type+structure.">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).</li><li>Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+Drosophila+Nmnat+functions+as+a+switch+to+enhance+neuroprotection+under+stress.">Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress.</a> Nature Communications. 6, 10057 (2015).</li><li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAD+synthase+NMNAT+acts+as+a+chaperone+to+protect+against+neurodegeneration.">NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration.</a> Nature. 452 (7189), 887 (2008).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermine+synthase+deficiency+causes+lysosomal+dysfunction+and+oxidative+stress+in+models+of+Snyder-Robinson+syndrome.">Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome.</a> Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).</li><li>Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+structure+of+synaptic+contacts+in+Drosophila.">Development and structure of synaptic contacts in Drosophila.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).</li><li>Maday, S., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+biogenesis+in+primary+neurons+follows+an+ordered+and+spatially+regulated+pathway.">Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway.</a> Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).</li><li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker.">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li><li>Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+lysosomal+dysfunction+causes+cargo-specific+deficits+of+axonal+transport+leading+to+Alzheimer-like+neuritic+dystrophy.">Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy.</a> Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).</li><li>Vincent, L., Soille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watersheds+in+digital+spaces:+an+efficient+algorithm+based+on+immersion+simulations.">Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis &amp; Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).</li><li>Najman, L., Schmitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geodesic+saliency+of+watershed+contours+and+hierarchical+segmentation.">Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation.</a> IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).</li><li>Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification+and+characterization+of+intracellular+protein+aggregates+in+yeast.">Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast.</a> Prion. 8 (3), 276-284 (2014).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada özetlenen Protokolü sağlam ve tekrarlanarak hücre biyolojik süreçlerin floresans tabanlı görüntüleme tarafından görüntülenmiştir quantitate için kullanılabilir. Biyolojik bağlam ve teknik sınırlamalar deneysel tasarım kılavuzunu dikkatle dikkate alınması gerekir. İlgi, hücre altı yapıları floresan işaretleri immunohistokimyasal, boya tabanlı veya genetik olarak ifade edilen, Morfoloji ve yoğunluğu tarafından arka plan üzerinde ayırt olmak gerekmediğini. UAS/GAL4 sistem...

Nörodejeneratif hastalıklar her yıl milyonlarca insan etkiler ve bir yaşlanma nüfus1ile görülme sıklığı artmaktadır. Her nörodejeneratif hastalık benzersiz bir etiyoloji olsa da, toplama misfolded proteinlerin ve proteostasis ağ arıza bu hastalıkların çoğunun ortak patolojik işaretlerinden vardır. Nasıl bu temel ve birbiriyle ilişkili işlemler bozulma goes awry elucidating nöronal fonksiyon bozukluğu ve hücre ölümüne katkıda nörodejeneratif hastalıkları anlamak için hem de tedavi müdahaleler rehberlik çok önemlidir. Floresans tabanlı görüntüleme nöronlar karmaşık ve dinamik bu işlemlerde incelenmesi için izin verir ve büyük ölçüde nöronal hücre biyoloji anlayışımız katkıda bulunmuştur. Özellikle deneyler vivo içindeson derece kompakt doku, farklı hücre tipleri ve morfolojik heterojenite nedeniyle dışarı taşırlarken analiz fluorescently tagged proteinlerin zordur. El ile destekli miktar uygun fiyatlı ve basit, ama genellikle zaman alıcı ve tabi insan önyargı. Bu nedenle, çalışmalar Imaging ölçülebilir veri ayıklamak için tarafsız, tekrarlanabilir ve erişilebilir yaklaşımlar için bir ihtiyaç vardır.
Biz Fiji/ImageJ, güçlü ve serbestçe erişilebilir görüntü işleme yazılımı2,3, deneysel modelleri floresans görüntüleme çalışmaları nicel veri ayıklamak için kullanan basit ve uyarlanabilir bir iş akışı belirttiğimiz Drosophilakullanma ateş. Protein toplama ve autophagic akı ölçmek için bu iletişim kurallarını izleyerek — iki nörodejeneratif hastalık patolojiye son derece alakalı biyolojik özellikleri hücre — hassasiyet ve tekrarlanabilirlik bu yaklaşımın gösterdi. Drosophila optik lob fluorescently tagged mutant huntingtin (Htt) proteinlerin çözümleme sayısı, boyutu ve yoğunluğu protein toplamları ortaya. Tandem floresan muhabir autophagic akı compartmental çevre4bağlı olarak farklı emisyon sinyallerini görüntüler Drosophila görsel sistemi içinde görüntülenir. Ratiometric tabanlı analiz tandem muhabir autophagosome oluşumu, olgunlaşma ve taşıma autophagy-lysosome akı lysosome bozulması için nicel ve kapsamlı bir görünümünü için izin ve ayrıca savunmasız vurgulanmış nörodejeneratif koşullarda kesintiye bölmeleri. Önemlisi, biz bilinçsiz önyargı en aza indirmek için bizim protokolünde yarı otomatik eşik ve segmentasyon adımları hayata her iki analizlerde örnekleme gücünü artırmak ve benzer çalışmalar arasında karşılaştırma yapmayı kolaylaştırmak için bir standart sağlamak. Basit iş akışı güçlü Fiji/ImageJ eklentileri (matematik algoritmalarına dayalı bilgisayar mühendisleri tarafından geliştirilen) yapmak için tasarlanmıştır daha neurobiologists ve geniş yaşam bilimleri topluluğu için erişilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1102">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:347px;">SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:164px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td style="width:243px;">PF184250</td>
			<td style="width:349px;">Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:347px;">Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:243px;">351008</td>
			<td style="width:349px;">Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:243px;">11251-20</td>
			<td style="width:349px;">Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:243px;">S3014</td>
			<td style="width:349px;">PBS solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:243px;">S5136</td>
			<td style="width:349px;">PBS solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:243px;">P5655</td>
			<td style="width:349px;">PBS solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Triton&#160;X-100</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:243px;">T9284</td>
			<td style="width:349px;">Washing and antibody incubaton solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:243px;">10790-710</td>
			<td style="width:349px;">Fixation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:243px;">89000-022</td>
			<td style="width:349px;">Fixation, washing, and antibody incubaton.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Plain and Frosted Micro Slides (25&#215;75mm)</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:243px;">48312-004</td>
			<td style="width:349px;">Slides for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Micro Cover Glasses, rectangular (22&#215;40mm)</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:243px;">48393-172</td>
			<td style="width:349px;">Slides for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Rubber Cement</td>
			<td style="width:164px;">Slime</td>
			<td style="width:243px;">1051-A</td>
			<td style="width:349px;">Mounting</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:347px;">VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td style="width:164px;">Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:243px;">H-1000</td>
			<td style="width:349px;">Mounting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm&#215;25.4m)</td>
			<td style="width:164px;">3M Company</td>
			<td style="width:243px;">810</td>
			<td style="width:349px;">Mounting</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:347px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">PCN5000</td>
			<td style="width:349px;">Antibody incubaton</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:347px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">D1306</td>
			<td style="width:349px;">Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80&#176;C. Dilute to a working concentration of 10-20 &#956;g/mL in PBTx.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:347px;">3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope</td>
			<td style="width:164px;">AmScope</td>
			<td style="width:243px;">SM-1BNZ</td>
			<td style="width:349px;">Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">ImageJ/Fiji</td>
			<td style="width:164px;">NIH</td>
			<td style="width:243px;">v1.51u</td>
			<td style="width:349px;">With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope</td>
			<td style="width:164px;">Olympus</td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Construct</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:243px;">BL37749</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative cell biology of neurodegeneration in drosophila through unbiased analysis of fluorescently tagged proteins using imagej

Nörodejeneratif hastalıklar yükselen ve yaygınlığı ile giderek nöronal fonksiyon bozukluğu ve kaybına yol açan temel patofizyolojisi anlamak önemlidir. Henüz hala bir ihtiyaç için çalışmalar Imaging ölçülebilir veri ayıklamak için tarafsız, tekrarlanabilir ve erişilebilir yaklaşımlar floresans tabanlı görüntüleme araçları ve teknolojileri hücre altı nörobiyolojik süreçleri, benzeri görülmemiş analizini etkinleştirmek . Biz ateş Drosophila modelleri kullanarak floresans tabanlı görüntüleme çalışmaları sayısal veri ayıklamak için basit ve uyarlanabilir bir iş akışı geliştirdik. Özellikle, biz iki hücresel süreçler analiz etmek için Fiji/ImageJ kullanarak takip etmek kolay, yarı otomatik bir yaklaşımı açıklamak: ilk olarak, protein toplama içeriği ve profil Drosophila optik mutant floresan öğesini kullanarak lob ölçmek huntingtin proteinleri; ve ikincisi, Drosophila görsel sisteminde autophagy ratiometric tabanlı miktar bir tandem floresan gazeteci ile autophagy-lysosome akı değerlendirmek. Önemlisi, burada özetlenen iletişim kuralı tüm floresan yapıları seçim önyargı en aza indirmek için ve ince karşılaştırma çözünürlüğünü artırmak için analiz edilir emin olmak için bir yarı otomatik bölümleme adım içerir. Bu yaklaşım diğer hücre biyolojik yapıları analiz için uzatılabilir ve süreçleri de gibi membran bağlı bölmeleri içinde ateş, proteinaceous puncta (stres granül ve sinaptik kompleksleri), gibi karıştığı (mitokondri ve membran kaçakçılığı veziküller). Bu yöntem uyarlanabilir görüntü analizi ve miktar ve başvuru noktası ve güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik alanın karşısındaki kolaylaştırmak, sonuçta ateş mekanik anlayışı geliştirmek henüz standart, sağlar.

Miktar sayısını, alan ve fluorescently tagged mutant yoğunluğunu Htt Drosophila optik lobunda toplar.
Merkezi sinir sistemi misfolded protein toplamada Huntington hastalığı, RFP öğesini mutant bir Drosophila modeli araştırmak için bir patolojik olmayan (UAS-RFP-hHttQ15) ya da patolojik genişletme ( ile insan Htt UAS-RFP-hHttQ138) ve membran GFP (UAS-mCD8::GFP)<sup class="xr...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ at JoVE.com

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

quantitative-cell-biology-neurodegeneration-drosophila-through

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

9.0K Görüntüleme.  University of Miami Miller School of Medicine. Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

Video: Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Çoklu Ölçeklerde Sayısallaştırılmış Nöronal Morfoloji Otomatik Sholl Analizi

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Nörobilim

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences. For instance, addiction to nicotine via tobacco smoking is a leading cause of premature death worldwide (World Health Organization) and is likely caused by an alteration of ion channel distribution in the brain1. Chronic nicotine exposure in both rodents and humans results in increased numbers of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in brain tissue1-3. Similarly, alterations in the glutamatergic GluN1 or GluA1 channels have been implicated in triggering sensitization to other addictive drugs such as cocaine, amphetamines and opiates4-6.

Consequently, the ability to map and quantify distribution and expression patterns of specific ion channels is critically important to understanding the mechanisms of addiction. The study of brain region-specific effects of individual drugs was advanced by the advent of techniques such as radioactive ligands. However, the low spatial resolution of radioactive ligand binding prevents the ability to quantify ligand-gated ion channels in specific subtypes of neurons. 

Genetically encoded fluorescent reporters, such as green fluorescent protein (GFP) and its many color variants, have revolutionized the field of biology7.By genetically tagging a fluorescent reporter to an endogenous protein one can visualize proteins in vivo7-10. One advantage of fluorescently tagging proteins with a probe is the elimination of antibody use, which have issues of nonspecificity and accessibility to the target protein. We have used this strategy to fluorescently label nAChRs, which enabled the study of receptor assembly using F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) in transfected cultured cells11.More recently, we have used the knock-in approach to engineer mice with yellow fluorescent protein tagged &alpha;4 nAChR subunits (&alpha;4YFP), enabling precise quantification of the receptor ex vivo at submicrometer resolution in CNS neurons via spectral confocal microscopy12. The targeted fluorescent knock-in mutation is incorporated in the endogenous locus and under control of its native promoter, producing normal levels of expression and regulation of the receptor when compared to untagged receptors in wildtype mice. This knock-in approach can be extended to fluorescently tag other ion channels and offers a powerful approach of visualizing and quantifying receptors in the CNS.

In this paper we describe a methodology to quantify changes in nAChR expression in specific CNS neurons after exposure to chronic nicotine. Our methods include mini-osmotic pump implantation, intracardiac perfusion fixation, imaging and analysis of fluorescently tagged nicotinic receptor subunits from &alpha;4YFP knock-in mice (Fig. 1). We have optimized the fixation technique to minimize autofluorescence from fixed brain tissue.We describe in detail our imaging methodology using a spectral confocal microscope in conjunction with a linear spectral unmixing algorithm to subtract autofluoresent signal in order to accurately obtain &alpha;4YFP fluorescence signal. Finally, we show results of chronic nicotine-induced upregulation of &alpha;4YFP receptors in the medial perforant path of the hippocampus.

We have developed a novel technique of quantifying nicotinic acetylcholine receptor changes within subcellular regions of specific subtypes of CNS neurons to better understand the mechanisms of nicotine addiction by using a combination of approaches including fluorescent protein tagging of the receptor using the knock-in approach and spectral confocal imaging.

Kronik Nikotin İdaresi fareler Knock-in içinde floresan etiketli Nikotinik Reseptör Spektral Konfokal Görüntüleme

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Nörodejeneratif Hastalıkların bir Drosophila Modelinde Tırmanma Kusur Kantitatif Analiz

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Doğrusal Agaroz Kanallar kullanarak Okuyacak<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Tarama Davranış

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Kantitatif analiz Drosophila nöronal dendritik Arborization karmaşıklığı

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

Neuroscience bölümlerinde TEM örnekleme tarafsız bir yaklaşım

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...