Yazarlar Otterbein Üniversitesi Lisans öğrenci araştırma bursu ve öğrenci araştırma fonu Ödülleri GVK ve SGK kabul etmek istiyorum; ve dini Program Ödülü Otterbein Profesör Gilbert E. Mills Memorial donatılmış ve Biyoloji bölümü ve yer Bilimleri Fakültesi Araştırma ve burs ödülü aşı için donatılmış. Bert ve Jane boynuz donatılmış öğrenci araştırma fonu Bilimleri GVK ve SGK verildi. Yazarlar ayrıca minnetle Duquesne Üniversitesi Lisans Araştırma Programı Bursu finanse GVK ve SGK için kabul etmek istiyorum. Eski Juniata üniversite lisans araştırma öğrencileri, Ryan Johnson ve Lindsey Draper mikroskobu görüntüleri resimler 2 ve 3, için sırasıyla bulunmuştur.

1. aletleri, Kültür medya, çözümleri ve Petri yemekler hazırlayın
<ol><li>Otoklav kürdan bir 50 mL ölçek steril tutmak için alüminyum folyo ile kaplı.</li>
	<li>-Ecek var olmak bütün kuru mallar sterilize kullanılan (ipuçları, sopa, Züccaciye, vb) bir Otoklav içinde. Not: dikkat! Kullanılan basınçlı kap modeli için tüm güvenlik yönergelerini izleyin. Basınçlı kaplar, patlama ve Buhar ve sıcak yüzeyler, malzemeler ve medya ile temas yanıkları için bir riski. Otoklav güvenliği için "Uygun kullanımı, basınçlı kaplar"34görüntüleyin.</li>
	<li>
MS kültürler büyümeye agar (Mannitol Soya unu (SFM))14 hazırlayın.
	<ol>
<li>5 g soya unu ve agar 5 g 1 L şişesi için ekleyin.</li>
		<li>Doz mannitol musluk suyu 250 ml 5 g dağıtılması ve soya unu ve agar içeren balonun dağıtmak.</li>
		<li>121 ° c, en az 30 dk 15 psi bir köpük Tak ve folyo balon ve basınçlı kap açılması için ekleyin. Dikkat: Bu orta kolayca kaynar. En az dört kez MS agar autoclaved olmak gerçek hacmiyle tutabilir bir şişesi kullanın. Standart bir düdüklü tencere benzer güvenlik konuları ile bir otoklav yerine kullanılabilir. Alternatif olarak, bir mikrodalga fırın bir otoklav erişimin mümkün35,36değilse kitle iletişim araçları ve malzemeleri sterilize etmek için kullanılabilir. Lise öğretmeni de yerel kolej veya üniversiteler autoclaved malzemeleri erişmek için birlikte çalışmak isteyebilirsiniz.</li>
		<li>Serin ortam rahat kadar yeterince işlemek. 50 ° c altındaki sıcaklıklarda agar katılaşır çünkü çok uzun süre sakin değil dikkatli olun</li>
		<li>Her Petri kabına dibinde yaklaşık yarısı kadar MS agar balonun üzerinden steril Petri yemekler dökün tam (medya Petri kabına başına yaklaşık 25 mL). Ağar kaplamalar kullanmadan önce kuvvetlendirmek için izin verir. Ağar kaplamalar bir plastik torba gerekinceye kadar oda sıcaklığında saklayın. Not: özellikle antibiyotik medyada gerekirse ağar kaplamalar da bir buzdolabında saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. çizgi Streptomyces yayma için plakalar üzerine
<ol><li>Çizgi Streptomyces suşları üzerine MS ağar kaplamalar çeyreği gibi standart bir yöntem kullanarak tek kolonileri için yöntem Sanders, 201237gösterildiği gibi çizgi. Not: İnoculating bir döngü veya steril kürdan kullanılabilir. İsteğe bağlı: Diğer medya yaygın olarak R2YE ve en az medya14gibi Streptomyces türleri için kullanılır.</li>
	<li>Tabak 30 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Levhalar her 4-6 gün bir koloni seçerek restreak. Rasgele mutasyona eğilimli olurlar kolonileri yaş.</li>
</ol>3. bakteriyel depolanmasında gliserol Mycelial hisse senetleri oluşturun
Not: Mycelial hisse senetleri WHI dahil olmak üzere tüm Streptomyces suşları ve bld suşları ve sporulation tamamlanması mümkün değildir diğer gelişimsel mutantlar için oluşturulabilir.
<ol><li>200-500 µL % 20 gliserol steril ahşap Kavela aplikatör kullanarak, kolonilerde 15-20 macerate.</li>
	<li>Bulamaç kolonileri macerated bir micropipette veya steril transfer pipet kullanarak bir 1,5 mL dondurucu kültür Tüp, aktarın. Not: Başka bir yerde micropipette kullanım temellerini ele alınmıştır38.</li>
	<li>Son hacim yapmak için yeterli % 20 gliserol eklemek 1 mL ve karışımı yavaşça. Örnekleri-80 ° C'de depolayın Not: dikkat! Kullanım kriyojenik Emanet eldiven ve önlük ile aşırı soğuk ilişkiden cildi korumak için. Alternatif olarak, bir-20 ° C-dondurucu potansiyel uzun vadeli depolama süresi azalma ile kullanılabilir. Aşırı soğuk ve canlılığı genişletmek için çözdürme kaçının.</li>
</ol>4. suşları için gliserol Spore stokları oluşturma yeteneğine sahip Sporulation
Not: Spore hisse senetleri için uzun vadeli canlılığı tercih edilir ama sadece sporulation tamamlama özelliği olan suşları için uygulanabilir.
<ol><li>
Maserasyon konfluent çim büyüme37elde etmek için bir agar plaka üzerinde malzeme (Kimden adım 3.1) 100 µL yayıldı. Not: Sanders37 yılında yayılan kaplama gösterilir (değiştirme: bir pikap gerekli değildir.). Plaka tek eliyle yaymak yumuşak içinde ileri geri hareket etmek diğer yandan kullanırken hareket agar medya karşısında kapatılabilir.<ol>
<li>Damlalıklı 100 µL maserasyon miselyum bir MS agar plaka ortasına.</li>
		<li>Bir cam veya metal aracı tarafından kısmen % 70 etanol batış ve etanol buharlaşma hızı yavaş yavaş bir Bunsen burner alev aracılığıyla bir kez yayıcı geçtikten yayılan sterilize. Dikkat: Etanol çok kolay alevlenebilir. Yanan yayıcı etanol yerleştirin veya etanol etanol çanak içine düşmek için yanan damla izin değil. Alternatif olarak, bir tek kullanımlık steril pamuklu çubukla istemek hayır etanol ya da alev plaka üzerinde bakteri yaymak için kullanın.</li>
		<li>MS agar bir el ile bir geri kullanırken plaka ve plaka steril dağıtıcı ile aşılamak için ileri hareket açın.</li>
		<li>Zorlanma iyi sporulated kadar 5-7 gün 30 ° C'de için kuluçkaya. Not: Kuluçka kez türler ve zorlanma bağlı olarak değişir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 mL steril serum fizyolojik ekleyin (% 0.8 NaCl) sporulation uğramıştır konfluent bir çim Streptomyces hücre ortasına.</li>
	<li>Sporlar yavaşça bir kısır döngü (ya da bir pamuk tomurcuğu), yavaş yavaş aşı çim kenarına doğru hareket ile miselyum yüzey sürtünme hasat.</li>
	<li>Serum fizyolojik içeren damlalıklı 15 mL konik tüp içine sporlar. Girdap şiddetle bireysel hücrelere spore zincirleri kırmak için.</li>
	<li>Yaklaşık 2500 x gde 5 min için oda sıcaklığında santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Damlalıklı süpernatant ve atma. Spore pelet tarafından dinç girdap ajitasyon kalan sıvı küçük miktarda dağıtmak.</li>
	<li>Sporlar çözüm yukarı ve aşağı bir pipet ile çizerek 1 mL % 20 gliserol resuspend.</li>
	<li>Gliserol spor stok 1,5 mL dondurucu tüp aktarın. Mağaza-80 ° C'de Uyarı: Kullanım kriyojenik Emanet eldiven ve önlük ile aşırı soğuk ilişkiden cildi korumak için. Alternatif olarak,-20 ° C-dondurucu potansiyel azalma uzun süreli saklama süresi canlılık ile kullanılabilir. Aşırı soğuk ve canlılığı genişletmek için çözdürme kaçının.</li>
</ol>5. Mutagenesis gerçekleştirmek
<ol><li>Başvurulan giriş olarak istediğiniz sonuçlara dayalı ve yakın Baltz, 201639değerlendirme mutagenesis gerçekleştirin. Not: Bazı fenotipleme deneyler mutagenesis, çevreden yeni türler tanımlamak için niyet gibi kullanmanız gerekmez. Rastgele mutagenesis yöntemleri transposon8,9,10,11,12,13, UV radyasyon ya da kimyasal madde14kullanımını içerir. Site yönetmen-mutagenesis15,16,17,18,19,20 teknikleri belirli nokta mutasyonlar, silme, oluşturmak için kullanılan veya diğer türleri mutasyonlar.</li>
</ol>6. karşılaştırmak ve görsel görünümünü kaydetmek
<ol><li>Koloni morfolojisi ile karşılaştırıldığında belgili tanımlık vahşi-tipi üst soy her mutant için adım 2 olduğu gibi tüm suşların çizgiler sonra dikkat edin. Coelicolor S. veya ne zaman yeni Streptomyces türleri karakterize venezuelae, S. gibi iyi çalışılmış bir tür olan için yeni izole karşılaştırmak. Not temel şekli, koloni yüzey gibi özellikleri (Şekil 1) (bulanık, kel, buruşuk, vb), opaklık, yükseklik ve pigmentasyon (ayırt bitkisel miselyum, hava miselyum ve/veya çevredeki orta arasında).</li>
	<li>Bir MS agar plaka ve çizgi vahşi tipi ve mutant suşları kama desen (Şekil 1) etiketleyin. Hiçbir zorlanma çapraz bulaşma önlemek için başka bir soy dokunur dikkat et. Not suşları tabağa çizgili saat ve tarihi. Tabak 30 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Yetişkin Petri yemekler arka homojenize için renkli veya beyaz kağıt yerleştirin. Kağıt soy adı, tarih, inkübasyon sıcaklığı ve süresi üzerinde çizgiler ilk tabaktan yazmak. Plaka dijital resim karışıklık simge durumuna küçültülmüş Kağıt arka plan üzerinde yazılı ikinci bilgi ile alın. Not: Eğer şekil hazırlık için kullanılmak üzere yazılı fotoğraftan daha sonra kırpılmış olarak.</li>
</ol>7. aşama-kontrast mikroskobu gerçekleştirmek
<ol><li>Cımbız % 70 etanol yıkama ve sonra etanol buharlaştırma Bunsen burner alev tarafından sterilize. Soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Coverslips % 70 etanol yıkama ve sonra onları steril Petri kabına içinde kuru izin tarafından sterilize.</li>
	<li>
Coverslip Asansör incelenmesine bakterilerin büyüme hazırlayın.
	<ol>
<li>Steril bir coverslip kadar steril cımbızla almak ve bakteriyel büyüme yoğun nerede coverslip bir MS agar tabağa yerleştirin. Coverslip arkasında cımbızla bakteriyel Sporlar ve hava miselyum yeterli transferini sağlamak için hafifçe bastırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip plaka almak ve hücre malzemesi yanında mikroskop slayt yüzeyinin % 50 gliserol suda montaj için hazırlanan bir 15 µL damla ile doğru bakacak şekilde yerleştirin. Hava kabarcıkları yanında duvar ilanı coverslip slayt 45 ° açıyla azaltmak ve % 50 gliserol düşmesine izin.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Mühür ve netlik slayt korunması için cilası.</li>
	<li>
Frohlich40 yaşam döngüsü sırasında çeşitli zaman aralıklarında açıklandığı faz kontrast mikroskobu gerçekleştirin. Not: Yinelenen görüntüleme için daha kapsamlı bir analiz ve gelişmede gecikmeler algılama yeteneğini sağlar. Bağımsız gözlemler hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sağlamak için yineleyin.<ol>
<li>Hazırlanmış slayt mikroskop sahnesinde yerini ve kapak notu ortasına doğru bir damla daldırma yağı ekleyin. 100 X faz amacı yerleştirin ve kondansatör taret uygun "eşleştirme" faz ayarına döndürün. Objektif lens yağ ile temas halinde olduğunu bir kez sadece hassas ayar düğmesi kullanarak görüntüyü odaklan.</li>
		<li>Birkaç alanları mutant suşları ve form Sporlar, spor boyutu ve şekli ve genel sayısını (bkz. Şekil 2) Sporlar, yeteneği gibi vahşi türü arasındaki fark ve tutarlı farklılıkları ayırt etmek görüş inceleyin. Not: Faz kontrast mikroskobu alternatifleri fark girişim kontrast (DIC) mikroskopi40 içerir ve kristal violet boyama gibi parlak alan mikroskoplar41, basit boyama teknikleri için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. gerçekleştirmek floresans mikroskobu
<ol><li>Cımbız % 70 etanol yıkama ve Bunsen burner alev çalışan tarafından sterilize.</li>
	<li>Steril bir coverslip kadar steril cımbız ve bakteriyel büyüme belirgin nerede yer bir MS agar plaka üzerinde almak. Coverslip arkası bakteriyel Sporlar ve hava filamentler yeterli transferini sağlamak için cımbız ile hafifçe dokun.</li>
	<li>Coverslip plaka almak ve böylece hücre malzemesi ile yan, coverslip manipülasyon kolaylığı için kartlar üzerinde karşı karşıya olduğu yer.</li>
	<li>Coverslip buz gibi metanol (20 x 20 mm2 coverslip için ~ 300 µL) ile sel ve tamamen kuru hava girsin. Dikkat: Bir alkil metanol var. Cilt ile doğrudan temas önlemek.</li>
	<li>Coverslip yavaşça dağıtımı ve çözüm kaldırma fosfat tamponlu tuz (PBS)42 yılında üç kez yıkayın.</li>
	<li>100 μg/ml Propidium iyodür 15 µL eklemek ve/veya 10 μg/mL buğday-mikrop-Agglutinin % 50 gliserol etiketli mikroskop slayda yapılan floresein isothiocyanate (WGA-FITC) Birleşik. Not: Propidium iyodür DNA WGA-FITC hücre duvarı yeşil lekeleri ise kromozom DNA konum algılamak için kırmızı leke bırakır.</li>
	<li>Coverslip ön yüzü aşağı dönük floresan leke cam slayt üzerinde damla üzerine tersine çevirin. (İsteğe bağlı) slayt korunması için açık oje ile kapatın.  Boya ışığa duyarlı olduğu gibi 15 dakikalığına bir karanlık veya loş odada kuluçkaya.</li>
	<li>Slaytları bir 100 X objektif lens bir faz kontrast veya propidium iyodür (veya 535/617 nm uyarma/emisyon maxima 'Texas Red' filtre kümesi) ve FITC için epifluorescence uyarma küpleri ile donatılmış DIC mikroskop kullanarak altında gözlemlemek (FITC filtre kümesi veya 490/525 nm uyarma/emisyon maxima).</li>
	<li>Slayt üstünde belgili tanımlık sahne ve kaba ve ince ayar düğmeleri kullanarak odak yerleştirin.</li>
	<li>Başka bir yerde43gösterildiği gibi floresan gözlemlemek.</li>
	<li>Sporlar daha düşük floresan yoğunluğu44ile tanımlanmasına yardımcı olabilir bir ücretsiz görüntü analiz yazılım paketi kullanın.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada Streptomyces araştırmacılar çalışmalar suşları yaymak ve hisse senetleri uzun süreli depolama için hazırlamak için gerekli adımları ekleyerek başlatmak için başlangıç için protokolleri mevcut. Biz o zaman Streptomyces suşları görsel ve mikroskopik karakterizasyonu protokollerde tanımlamak. Fenotipleme gelişimsel mutantlar bazı tipik ilk adımlar şunlardır: 1) vahşi türü kolonileri agar ortamdaki; göre mutant kolonileri görsel muayene 2) faz kontrast mikroskobu; ve 3) sporogenic hava hif floresans mikroskobu. Bu üç adımda görüntülenen fenotip dayanarak, çeşitli teknikler daha da belirli bir yük fenotip farketmek için istihdam edilebilir.
İlk fenotipleme deneyler genellikle yeni tür karakterize, mutantlar ilgi tanımlamak, kısmen mutantlar karakterize ve belirli bir gen tespit bir mutant fenotip üzerinde dayalı tipik rolü ayırt etmek başlamak için kullanılır. Yöntem tanımlamak burada zaten belirlemek ve Streptomyces mutantlar, kusurları ile hücre bölünmesi48,49yılında, de dahil olmak üzere çok çeşitli karakterize laboratuvarları öğretim Üniversitesi'nde kullanılmıştır 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporulation55,56, hava miselyum oluşumu57,58, antibiyotik üretim59, ikinci haberci sinyal47ve kromozom segregasyon 60. bu teknikler mutantlar fenotip genel olarak belirleyen hayati ilk adımlardır ve ilgi genlerin rolleri hakkında önemli bilgi büyük miktarda açığa vurmak. Yöntemleri kolayca Streptomyces diğer türler için uzatılabilir ve zaten S. griseus, S. venezuelae, S. uyuzve birçok diğer streptomycetes suşların açıklamak için kullanılmıştır. Burada açıklanan video protokolleri Streptomyces araştırma, alanlar gibi ilaç keşif alanında girerek yeni araştırmacılar için önemli bir kaynak hizmet bekleniyor. Bu antibiyotik direnci kriz ve yeni lisans öğrencisi araştırmacılar küçük dünya girişimi crowdsourcing çabaları katılmadan sayısız sayıda eğitmek mücadele için çalışan yeni öğretim içerir.
Burada açıklanan teknikler, üniversite ve lise sınıf kullanımı araştırma laboratuvarları, video ve metin içinde açıklanan değişiklikleri kullanarak ek olarak kolayca uyarlanabilir. Küçük liberal sanat Koleji'nde ilk yıl mikroskobu modülde öğrencisiydi suşları çizgi, suşlarının agar ortamında yetiştirilen dijital fotoğraf çekmek ve teslim edilmesini sonuçlandı faz kontrast ve floresan mikroskopi gerçekleştirmek güçlü bir Portföy-laboratuar 15 h temsil eden 3 hafta modülün sonundaki çok panelli şekiller. Yaklaşık 160 ilk yıl öğrenciler için 320 roman transposon mutant fenotipleme ilk sorumlu olduğunu. Lisans'da araştırma öğrencileri üç kurumlarında ek mutant ilk fenotipleme ve suşlarının birçoğu sonraki karakterizasyonu'na katılmıştır. Nispeten kısa sürede elde edilen kapsamlı veriler burada açıklanan protokoller değerini göstermektedir. Ek mutantlar yüzlerce gelecekteki karakterizasyonu için gliserol mycelial hisse senedi olarak depolanmıştır.
Burada açıklanan ilk deneyler çeşitli yöntemler için ilgi suşları ile ilgili bilgilerin kalitesi genişletmek için istihdam edilebilir. Mutasyon bilinmiyorsa, Genotipleme yöntemi türü ve/veya mutasyon konumunu belirlemek için istihdam edilmelidir. Örneğin, rastgele transposon mutagenesis vahşi-türü kromozom6,7,8,9,10,11,12,13 sonuçları ilk fenotipik ekranlar yukarıda açıklananlar gibi geçmesi kolonilerde. O zaman transposon konumunu ters polimeraz zincir reaksiyonu (iPCR)61gibi bir teknik kullanarak tespit edilmelidir. Yeni keşfedilen mutantlar genotip belirleme ilk karakterizasyonu takip önemli bir adımdır.
Sınıfta belirtilen veya daha fazla araştırma yoluyla araştırdı sonraki fenotipleme analiz için yaygın olarak kullanılan bazı gelişmiş yöntemleri protein ilgi için yerelleştirme desenleri belirlemek için etiketleme yeşil flüoresan protein (GFP) dahil, gen ifade analizleri gibi gerçek zaman kantitatif PCR (qPCR) ve küresel gen ifade desenleri vahşi-türü mutant RNA sıralama (RNA-seq) üzerinden karşı. Fenotipleme becerileri de genetik uluslara analiz için gereklidir. Uluslara deneyde bir gen vahşi tipi kopyasını bir mutasyona uğramış yeni eklenen alleli kaybı-in-fonksiyonu için mutasyona uğramış alleli telafi edebilirsiniz olup olmadığını belirlemek için girmiştir. Hem özgün mutant ve ebeveyn için çıkarılan zorlanma fenotip karşılaştırarak, vahşi tipi zorlanma gereklidir.

Streptomycetes yeteneklerini sekonder metabolitler, ticari olarak mevcut antibiyotikler de gibi anti-tümör üçte dahil olmak üzere çeşitli üretmek için anti-HIV ve anti-paraziter ilaçlar bilinen gram-pozitif, ipliksi toprak bakteri vardır 1. S. coelicolor cins2,3 en genetik olarak karakterize üyesidir ve yöntem tanımlamak burada kullanılan türü. S. coelicolor agar orta büyür bir kapsamlı, dallanma bitkisel miselyum ilerliyor tek bir spor çimlenmesi ile başlar karmaşık bir yaşam döngüsü var. Yaşam döngüsü devam ettikçe, hava filamentler substrat miselyum yüzey gerilimi kırmak ve nihayet olgun, gri pigmentli Sporlar sonuçta dönüştürülen hücrelerin uzun zincirli ayrılır oluşur. Yeni kurulan bu sporlar dağılım sonraki yaşam döngüsü4başlangıcı kabul ettiğiniz anlamına gelir.
Farklılaşma onun karmaşık desen nedeniyle, S. coelicolor bakteriyel geliştirme çalışma için mükemmel bir model olarak hizmet vermektedir. Tarihsel olarak, mutasyonlar bloklar halinde iki büyük gelişimin için neden ve farklı görsel fenotipleri üretmek. Bld (kel) mutantlar hava miselyum oluşumu ve bulanık bir hava miselyum "kel" koloni görünüm imparting eksikliği sonucu için engellenir. Mutantlar spore oluşumunda inhibe ve olgunlaşma kabul edilir WHI (beyaz) mutantlar olarak çünkü onlar genellikle vahşi-türü düzeyleri gri spor pigment üretmek başarısız ve hava miselyum beyaz kalır. Diğer ilginç mutantlar antibiyotik üretim, hücre bölünmesi, kromozom segregasyon veya diğer önemli işlemleri4,5inhibe.
Streptomyces türleri birçok gelişimsel genlerin keşfi rağmen orada çok daha var doygunluk mutant ekranlarının eksikliği dayalı inanıyordu. Laboratuarlarımızda biz inşa ettik bir mini transposon sistemini kullanarak yeni gelişimsel genlerin tanımlamak devam edin. Rastgele mutagenesis deneylerde bizim transposon ile izole roman mutant suşları her yeni keşfedilen gen6,7olası rolü tanımlamak için fenotipik tarama geçmesi. Bakteriyel fenotipleme burada anlatılan yöntemleri transposon mutagenesis8,9,10,11,12'izole Streptomyces mutantlar alakalı, 13 ve kimyasal ve ultraviyole (UV) mutagenesis14, hem de recombineering15,16 kullanarak gen silme gibi mutasyonların yönlendirilmiş inşaat gibi rastgele diğer yöntemleri veya CRISPR-Cas9 (kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik tekrarlar) genom teknoloji17,18,2019 ve nokta mutasyonlar düzenleme.
Antibiyotik direnci patojenler arasında giderek yaygın hale geldikçe, yeni antibiyotikler için ihtiyaç giderek daha acil21,22olur. "Küçük dünya girişimi" (veya SWI) bir etkili bilim, teknoloji, mühendislik ve matematik (kök) antibiyotik direnci crowdsourcing üniversite öğrencileri ve daha fazlası ile mücadele etmek için23 ve araştırma stratejisi24 öğreniyor Geçenlerde Lise öğrencileri. Desteklenen kurslar roman antibiyotik (http://www.smallworldinitiative.org) üretmek yeni toprak mikroplar belirleme çalışmaları içermektedir. Bu önemli bir kaynağı keşfedilmemiş antibiyotik Streptomyces türleri toprak geniş bir alanda bulundu ve habitatların25,26,27,28su olmaya devam edecektir inanılıyor, 29,31. Son zamanlarda, bizim laboratuvar ve başkalarının çalışmalarını keşfetti ve Morfoloji ve antibiyotik üretim7,32dahil olmak üzere gelişimi, düzenleyen Streptomyces türleri sinyal genler ile karakterize, 33. Değişiklikler bu genlerin ifadesinde bir değişim miktarı ve zamanlama üretilen antibiyotik neden. Yeni tür ve yeni mutantlar antibiyotik üreten yetenekli fenotipleme önemli olmaya devam edecektir. Yeni öğretim elemanları ve öğrencileri büyük katkıda bulunan ilaç keşif alanında olmak gibi bakteriyel fenotipleme eğitimde bu acemi bireylerin başarısı için gereklidir. Ayrıca, bu deneyler yüksek okul kök veya Üniversitesi Mikrobiyoloji eğitim laboratuvarları için uysal vardır. Temel mikrobiyal genetik ilkeleri ayarlama bir öğretim laboratuvarda bir gösteri temsil ederler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="543">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:197px;">50% Glycerol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">G5516</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Immersion Oil (Type DF)</td>
			<td>Cragille&#160;</td>
			<td>16482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lens Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Water</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>G-3250-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Toothpicks (flat)</td>
			<td>Target</td>
			<td>081-22-1957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (10 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (200 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-200Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (1250 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wooden Applicators 6&#39;&#39;</td>
			<td>Solon Care</td>
			<td>070809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton Swabs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soy Flour&#160;</td>
			<td>Bob&#39;s Red Mill&#160;</td>
			<td>1516C164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 100%</td>
			<td>VWR amresco life science&#160;</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.8% NaCl (Saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBB9000V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.2 mL freezer tube</td>
			<td>NEST</td>
			<td>606101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultra low (-80&#176;C) freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryo Safety Gloves</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H13201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5856-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slips #1.5</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>64-0721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slides</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>63-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>2540E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phase-Contrast Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>624504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bunsen Burner</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>706706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (phosphate buffer saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WGA-FITC</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Clear nail polish</td>
			<td>OPI</td>
			<td>22001009000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 mL beaker</td>
			<td>Pyrex USA</td>
			<td>1000-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L beaker</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L flask</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S63274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 mL flask</td>
			<td>Pyrex USA</td>
			<td>4980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 mL graduated cylinder</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">500 mL graduated cylinder&#160;</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir Bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-271825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera for Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nitrile Examination Gloves (Med)</td>
			<td>Bio Excell</td>
			<td>71011002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>701077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visual and microscopic evaluation of streptomyces developmental mutants

Streptomycetes dünya çapında bulunur ve antibiyotik ve diğer ikincil metabolit geniş bir dizi üretmek evvel türe ait ipliksi toprak olan bakterilerdir. Streptomyces coelicolor laboratuvarda analizler çeşitli mükellef iyi karakterize, patojenik olmayan bir türdür. Fenotipleme yöntem tanımlamak burada S. coelicolor bir modeli streptomycete kullanın; Ancak, yakından ilgili bazı Aktinomiçes yanı sıra tüm üyeleri bu büyük cins, uygun yöntemlerdir. Fenotipleme yeni bir tür ortamda tespit Streptomyces karakterize gereklidir ve mutant suşları yeni izole Streptomyceskarakterize çok önemli bir ilk adım da. Fenotipleme yeterlilik bakteriyel geliştirme, hücre bölünmesi, kromozom segregasyon ve ikinci haberci sinyal çalışma içerir Streptomyces araştırma alanında giren birçok yeni araştırmacılar için önemlidir. Yeni toprak mikroplar yalıtım ile antibiyotik keşif son crowdsourcing öğrenciler için fenotipleme eğitim öğretim elemanları Streptomyces araştırma ve kendi üniversite veya yüksek okul alanına yeni için artan bir ihtiyaç sonuçlandı. Bu el yazması bakteriyel zorlanma yayma, depolama ve görsel ve mikroskobik açmasıyla karakterizasyonu için yöntemler açıklanır. Bu makale okuduktan sonra yeni araştırmacılar (Mikrobiyoloji eğitim laboratuvarları ve vatandaş bilim adamları) Streptomyces suşları işlemek ve görsel karakterizasyonu deneyler başlamak gerekir.

İlk fenotipleme deneyler yeni türler ve suşların karakterize için gerekli olan ve filogenetik ve yeni tür karakterize için kullanılan DNA-DNA hibridizasyon deneyleri için ücretsiz bir yaklaşım olarak kullanılabilir. Streptomyces mutantlar gibi kimyasal, UV, rastgele mutagenesis yöntemleri kaynaklanan veya transposon mutagenesis genellikle ağar kaplamalar doğrudan, görsel ekranlarda aracılığıyla tanımlanır. Streptomyces kolonileri değişiklikleri fenotip ile karşılaştırıldığında vahşi-tipi, ebeveyn zorlanma için incelenir. Örneğin, bir daha açık renkli hava miselyum gri pigment sporulation bir üründe neden daha düşük düzeyde gösterebilir veya bulanık bir görünüm eksikliği bir blok (Şekil 1) hava miselyum oluşumunda göstergesidir. Birçok streptomycetes bitkisel miselyum veya çevredeki agar pigmentli antibiyotik üretmek. S. coelicolor iki pigmentli antibiyotik gibi iki sigara pigmentli üretir. Actinorhodin mavi pigmentli antibiyotik ve undecylprodigiosin bir kırmızı pigmentli antibiyotik45. İlk görsel koloni ekranlar uğramıştır suşları için tek kolonileri streaking tarafından yayılır.
Potansiyel olarak mutantlar ilginç görsel kimlik suşları için mikroskobik inceleme tabi tutulmaktadır. Faz kontrast mikroskobu vahşi tipi zorlanma bir denetimi (Şekil 2) olarak kullanarak Streptomyces mutantlar için gelişimsel kusurlar, incelenmesi için özellikle uygun. Vahşi türü S. coelicolor kolonileri genellikle bir hava miselyum büyüme MS agar üzerinde 30 ° C'de yaklaşık iki gün ve sporlar uzun zincirleri tarafından büyüme tarafından üç gün üretmek. Yaşam döngüsü biraz daha yavaş veya diğer medya türleri üzerinde daha hızlı ilerleme olacaktır. Bu mutantları vahşi türü olarak aynı büyüme koşullarda gelişimsel kusurlar ve gecikmeler hakkında kararınızı zaman analiz edilecek zorunludur. Kel mutantlar Sporlar agar medyada uzun süreli büyüme sonra neden olabilir. Bir beyaz mutantlar da spor oluşumu için gecikmiş olarak anılacaktır mutantların saygılı bir azalma Sporlar üretmek Sporlar şekli ve/veya boyutu kusurları ile üretilen, bolluk veya sadece üretmek daha düşük düzeyde Olgun, gri spor pigment46 . Başka mutantlar bugüne araştırıldı gecikmiş ya da sinyal molekülleri (Örneğin, döngüsel-di-GMP47) birikimi için etkilenen mutantlar gibi yaşam döngüsü ilerleme hızlandırılmış.
Yukarıda açıklanan ışık mikroskobu tekniği basit bir takip sporulation septa hücre duvarına leke leke kromozom DNA nucleoids ve fluorescently etiketli buğday tohumu agglutinin propidium iyodür kullanılarak floresans mikroskobu olduğunu. Bir kromozom eksik Sporlar, boyama (Şekil 3) boyama azalma görünüyorsa normal tanımlanan daha az DNA içeren sporlar kırmızı propidium iyodür yoksun olacak. Buğday tohumu agglutinin hücre duvarı leke için kullanılabilir ve hücre duvar boyama desenleri (yani, hücre bölünmesi kusurları) farklılıklar görülmektedir. S. venezuelae, son zamanlarda başka bir model olarak kullanılan bir tür suşu Şekil 4 vahşi türü içinde streptomycete daha hızlı yaşam döngüsü ve sıvı45', sporulate yeteneği nedeniyle lekeli WGA-FITC ile aydınlatmak için genellikle erken sporulation sırasında görülür bölünme septa merdiven benzeri dizisi.
Burada açıklanan ilk fenotipleme stratejileri aşağıda sonuçlanmalıdır: 1) için daha fazla çalışma; ilgi mutant suşları tanımlaması 2) yeni tanımlanan mutant ve mutasyona uğrattı genin potansiyel rolü hakkında edinilen bilgi; 3) daha fazla söz konusu gen rolünü netleştirmek için kullanılan sonraki deneysel adımlar izleyen bir dizi formülasyonu. Çevre yeni saptanan streptomycete durumunda araştırmacı bilgi zaten karakterize Streptomycestürleri karşılaştırıldığında potansiyel yeni türlerin kazanacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> Resim 1: S. coelicolor, makroskopik koloni fenotipleri gösteren bir temsilcisi agar plaka fotoğrafı. Agar plaka bulanık, gösterir gri görünümünü hava miselyum vahşi tipi S. coelicolor için zorlanma MT1110 (WT) çeşitli rastgele transposon ekleme gelişimsel fenotipleri mutantlarla ile karşılaştırıldığında. Mutantlar da bir hava miselyum [kel (bld)] veya azaltılmış spore pigmentasyon [Beyaz (WHI)] ile bir hava miselyum eksik vardır. Transposon mutantlar ekleme mutagenesis6,7için mini-Tn5 kullanarak oluşturulan. Suşları MS agar üzerinde 30 ° C'de 5 gün boyunca yetiştirilmiştir Petri kabına çapı, 100 mm.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> Resim 2: bir temsilcisi hava gösterilen faz kontrast filmler filaman için S. coelicolor beyaz mutant suşları içeren rasgele transposon ekleme mutasyonlar. (A)gösterildi olduğu zaman uyumlu, düzenli aralıklı hücre bölünmeler, eşit olarak üreten uğramıştır bir temsilcisi vahşi tipi hava filament şeklinde ve Sporlar (MT1110) boyutlu. (B-F) Kalan panel çok farklı mikroskobik fenotipleri rasgele transposon mutagenesis yolu ile izole edildi çeşitli beyaz mutantların göster. Panel B sporulation uğramıştır değil, ancak bunun yerine filaman içinde şişkin alanlarda üretti bir hava filaman gösterir. C, Dve F uzun oklar mutantlar MIC42, MIC43 ve TH49 karakteristik anormal derecede büyük Sporlar gösterir. D panelinde kısa ok lysed spor bölmesi örneği gösterir. Panel E tipik mutant TH10 tarafından üretilen spor zincirlerinin kısmen dar küçük bölmeleri gösterir. Suşları MS agar üzerinde 30 ° C'de 5 gün boyunca yetiştirilmiştir Bu Şekil 1' de gösterilen alakasız mutantız. Bir vahşi türü spor yaklaşık 1.1 µm uzun ekseni üzerinde olduğunu. Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> Şekil 3: S. coelicolor mutant kromozom segregasyon fenotipleri gösterilen temsilcisi filmler. (A) A diyagramı temsil gösterir (her spor kromozom DNA içeren) Sporlar zinciri için tipik vahşi-tipi, düzenli aralıklı boyama görünümü bir kromozom görüntüler bir mutant için aralıklı boyama deseni ile karşılaştırıldığında segregasyon kusur. (B) panelleri her çifti aynı spor diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntü sol tarafından zinciri gözlenen ve propidium iyodür lekeli floresan görüntü sağ tarafta gösterilir gösterir. Vahşi-türü fenotip (a, b) iki rasgele transposon ekleme mutantlar için (c, d ve e, f) karşılaştırılır. Oklar Sporlar DNA yoksun gösterir. Suşları MS agar üzerinde 30 ° C'de 5 gün boyunca yetiştirilmiştir Gösterilen resim 1 ve Şekil 2ilgisiz mutantız. Ölçek çubuğu 1 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> Şekil 4: Floresan test S. venezuelae vahşi tipi baskı lekeli WGA-FITC ile. Bir hava filaman (A) A diyagramı yok girintilerine ile pürüzsüz ve sporulation faz kontrast mikroskobu ile karşılaştırıldığında sporulation erken bir aşamada gösterir hücre duvar boyama merdiven gibi dizi kullanarak görünür belirtisi atanmış WGA-FITC floresans mikroskobu altında kullanma o aynı filaman olarak başladı. Vahşi-türü S. venezuelae(B) Filmler. (bir) düzgün hava filamentler Sporlar zincirleri arasında bulunur. (b) panel gösterilen miselyum içinde bir, bir hava filaman geliştirme erken bir aşamada hücre duvarı yükünün bir merdiven gibi dizi sahiptir. Oklar, çapraz-duvarlar düzenli aralıklı oluşumu WGA-gelişimsel olarak ilişkili sporulation uğrar gibi o zaman uyumlu olarak içinde tek bir hava filament geliştirmek FITC tarafından lekeli gösterir. Zorlanma MYM (Maltose, YDoğu özü, Malt özü) MYM agar 38 h 30 ° C'de için üzerinde büyüdü Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants at JoVE.com

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Burada acemi protokollerde araştırmacılar için farmakolojik önemli bakteriyel cinsi Streptomycesfenotipleme başlatmak için mevcut.

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

17.6K Görüntüleme.  Otterbein University. Burada acemi protokollerde araştırmacılar için farmakolojik önemli bakteriyel cinsi Streptomycesfenotipleme başlatmak için mevcut.

Video: Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

Visual Analitik Teknikleri ile İmmünolojik Veri Analizi kolaylaştırılması

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

Sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

Parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.