著者は、学部学生研究員や学生研究基金賞 GVK、SGK; に Otterbein 大学を認識したいです。Otterbein ギルバート E. ミルズ教授記念恵まれてサバティカル プログラム賞を受賞し、生物学科と地球科学部研究奨学金寄附のジャブに賞。GVK と SGK バートとジェーン ホーン恵まれている学生研究基金科学が授与されました。作者は感謝するデュケイン大学 GVK の SGK の学部研究プログラム奨学金の資金によってたいです。元 Juniata の大学学部研究生、ライアン ・ ジョンソンとリンジーは、それぞれ数字 2、3、顕微鏡画像を貢献しました。

1. 楽器、文化、メディア、ソリューション、およびシャーレ
<ol><li>50 mL のビーカーにオートクレーブつまようじは、無菌を保つためにアルミ箔で覆われています。</li>
	<li>されるすべての乾燥品を滅菌するオートクレーブ (ヒント、棒、ガラス、等) を使用します。 注: 注意!使用されるオートクレーブ モデルのすべての安全指示に従ってください。オートクレーブは、爆発や蒸気、熱、材料、およびメディアとの接触から火傷の危険をもたらします。オートクレーブの安全のため「オートクレーブの適切な使用」34を表示します。</li>
	<li>
文化を育てるに寒天 (マンニトール大豆小麦粉 (SFM))14 MS を準備します。
	<ol>
<li>5 g の大豆小麦粉と寒天の 5 g を 1 L フラスコに追加します。</li>
		<li>250 mL の水道水にマンニトールの 5 g を溶かし、大豆粉と寒天を含むフラスコに分注します。</li>
		<li>121 ° c、15 psi、少なくとも 30 分間泡プラグ アンド フラスコとオートクレーブのオープニングに箔を追加します。 注意: この媒体以上の簡単に沸騰します。少なくとも 4 回 MS 寒天培地をオートクレーブに入れることの実際の量を保持することができますフラスコを使用します。標準的な圧力鍋は、同様な安全配慮のオートクレーブの代わりに使用できます。また、オートクレーブへのアクセスが可能な35,36ではない場合、メディアや材料を滅菌する電子レンジを使用する可能性があります。高校教師ローカル大学やオートクレーブの供給にアクセスする大学と協力することも。</li>
		<li>クールなメディアまでを処理するために十分に快適。50 ° C 以下の温度で寒天が固化するので長時間それを冷却しないように注意してください。</li>
		<li>各ペトリ皿の底が約半分になるまで滅菌シャーレにフラスコから MS 寒天を注ぐフル (約 25 mL の培地シャーレあたり)。寒天を使用する前に固化することができます。必要になるまで室温でビニール袋に寒天を格納します。 注: メディアで抗生物質が必要な場合に特に寒天版を冷蔵庫で保存される場合も。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 連勝放線菌伝搬用板
<ol><li>MS 領域などの標準的なメソッドを使用して単一のコロニーを寒天上に連勝放線菌菌株は、サンダース、2012年37に示すように、メソッドを連勝します。 注: 接種ループまたは生殖不能のつまようじを使用する可能性があります。(省略可能) その他のメディアが使われています R2YE や最小媒体14などの放線菌種。</li>
	<li>30 ° C でプレートを孵化させなさい</li>
	<li>単一コロニーのすべての 4-6 日を選択することにより、プレートを restreak します。植民地時代がランダムな突然変異しがちになります。</li>
</ol>3. 細菌ストレージのグリセロール菌糸を作成します。
注: 菌糸株は、胞子形成を完了することができる他の発達変異体とbld株whiを含むすべての放線菌の菌株について作成できます。
<ol><li>200-500 μ L 滅菌木製だぼのアプリケーターを使用して 20% のグリセロールの 15-20 の植民地を漬け込みます。</li>
	<li>マイクロ ピペットまたは無菌転送ピペットを使用して 1.5 mL 冷凍庫培養管にやせるコロニーのスラリーを転送します。 注: マイクロ ピペット使用の基本は取り上げません38。</li>
	<li>最終的なボリュームに十分な 20% グリセロールを追加 1 mL と軽く混ぜます。-80 ° C で試料を保存します。 注: 注意!使用低温安全手袋、極端な寒さとの接触から皮膚を保護するために実験用の上着。また、長期貯蔵時間の潜在的な削減と-20 ° C のフリーザーを使用可能性があります。過剰な凍結と融解性を拡張するため避けてください。</li>
</ol>4. 株の胞子グリセロールを作成する胞子形成が可能
注: 胞子株式は長期的な存続のために望ましいがのみ胞子形成を完了することができる系統の実現可能な。
<ol><li>
成長37の合流芝生を取得する寒天 (ステップ 3.1) から漬け材料の 100 μ L を広めます。 注意: 拡散めっきはサンダース37に表示 (変更: ターン テーブルは必要ありません。)。プレートをオンできます片手で穏やかに来たり、スプレッダーを移動する他の手を使用している間動き寒天媒体を経由。<ol>
<li>ピペット 100 μ L の MS 寒天平板の中心にやせる菌糸体。</li>
		<li>ガラスや金属の部分的に 70% のエタノールに水没し、エタノールの蒸発を促進するブンゼン バーナー火炎の中をゆっくり一度拡散機を渡すことによってツールを拡散を滅菌します。 注意: エタノールは引火性の高いです。エタノールに燃えるようなスプレッダーを配置したり、エタノール エタノール皿に落下するのフレイミング ドロップを許可しないでください。また、エタノールや炎を必要としないプレートに細菌を広げる使い捨て滅菌綿棒を使用します。</li>
		<li>MS 寒天バックを使用している間、片方の手でプレートし、前後の滅菌スプレッダーとプレートを接種する動きは電源を入れます。</li>
		<li>歪みがよく sporulated まで 30 ° C で 5 ~ 7 日間インキュベートします。 注: インキュベーション時間は、種や系統によって異なります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌生理食塩水 2 mL を追加 (0.8 %nacl) 胞子形成を経た放線菌細胞の合流の芝生の中心に。</li>
	<li>芝生のエッジに向かって移動ループ (または綿棒) をゆっくりと接種滅菌菌糸体の表面をやさしくなでることで胞子を収穫します。</li>
	<li>15 mL の円錐管に胞子をピペットで移しなさい、生理食塩水を含みます。個々 のセルに胞子の鎖を断ち切るに、積極的に渦。</li>
	<li>常温約 2,500 x gで 5 分間遠心します。</li>
	<li>上澄みをピペットで移しなさいと破棄。残りの液体の少量の積極的な渦攪拌による胞子ペレットを分散させます。</li>
	<li>20% のグリセロールの 1 mL のピペットで上下にソリューションを描画することによって胞子を再懸濁します。</li>
	<li>冷凍庫にある、1.5 mL のチューブにグリセロール胞子株式を転送します。-80 ° C でストア 注意: 使用低温安全手袋、極端な寒さとの接触から皮膚を保護するために実験用の上着。また、長期貯蔵時間性の潜在的な削減と-20 ° C のフリーザーを使用可能性があります。過剰な凍結と融解性を拡張するため避けてください。</li>
</ol>5. 突然変異誘発を実行します。
<ol><li>変異導入で参照している目的の結果に基づくし、Baltz、2016年39によって最近確認を実行します。 注: いくつかの表現型解析実験には変異原性, 環境から新しい種を識別するために意図などは不要です。ランダム変異導入法には、トランスポゾン8,9,10、11,12,13、紫外線照射、または化学物質14の使用が含まれます。サイト指示された突然変異誘発15,16,17,18,19,20技術を使用して、特定のポイント突然変異、削除を作成できますか他のタイプの突然変異。</li>
</ol>6 を比較し、視覚的な外観を記録
<ol><li>ステップ 2 のようにすべての株をストリー キングした後は野生型の親株に比べて各変異体のコロニー形態の注意してください。S の改変やS の venezuelae、 放線菌の新種を特性評価する際など、よく研究の種の新しい隔離集団を比較します。基本的な形は、植民地の表面などの特性 (図 1) に注意してください (ファジィ、ハゲ、しわなど)、不透明度、昇格、および色素沈着 (栄養菌糸、菌糸、および/または周囲の媒体を区別)。</li>
	<li>ラベルの MS 寒天プレートとストリーク野生タイプおよび突然変異体系統くさびパターン (図 1)。ひずみが交差汚染を避けるために別の歪みを触れないように注意します。日付と時刻系統板に縞になることに注意してください。30 ° C で版を孵化させなさい</li>
	<li>色やホワイト ペーパー バック グラウンドを均質に成長したシャーレを配置します。ストリー キングの最初のプレートから紙緊張の名前、日付、培養温度と時間を書いてください。後者の情報の混乱を最小限になるように用紙の背景に書かれたプレートのデジタル画像を取る。 注: 書き込みできるからトリミング写真後で図の準備のため使用する場合は。</li>
</ol>位相差顕微鏡を実行します。
<ol><li>70% エタノールで洗浄し、エタノールを蒸発するブンゼン バーナー炎を通過し、ピンセットを滅菌します。冷却することができます。</li>
	<li>70% エタノールで洗浄し、滅菌シャーレに乾燥させる coverslips を滅菌します。</li>
	<li>
検査されるため細菌の増殖の coverslip リフトを準備します。
	<ol>
<li>滅菌ピンセットで滅菌 coverslip をピックアップし、MS 寒天版の細菌の増殖は密、coverslip を配置します。カバーガラスの背中に軽く押しますピンセットで細菌の胞子と菌糸の十分な転送を確実に。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレートから coverslip をピックアップし、セルの材料が付いている側面に取付のために水の準備 50% のグリセロールの 15 μ L ドロップで顕微鏡スライドの表面に向かって直面しているように配置。スライドに 45 ° の角度で、coverslip を配置することによって気泡を削減し、50% のグリセロールに落ちること。</li>
	<li>(省略可能)クリアのシールはスライドの保存のマニキュアします。</li>
	<li>
位相差顕微鏡によるフレーリッヒ ・40さまざまな時間間隔でライフ サイクルの中に説明されているように実行します。 注: 繰り返しイメージングは、詳細な分析と開発の遅延を検出する能力。精度と再現性を確保するため観測しない独立してを繰り返します。<ol>
<li>顕微鏡ステージに準備されたスライドを配置し、カバー スリップの中心に液浸オイルの滴を追加します。100 X 相の目的で配置し、適切な「一致する」位相設定にコンデンサー砲塔を設定を回転させます。対物レンズは石油と接触が微調整ノブのみを使用してイメージの焦点を当てます。</li>
		<li>突然変異系統と野生のタイプ、フォーム胞子、胞子のサイズと形状 (図 2参照) の胞子の全体的な数など顕著なと一貫性のある違いを識別するいくつかのフィールドの表示を確認します。 注: は、位相差顕微鏡の代わりに、差動干渉の対照 (DIC) 顕微鏡40明視野顕微鏡41, クリスタル バイオレット染色などで簡単な染色技術を使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8 蛍光顕微鏡を実行します。
<ol><li>ピンセットを滅菌するには、70% エタノールで洗浄し、ブンゼン バーナーの炎の中を実行します。</li>
	<li>滅菌ピンセットや場所 MS 寒天版の細菌の増殖は明らかに滅菌 coverslip を拾います。細菌の胞子と空中フィラメントの十分な転送を確実にピンセットで、カバーガラスの背中をそっとさわってください。</li>
	<li>プレートから coverslip をピックアップし、セルの材料が付いている側面を厚紙、カバーガラスの操作で容易にするために、向いているように配置。</li>
	<li>冷たいメタノール (20 × 20 mm2 coverslip の ~ 300 μ L) coverslip の洪水、それは完全に空気乾燥できます。 注意: メタノールは、変異原性です。皮膚との直接接触を避けます。</li>
	<li>洗って、coverslip 3 回リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)42優しく調剤およびソリューションを削除してください。</li>
	<li>100 μ g/ml Propidium ヨウ化物の 15 μ L を追加および/または (WGA FITC) かにラベル付き顕微鏡スライドに 50% グリセロール、10 μ g/mL 小麦胚芽凝集素鎖共役型します。 注: Propidium ヨウ化汚れ DNA 赤 WGA FITC 緑細胞壁の汚れ、染色体 DNA の位置を検出します。</li>
	<li>Coverslip 滴スライド ガラスに蛍光染色の上に下向きに反転します。(オプション) スライドの保存のための明確なマニキュアで封印します。 染料は光に敏感な暗く、薄暗い部屋での 15 分間インキュベートします。</li>
	<li>位相コントラストまたはヨウ化 propidium (テキサス赤のフィルター設定、535/617 nm 励起/蛍光マキシマ) と FITC の落射蛍光励起キューブを搭載した DIC 顕微鏡を使用して 100 X 対物レンズの下でスライドを観察 (FITC フィルター設定または 490/525 nm励起/蛍光マキシマ)。</li>
	<li>ステージと粗・微動調整ノブを使用してフォーカスにスライドを配置します。</li>
	<li>43を他の所で示すように、蛍光を観察します。</li>
	<li>低蛍光強度44と胞子の識別するために助けることができる無料の画像解析ソフトウェア パッケージを使用します。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで系統を反映し、長期保存のため在庫を準備するための手順を含めることによって研究を開始する放線菌研究者を開始するためのプロトコルを提案する.その後、放線菌の菌株の視覚的及び微視的特性のプロトコルについて述べる.フェノタイピング突然変異体のいくつかの典型的な最初の手順は、: 1) 野生型の寒天培地上のコロニーに比べて突然変異コロニーの目視検査2) 位相差顕微鏡・ 3) sporogenic 空中菌糸の蛍光顕微鏡像。これらの 3 つの手順で表示される表現型を基に、さらに特定の株の表現型を識別するさまざまな手法を用いることができます。
初期の表現の実験は、新しい種を特徴付ける、興味の突然変異を識別する、部分的に変異体を特徴付ける、識別された突然変異体の表現型に基づく特定遺伝子の典型的な役割を識別するを開始する使用されます。ここで説明する方法は、既に大学を識別し、特徴付ける細胞分裂48,49,の欠陥を含め、放線菌の変異体のさまざまな所で使用されています。50,51,52,53,54、胞子形成55,56、菌糸形成57,58、抗生物質生産59、第 2 メッセンジャー シグナリング47、および染色体分配60します。 これらのテクニックは、一般的に突然変異体の表現型を決定する重要な最初のステップと大量の興味の遺伝子の役割についての重要な情報を明らかにします。メソッドは、放線菌の他の種に容易に拡張することがあり、既にs ・ ミセス属、 s. venezuelae s. 疥癬、および他の多くの放線菌の系統を記述するために使用されています。ここで説明されているビデオ プロトコルが創部における放線菌研究のフィールドを入力新しい研究者のための重要なリソースとして期待されます。これは、抗生物質耐性の危機と無数の小さな世界のイニシアティブのクラウドソーシングの努力に参加する新たな学部生研究者の教育と戦うために働いている新しいインストラクターを含まれます。
ここで説明したテクニックは、研究所、動画とテキストで説明されている変更に加え大学や高校の教室の使用に容易に適応することができます。小さいリベラルアーツの大学で最初年顕微鏡モジュールで学生が株を連勝、寒天、上に成長した株のデジタル写真を撮るし、の提出で絶頂に達した位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を実行することができる、実験室での仕事の 15 h を表す 3 週間モジュールの終わりに多パネルをはめられた数字のポートフォリオ。約 160 1年生 320 新規トランスポゾン変異体の初期の表現に責任があった。3 つの機関での学部の研究生は追加の突然変異体の初期のフェノタイピングと系統の多くのそれに続く評価に参加しました。時間の比較的短い期間で得られる包括的なデータは、ここで説明したプロトコルの値を示しています。追加の突然変異体の数百は、将来特性の菌糸グリセロールとして格納されています。
最初の実験は、ここで説明した、次の興味の系統に係る情報の品質を拡張するさまざまな方法を用いることができます。突然変異が既知の場合ジェノタイピング法を依頼型や突然変異の位置を決定してください。たとえば、ランダムなトランスポゾン野生型染色体6,7,8,9,10、11,12,13 の突然変異の誘発上記を記述されていないなどの初期表現型スクリーンを受けるべきである植民地の結果します。反対のポリメラーゼの連鎖反応 (iPCR)61などのテクニックを使用してトランスポゾンの場所を識別する必要があります。新たに発見された突然変異体の遺伝子型を決定する次の初期特性の重要なステップです。
教室で言及されることがありますやさらなる研究を通じて探求以降表現分析のためいくつかの一般的に使用される高度な方法は、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、興味の蛋白質の局在化のパターンを決定するためのタグ付け遺伝子発現解析などの時間の量的な PCR (qPCR) と野生型の世界的な遺伝子発現パターン変異 RNA シーケンス (seq RNA) 経由で対。表現型解析スキルも遺伝的相補性の分析のために必要です。相補性の実験では、新しく追加された対立遺伝子が変異遺伝子の機能喪失に補うことができるかどうかを決定する変異株に遺伝子の野生型のコピーを導入します。元の突然変異体と保護者による制限のそれと補完のひずみの表現型を比較すると、野生型株が必要です。

放線菌は、グラム陽性菌、糸状菌土壌細菌の抗エイズ薬・抗寄生虫薬さまざまな市販の抗生物質だけでなく、抗腫瘍の 3 分の 2 以上を含む、二次代謝産物を生産する能力で知られています。1. S. 改変属2,3の最も遺伝的特徴とメンバーでありここで説明した方法で使用される種であります。S. 改変は単胞子の発芽から始まる複雑なライフ サイクル寒天培地に育つ、広範な分岐栄養菌糸に進みます。ライフ サイクルが進むにつれて、空中のフィラメントが形成される基板菌糸体の表面張力を破るし、最終的に最終的に成熟した、グレー色素胞子に変換されるセルの長い鎖に分かれています。これらの新たに形成された胞子の分散は、次のライフ サイクル4の始まりを構成します。
分化の複雑なパターンは、ためS. 改変は細菌の開発の研究のための優れたモデルとして機能します。歴史的に、変異は開発の 2 つの主要な段階のブロックで起因し、明確な視覚的表現型を作り出します。Bld (ハゲ) 変異体菌糸形成と「ハゲ」コロニー出現を与えるファジィ菌糸の欠如の結果ブロックされます。突然変異体は胞子形成の抑制し、成熟と呼びますwhi (ホワイト) 変異株から、彼らは通常灰色胞子顔料の野生型レベルを生成に失敗して、菌糸が白。他の興味深い変異体が抗生物質の生産、細胞分裂、染色体分配、または他の重要なプロセス4,5で抑制されます。
放線菌種に多く発達遺伝子の発見、にもかかわらずより突然変異体画面の彩度の欠如に基づいて存在と考えられて多くがあります。我々 の研究室は、構築したミニ トランスポゾン システムを使用して新しい発達の遺伝子を識別するために続けます。新規変異株を分離した私たちのトランスポゾン ランダム変異導入実験は、各新しい遺伝子を発見した6、7の可能な役割を識別する表現型スクリーニングを受けます。ここで説明した細菌の表現型解析法、トランスポゾン変異8,9,10、11,12、によって分離された放線菌の変異体に関連します。 13とジーン15,16を使用して遺伝子の削除などの突然変異の監督の建設と同様に、化学と紫外線 (UV) 突然変異誘発14などの他のランダムな方法またはCRISPR Cas9 (クラスター化された定期的に空間短い回文繰り返し) ゲノム編集技術17,18,19点突然変異は20。
抗生物質耐性病原体の間でますます普及しているになると、新しい抗生物質のための必要性はますます緊急21,22になります。「小さな世界構想」(または SWI) は効果的な科学技術、工学および数学 (茎) 大学生のクラウドソーシングを通じて抗生物質耐性戦闘に戦略24 23と研究を学習最近高校生。サポート コース新規抗生物質 (http://www.smallworldinitiative.org) を生成する新しい土壌微生物を識別する作業が含まれます。未知の抗生物質の主要な源は放線菌種は土の広い範囲で発見、水の生息地25,26,27,28、続けますといわれています。 29,31。最近、当研究室と他の作業を検出し、信号形態と抗生物質生産7,32を含む、開発を規制する放線菌遺伝子の特徴 33。これらの遺伝子発現の変化量と生成される抗生物質のタイミングの変更あります。新しい種と新しい抗生物質生産変異体の熟練した表現型解析は重要である続けます。新しい講師と生徒は、創薬の分野への主要な貢献者になるように、細菌の表現型解析にトレーニングはこれらの初心者個人の成功に必要です。さらに、これらの実験は高校幹または大学微生物学教育研究所の扱いやすいです。設定教育実習で基本的な微生物遺伝的原理のデモンストレーションを表します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="543">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:197px;">50% Glycerol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">G5516</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Immersion Oil (Type DF)</td>
			<td>Cragille&#160;</td>
			<td>16482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lens Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Water</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>G-3250-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Toothpicks (flat)</td>
			<td>Target</td>
			<td>081-22-1957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (10 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (200 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-200Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (1250 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wooden Applicators 6&#39;&#39;</td>
			<td>Solon Care</td>
			<td>070809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton Swabs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soy Flour&#160;</td>
			<td>Bob&#39;s Red Mill&#160;</td>
			<td>1516C164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 100%</td>
			<td>VWR amresco life science&#160;</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.8% NaCl (Saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBB9000V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.2 mL freezer tube</td>
			<td>NEST</td>
			<td>606101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultra low (-80&#176;C) freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryo Safety Gloves</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H13201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5856-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slips #1.5</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>64-0721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slides</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>63-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>2540E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phase-Contrast Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>624504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bunsen Burner</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>706706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (phosphate buffer saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WGA-FITC</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Clear nail polish</td>
			<td>OPI</td>
			<td>22001009000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 mL beaker</td>
			<td>Pyrex USA</td>
			<td>1000-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L beaker</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L flask</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S63274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 mL flask</td>
			<td>Pyrex USA</td>
			<td>4980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 mL graduated cylinder</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">500 mL graduated cylinder&#160;</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir Bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-271825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera for Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nitrile Examination Gloves (Med)</td>
			<td>Bio Excell</td>
			<td>71011002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>701077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visual and microscopic evaluation of streptomyces developmental mutants

放線菌は、世界中で発見され、抗生物質や他の代謝産物の広い配列を生成する、アクチノ バクテリア門に属する糸状土壌細菌です。放線菌の改変はさまざまな実験室での分析に従うよ特徴付けられた、非病原性の種であります。説明する表現方法はここでモデル放線菌; としてs. 改変を使用します。ただし、メソッドは、いくつかの密接に関連放線菌と同様に、この大きな属のすべてのメンバーに適用されます。表現型解析は環境で識別される放線菌の新種の特性評価に必要なまた放線菌の新規分離された突然変異系統の特性の重要な最初のステップです。表現の能力は細菌の開発、細胞分裂、染色体分配、信号 2 つ目のメッセンジャーの研究が含まれます放線菌研究のフィールドに入っている多くの新しい人のため重要です。新しい土壌微生物の分離により抗生物質発見の最近のクラウドソーシングはインストラクター放線菌研究の大学や高校のフィールドに新しい表現の訓練のための高められた必要性の学生になりました。この原稿は、細菌の伝播、ストレージ、および視覚および顕微鏡検査における特性評価のための方法を説明します。この記事を読んだ後新しい研究者 (微生物学教育研究所と市民の科学者) は放線菌の菌株を操作および視覚特性実験を開始することができるはず。

初期表現型解析実験、新しい種や系統の特性評価に必要な新しい種を特徴付けるために使用される DNA 交雑実験と系統分類への無料アプローチとして使用できます。放線菌の突然変異体のランダム変異導入法化学物質、紫外線などから生じる寒天プレートに直接、視覚的画面を通して識別される通常のトランスポゾン変異または。放線菌のコロニーは野生型、親のひずみと比較すると表現型の変化を検討しました。たとえば、軽く着色された菌糸、胞子形成の欠陥によって引き起こされる灰色の顔料の下位レベルまたはファジィ外観の欠如は菌糸形成 (図 1) でブロックを示す。多くの放線菌は、栄養菌糸または周囲の寒天の色素に抗生物質を生産します。S. 改変は、2 つの非色素物と同様、二つの色素性の抗生物質を生成します。アクチノロジンはブルー発色の抗生物質、undecylprodigiosin は赤色色素の抗生物質の45。初期視覚的植民地画面を受けた系統は単一コロニーのストリー キングに伝達されます。
次の可能性のある興味深い変異体の視覚的な識別、系統な顕微鏡検査を受けます。位相差顕微鏡はコントロール (図 2) と野生型ひずみを用いた発達障害の放線菌変異を調べることに特に適しています。野生型s. 改変コロニー通常 MS の寒天、30 ° C での成長の約 2 日間と胞子の長い鎖成長の 3 日間で空中菌糸を生成します。ライフ サイクルは、若干低速または他のタイプのメディアに高速に進行します。発育障害や遅延についての結論を描画するときに、変異体が野生型と同じ成長の条件の下で分析することが不可欠です。ハゲの変異体は、寒天に長期成長の後胞子を作り出す可能性があります。胞子形成のためか白い突然変異体が遅れると呼ばれる変異体のクラスは、胞子形成、形状やサイズの欠陥を有する農産物胞子の豊富なまたは灰色、成熟した胞子顔料46の単に農産物より低いレベルに減少を示す.他の変異体がこれまでに調査を遅延またはシグナル分子 (例えば、繰返し・ ディ ・ GMP47) の蓄積の影響を受けて変異体などライフ サイクルの進行に加速した可能性があります。
上記光顕微法の簡単なフォロー アップは、胞子形成隔壁の細胞壁を染色する染色染色体 DNA 核様体と蛍光に分類された小麦胚芽凝集素による蛍光顕微鏡です。染色、通常は染色 (図 3) は減少しているように思われた場合識別される可能性がありますよりも少ない DNA を含む胞子中赤 propidium ヨウ化を欠いている染色体を欠いている胞子になります。小麦胚芽凝集素は細胞壁を染色するされることがあります、染色パターン (すなわち、細胞分裂の欠陥) 細胞壁における相違点が観察されることがあります。S. venezuelae、別モデルとして最近使用されている種の図 4野生型株のライフ サイクルや液体45、感受性に力から高速放線菌は、明らかにする WGA FITC で染色されています。胞子形成の初期段階で一般的に見られる分裂隔壁のはしごのような配列です。
ここで説明されている初期フェノタイピング戦略は次になります: 1); のさらなる研究のための興味の突然変異系統の同定2) 新たに同定された変異と遺伝子が変異していることの潜在的な役割についての知識を取得しました。3) 問題の遺伝子の役割をさらに明確に使用することができます次の実験手順の後続シリーズの定式化。環境から新たに同定された放線菌、場合研究者は既に特徴付けられる放線菌の種と比較して潜在的な新しい種の知識を得る。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> 図 1: S. 改変の巨視的コロニーの表現型を示す代表的な寒天培地プレートの写真。野生型s ・改変の空中菌糸体の外観を灰色は発達の表現型を持つさまざまなランダムなトランスポゾン挿入変異体と比較して MT1110 (WT) をひずみ寒天プレートを示しています、ファジー。突然変異体は菌糸 [ハゲ (ビル)] または減らされた胞子色素沈着 【 ホワイト (whi) 】 と菌糸どちらか欠けています。トランスポゾン変異体挿入変異6、7のミニ Tn5 を使用して生成します。系統は、30 ° C で 5 日間の MS 寒天上に成長しました。シャーレの直径、100 mm。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> 図 2: 代表者を空中に示す位相差顕微鏡S. 改変白い突然変異体のフィラメント系統含むランダムなトランスポゾン挿入変異します。(A) 表示は均等に生産、同期の間隔を定期的に細胞の分裂を受けている代表的な野生型の空中フィラメントの形、サイズの胞子 (MT1110)。(B-F)残りのパネルは、ランダムなトランスポゾン変異を介して分離された各種の白い突然変異体の著しく異なる微細な表現型を示します。パネルBは、胞子形成を経ていませんが、代わりにフィラメント内の膨らんだ領域を生産している空中のフィラメントを示しています。長い矢印C D、およびFは、MIC42、MIC43、および TH49 の突然変異体の特徴である、異常に大きな胞子を示します。パネルDの短い矢印は、分離胞子コンパートメントの例を示します。Eパネルは TH10 変異株による産生胞子鎖の典型的な部分的に収縮の小さいコンパートメントを示しています。系統は、30 ° C で 5 日間の MS 寒天上に成長しました。変異体は、図 1で示されるように関係がありません。野生型の胞子は、長軸約 1.1 μ m です。スケール バー = 2 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> 図 3: 代表的な顕微鏡S. 改変の突然変異体の染色体分離の表現型を示すします。(A) A の表現図表示染色体変異の断続的な染色パターンと比較して (すべての胞子は、染色体 DNA を含んでいる) の胞子の鎖の典型的な野生型、定期的に間隔染色外観分離の欠陥。(B) パネルの各ペアを示し、同じ胞子チェーンが左側に差動干渉の対照 (DIC) のイメージで観測された propidium ヨウ化染色蛍光イメージが右側に表示されます。野生型表現型、( b) は、2 つのランダムなトランスポゾン挿入変異 (c、 d e、 f) と比較されます。矢印は、DNA を欠いている胞子を示します。系統は、30 ° C で 5 日間の MS 寒天上に成長しました。示す変異体は、図 1と図 2の関係がありません。スケール バー = 1 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> 図 4: s. venezuelae野生型株の蛍光顕微鏡写真に染まった WGA FITC 。空中フィラメントの A (A) 図がインデントを滑らかに見えるし、胞子形成の初期段階を示す細胞壁の汚損のはしごのような配列と比較して位相差顕微鏡による胞子形成の目に見える印を持たないその同じフィラメントの WGA FITC を使用して蛍光顕微鏡下で始まった。(B) 野生型s. venezuelaeの顕微鏡写真。(、) の滑らかな航空のフィラメントが胞子の鎖の間で存在します。(b) パネルに表示菌糸内 1 つ、開発の初期段階で空中のフィラメントは、細胞壁形成のはしごのような配列を所有しています。矢印は、それは発達に関連付けられている胞子形成を受けるよう単一空中フィラメント内で同期的に発症する WGA FITC で染色してクロス壁の間隔が規則的に形成を示しています。ひずみは 30 ° C で 38 時間 (Maltose、 Yイースト抽出物、 Malt エキス) MYM MYM 寒天上に成長しました。スケール バー = 2 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

放線菌突然変異体のビジュアルと顕微鏡的評価

ここで重要な薬理学的細菌属放線菌の表現型解析を開始する研究者紹介初心者のためのプロトコル。

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

17.6K ビュー.  Otterbein University. ここで重要な薬理学的細菌属放線菌の表現型解析を開始する研究者紹介初心者のためのプロトコル。

ビデオ: Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

ビジュアル分析手法と免疫学的データの解析を容易に

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

免疫・感染学

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

分離するために遺伝学的スクリーニングトキソプラズマホストセル出口変異体

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.