Bu çalışmada mali kısmen tıbbi ve biyolojik araştırma (PYM için) Gottfried ve Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (için MW ve PYM) ve araştırma havuzu Fribourg Üniversitesi (PYM için) Novartis Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ek hibe İsviçre hükümetinin mükemmellik burs (için KAFİLE ve SM) yabancı bilim adamları için içerir. Isabelle Fellay ve Solange Kharoubi Hess teknik destek için teşekkür ederiz.

İnsan RBCs Swissethics (swissethics.ch) yönergeleri doğrultusunda sağlıklı bağış kan elde.
Not: P. falciparum parazit kültür (3D 7) ve EV üretim daha önce Mbagwu tarif edildi ve ark. 11 P. falciparum insan bir patojen olduğundan, işleme için yerel düzenlemelere bakın. Kültürler tüm steril tutulmalıdır zaman.
1. Floresans EVs etiketleme
Not: Aşağıdaki yordam, stabil bir yeşil flüoresan boya (PKH67) dahil etmek için etiketleme teknolojisi EV membran lipid bölgesinin büyük Alifatik kuyruklu yararlanır. Reaksiyon 200 µL PKH67 20 µM son konsantrasyon içeren birim boyama son gerçekleştirilir. Tüm adımları izleyerek, ortam sıcaklığında (20-25 ° C)
<ol><li>PBS 1 ml microcentrifuge tüp içinde yer 100 µg EVs.</li>
	<li>Cips için EVs 7 min için maksimum hızda (20.000 x g) bir microcentrifuge tüp santrifüj kapasitesi. Not: hemozoini EVs içinde mevcut olduğu için kırmızı-koyu kahverengi Pelet dikkat edilmelidir. EVs lysed ise o zaman süpernatant kırmızımsı.</li>
	<li>Santrifüjü sonra süpernatant dikkatli bir şekilde, herhangi bir EVs kaldırma önlemek için Aspire edin. Not: kalan arabellek EVs Dilüent C'de tekrarlanabilirlik ve boyama verimliliği artırmak için resuspending önce mevcut miktarını en aza indirmek.</li>
	<li>EV Pelet Dilüent C 100 µL içinde resuspend (2 X EV süspansiyon) ve yavaşça damlalıklı tam dağılım sigorta için.</li>
	<li>Yeni bir microcentrifuge tüp hazırlayın ve PKH67 ethanolic boya çözüm 4 µL karıştırmak için seyreltici C. girdap iyi 100 µL için ekleyin. Hemen boyama önce bu 2 x boya çözüm (40 µM) hazırlayın. Not: heterojen boyama önlemek için PKH67 ethanolic boya çözüm doğrudan EV Pelet eklemeyin.</li>
	<li>Hızla, 2 EV süspansiyon (Adım 1.4) X 100 µL 2 boya çözüm (Adım 1.5) X 100 µL ile birleştirir. Sonra aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından örnek karıştırın.</li>
	<li>Işık ve mix 3 - 4 kez 5 dk kuluçka sırasında vortexing tarafından korunan EV/boya süspansiyon adım 1.6 5 min için kuluçkaya. Not: boyama çok hızlı olduğundan EV/boya süspansiyon için daha uzun süreleri kuluçka hiçbir avantaj sağlar.</li>
	<li>Serum eşit bir hacmi (200 µL) ekleyerek boyama reaksiyonu durdurmak ve 1dk için fazla boya bağlantısına izin kuluçkaya. Not: boyama durdurmadan önce EVs üzerinden serum Santrifüjü 20.000 x g 20 dk için de tarafından tüketmek.</li>
	<li>3 kez PBS ile yıkama ve 20.000 x g 5 dakika süreyle aşağı spin Resuspend EVs 1 µg/µL son bir konsantrasyon ulaşmak için PBS 100 µL içinde.</li>
</ol>2. EVs Confocal mikroskobu tarafından alımını görselleştirmek
Not: EV içselleştirilmesi cam coverslips üzerinde yetiştirilen endotel hücreleri tarafından izlenmesine aşağıdaki protokolünü açıklar. Endotel hücreleri12' açıklandığı gibi yarı ölümsüzleştirdi insan kemik iliği endotel hücreleri vardır.
<ol><li>Steril bir ortamda çalışmaya, coverslips % 0,01 Poli-L-lizin, oda sıcaklığında (RT) 10 min için bir fazlalığı ile kat.</li>
	<li>Poli-L-lizin çözüm Aspire edin ve coverslips tamamen kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanan bir uygun endotel hücre sayısı gerçekleştirin.</li>
	<li>Tam endotel hücre büyüme Poli-L-lizin-kaplı coverslips ek karışıma içeren ve bir monolayer büyümek hücreleri izin orta 1 mL 1 x 105 endotel hücrelerinde aktarın. Not: Orta hücreleri bir monolayer oluşturmak için ve sıkı kavşaklar oluşturmak için izin büyüme faktörleri içerir.</li>
	<li>Hücreleri bir monolayer formu, dikkatli bir şekilde orta Aspire edin ve hücreleri yıkamak için taze orta 1 mL ekleyin. Yıkama bir kez daha yineleyin. PKH67 etiketli EVs 50 µg ekleyin ve 4 h için kuluçkaya. Not: alımı için en uygun zaman noktası bulmak için bir zaman ders gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>4 h sonra orta Aspire edin ve aşırı ve ilişkisiz EVs kaldırmak için 3 kez PBS hücrelerle yıkayın. Hücreleri 15dk için PBS içinde % 3 paraformaldehyde çözüm ile düzeltmek. Not: Metanol fiksasyon işlemi sırasında aktin kesintiye uğratabilir; Bu nedenle, herhangi bir metanol Fiksajlar veya diğer solvent bazlı Fiksajlar içeren kaçınmak en iyisidir. Formaldehit metanol-Alerjik bir sabitleştirici kullanılması önerilir.</li>
	<li>Hücreleri 3 kez PBS ile yıkayın. Dikkatle 250 µL % 0.1 eklemek PBS hücreleri permeabilize Triton X-100. RT 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez PBS ile yıkayın. RT non-spesifik bağlama engellemek için 30 dk 400 µL engelleme arabelleği (PBS %5 BSA) ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Boyama çözüm sulandrarak 5 µL 200 µL PBS/1% BSA her kapak notu başına phalloidin hisse senedi çözümün hazırlayın. Damlalıklı 200 µL boyama çözüm coverslip Tarih ve 20 dk RT. az için kuluçkaya</li>
	<li>3 kez PBS ile yıkayın. DNA için 30 counterstain s Höchst 33342 adlı PBS 200 µL 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile.</li>
	<li>2 coverslip x 400 µL PBS ekleyerek yıkayın. Dikkatle coverslip Forseps ile kapmak ve üst kısmında bir cam slayt üzerinde ortam takma antifade bir damla tersine çevirin. Yavaşça bir doku ile aşırı medyayı çıkarın ve her tarafı oje ile mühür.</li>
	<li>4 ° C'de ışık korunuyorsunuz slaytları depolama</li>
	<li>Lazer uyarilmalar 405, 488 ve 543 nm ve 63 X, 1.3 NA petrol amacı ile floresan emisyonlarının 450-470 nm (mavi), 505-530 nm (yeşil) ve 620 confocal mikroskop kullanarak hücreleri görselleştirmek nm. Not: Tipik F-aktin boyama sonuçları şekil 1' de gösterilmiştir.</li>
</ol>3. endotel hücre geçirgenliği
Not: Endotel hücre geçirgenliği rodamine B isothiocyanate-dextran (ortalama MW 70.000) transferini ölçerek endotel hücre monolayer değerlendirilir. Dextran vasküler geçirgenliği eğitim için mükemmel bir araç sağlar.
<ol><li>%0,4 Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanarak uygun endotel hücreleri saymak.</li>
	<li>İzdiham 24-iyi doku kültürü ekler (0.4 µm gözenek boyutu) ve izin bozulmamış farklılaşmış monolayers oluşturmak en az 5 gün için 105 hücrelere x 0.6 yoğunluğu, endotel hücreleri plaka. Orta iki günde yenileyin.</li>
	<li>Hücreleri bir monolayer ulaştığınızda, EVs yük (1 ml 50 µg) üst odası üzerinde. Rodamine-dextran 20 mg/mL nihai bir konsantrasyon üst kuyuda ekleyin. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Floresan dextran transfer altına de floresan emisyon 40 µL orta aliquots üzerinden ölçerek izlemek. Çok etiketli Mikroplaka okuyucu 544 nm uyarma ve 590 nm emisyon ölçümleri için ayarlayın. Not: Dağınık dextran miktarda hisse senedi çözüm ile kurulan kalibrasyon eğrileri kullanarak sayısal. Buna ek olarak, Kinetik deney süresi boyunca (Şekil 2) dış Kamara orta küçük örnekleri kaldırarak gerçekleştirilebilir. Bile herhangi bir tedavi, dextran hücre monolayer yaygın.</li>
</ol>4. puromisindir duyarlılık belirlemek
Not: hücre hatları ile lentivirus transducing önce o belirli hücre satır için seçili bir ilacın öldürmek eğrisi belirlemek önemlidir. İlaç konsantrasyonu bütün hücreleri öldürmek gerekli en az miktarını belirlemek için seçilen ilaç artan dozlarda kullanılarak bir doz yanıt deneme gerçekleştirin. Çünkü her memeli hücre satırı önce deneme, farklı bir duyarlılık antibiyotik en iyi konsantrasyon öldürmek eğrisi titrasyon aşağıda ayrıntılı olarak geliştirerek tespit edilmelidir.
<ol><li>Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 1 x 105 hücre/mL tam endotel hücre büyüme ek karışımı içeren ortamda bir konsantrasyon, endotel hücreleri resuspend.</li>
	<li>Plaka 1 x 104 100 µL endotel hücre büyüme ortamının son hacmi bir 96-şey plaka hücrelere.</li>
	<li>0.1-10 µg/mL konsantrasyonu elde etmek için antibiyotik içeren orta 100 µL ekleyin (bkz. şekil 3).</li>
	<li>Hücre canlılığı 2 günde 20 X amacı istimal ışık mikroskop altında incelemek. 10-14 gün için hücreleri kültür ve puromisindir bağlı olarak hücre büyümesini her 2-3 gün içeren ortamı değiştirin.</li>
	<li>10 µL/iyi MTS reaktif her kuyuya, mix, eklemek ve standart kültür koşullarında 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Plaka kısaca üzerinde bir sallayıcı ve Absorbans 490 bir plaka okuyucu kullanarak tedavi ve tedavi edilmezse hücrelerinin ölçmek nm (şekil 3).</li>
</ol>5. iletim Lentiviral vektör ile endotel hücrelerinin
<ol><li>Tam orta 1 mL 1 x 105 endotel hücrelerinde iletim önceki gün plaka. Hücreleri 50-%80 confluency ulaştığında iletim gerçekleştirir.</li>
	<li>Lentivirus buz erime ve donma-çözülme döngüsü önlemek için viral stoklarının aliquots olun. Spin aşağı 200 x g de malzeme için 30 s, tüpler üzerinde yayılımı önlemek için açmadan önce.</li>
	<li>Hexadimethrine bromür 8 µg/mL nihai bir konsantrasyon hücreleri ekleyin. Not: bazı durumlarda hücreler için zehirli olabilir ancak Hexadimethrine bromür iletim verimliliği yardımcı olur. Bu nedenle, en iyi toplama bir öldürme eğrisi iletim önce gerçekleştirerek tespit edilmelidir.</li>
	<li>Karışımı yavaşça için plaka girdap. Enfeksiyon (MOI) uygun bir çeşitlilik viral parçacıkların (0,5-2 x 106 parçacıklar arasında) uygun miktarı ekleyin ve hafifçe 30 plaka girdap karışımı s.</li>
	<li>RT, santrifüj iletim verimliliği artırmak için 300 x g de 45 dakika için hücre viral parçacık karışımda santrifüj kapasitesi. 37 ° C hücre viral parçacık karisimin gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde viral partikül içeren orta çıkarın ve uygun şekilde atın. Eski yerine koymak o ile taze, Önceden ısıtılmış tam kültür orta.</li>
	<li>Başlangıç seçimi ile puromisindir ikinci gün: Orta kaldırmak ve taze orta bölüm 4 (şekil 3) önceden belirlendiği gibi puromisindir doğru konsantrasyon içeren ile değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri puromisindir seçimden sonra hasat ve üreticinin yönergeleri izleyerek kiti izole bir RNA kullanarak RNA yalıtır.</li>
	<li>Seçili cDNA sentezini gerçekleştirmek bir ters transkripsiyon kullanarak miRNAs Kiti ( Tablo reçetesigörmek).</li>
	<li>QPCR tepki gösterdi protokolü13göre ayarlayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Malaria Report 2015. , (2015).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites.">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li><li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation.">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system.">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li><li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles.">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li><li>Szempruch, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+from+Trypanosoma+brucei+Mediate+Virulence+Factor+Transfer+and+Cause+Host+Anemia.">Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia.</a> Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria.">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727 (2016).</li><li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria.">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li><li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line:+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li><li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs.">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+docking+at+the+cellular+port:+Extracellular+vesicle+binding+and+uptake.">Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake.</a> Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).</li><li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes.">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li><li>Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis,+clinical+features,+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria.">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li><li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions.">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis.">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Çeşitli parazitler, Toxoplasma, Trypanosoma, LEISHMANIA ve Trikomonas gibi EVs virüslü konak hücre sürümü tetikler. Patojenler bağlı olarak yayımlanan EVs konak immün yanıt modüle veya hücresel iletişim parazitler6arasında arabuluculuk. Henüz, bu küçük veziküller sıtma hastalığı için nasıl katkıda bulunduğunu düşündüren çok az kanıt var. Burada, EVs fonksiyonu Plasmodium enfeksiyon sırasında araştırmak için çeşitli yollar anlatmıştık. Örneğin, EVs alımını alıcı hücreler in vivo tarafından etkili bir şekilde PKH67 floresan boya ile Will tarafından izlenebilir. Birden çok denetimi etiketleme özgüllüğü sağlamak için yapılması gerekiyor. Dilüent C ile karışınca PKH67 boya formu toplamları için eğilimindedir ve bu nedenle boya EVs non-spesifik boyama belirlemek için yalnız bir denetimini eklemek gerekli olan unutmamak gerekir. Confocal mikroskobu yüzeye bağlı ve gerçekten alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş veziküller birbirinden ayırmak için seçim yöntemidir. Buna ek olarak, izlemek ve hücreleri tarafından alınan veziküller sayısını izlemek için mükemmel bir araç sağlar. Ancak, EVs alıcı hücreler14' te nasıl işleneceğini belirsizdir; Bu nedenle, bir zaman ders performans zaman-puan 2, 4 ve 8 h, kullanarak alımı için en uygun koşulları belirlemek için çok yararlı olabilir. Hücre altı bölme işaretlerini ilavesi confocal mikroskobu tarafından hücrelere EVs izlemek için kullanılabilir. EV alımı membran fusion veya endositoz15gerçekleşmesi için gösterilmiştir. Füzyon octadecyl rodamine B (R18) ile etiketleme EVs tarafından izlenebilir. Floresans16bir artışa yol açar R18 seyreltme EVs füzyon hücresel membranlar ile sonuçlanır. EVs alımını endositoz tarafından aktin, Mikrotubul ve dynamin10belirli inhibitörleri kullanarak okudu olabilir.
EVs fizyolojisi çalışmaya PKH boyalar ile doğrudan iRBCs etiket ve endotel hücreleri ile iRBCs ortak kültür mümkündür. Burada hücreleri farklı bir ortam gerektirir ve gaz besteleri ve EV transfer miktarı azalmış olabilir sorun. Ayrıca, veziküler protein flüoresan etiketi ile erimiş donör hücreleri vitro ve içinde vivoifade edilebilir. Ancak, öylesine uzakta o iRBCs ile test edilmemiştir
Virüslü RBCs beyinde serebral sıtma17neden sorumlu olduğu düşünülen bir işlem microvasculature için cytoadherent vardır. Bu nedenle, parazit malzeme transferi EVs endotel hücreleri ve dolayısıyla damar işlevi18etkilemek muhtemeldir. Burada, açıklanan vitro tahlil örnek endotel hücrelerinin temel özelliklerinden bazıları onun geçirgenliği19araştırmak için kolay bir yol sağlar. Ek test AYLARININ veya immunostaining ZO-1 gibi sıkı bağlantı bütünlüğü10hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir.
Ayrıca, vitro modeli moleküler mekanizmaları arasında parazitler ve konak hücreleri hücresel iletişim arkasında çalışmak için güçlü bir araç olduğu ortaya çıkıyor. Alımı yanı sıra, bu kurulum moleküler mekanizmaları incelenmesi bu süreçte yer verir. Örneğin, miR451a aktarmak alıcısı hücreleri gerçek zamanlı PCR ve floresan situ hibridizasyon tarafından izlenen. Ayrıca, bu küçük RNA vasküler işlev10rolü doğrudan adrese belirli bir miRNA overexpressing hücre satırlarını oluşturmak nasıl açıklar. Ancak, birden çok denetimi iletim hücresel fonksiyon etkileyebilir beri sigara transduced hücreleri, testi dahil olmak üzere yapılmalıdır. Ayrıca, miRNA inhibitörleri miRNAs etkisini nötralize etmek için kullanılabilir.

Dünya Sağlık Örgütü göre 2015 yılında dünya çapında sıtma 212 milyon yeni vaka vardı ve yaklaşık 429,000 kişi öldü, esas olarak yaş1beş yaş altı çocuklar. Genellikle vasküler disfonksiyonu ile ilişkili olan, ağır hastalıklar için önde gelen mekanizmalar kötü tanımlanmış2kalır. Plasmodium- iRBCs küçük bi-lipid membran küreler ekstraselüler veziküller (EVs) bilinen salgılar. Bu EVs potansiyel enfeksiyon enfeksiyon süreci ve konak immün yanıt ilgili bilinir; Ancak, az sıtma enfeksiyon3sırasında bu küçük veziküller özdeş işlevini hakkında bilinir. Bu iki önemli roller oynamak mümkündür: bir yandan, makrofajlar4,5; aktive ederek patogenezinde katkıda ve öte yandan, hücresel iletişim parazitler arasında parazitler ve ana bilgisayar6,7arasında arabuluculuk. Aslında, parazitler proteinler veya nükleik asitler birbirleriyle EVs üzerinden aktarabilirsiniz. Örneğin, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs virülans faktörü Serum Resistance-Associated (SRA) aktarabilir ve diğer T. brucei ve ana bilgisayar eritrositler8hedefleyebilirsiniz. Ayrıca, P. falciparum- iRBCs arada her diğer nükleik asitler EVs içinde aktarma tarafından iletişim. Bu parazitler optimize etmek ve onun büyüme eşitlemek sağlar. Aslında, EVs, gametocyte dönüşüm büyük düzenleyici olmak ve bu nedenle iletim sahne7düzenlenmesi için katkıda bulunmak.
Sadece EVs parazitleri düzenleyen, onlar da parazit ana bilgisayar etkileşimi aracılık. Biz son zamanlarda EVs iRBCs gelen insan endotel hücreleri tarafından gerçekleştirilen ana bilgisayar kaynaklı mikroRNA (miRNAs; 21-25 nükleotit9aralığındaki küçük RNA türü) içeren keşfetti. EVs miRNAs Ago2 ile karmaşık istikrarlı bir form (RNA kaynaklı damping üye karmaşık), hangi bir kez alıcı hücrelere teslim kabil özellikle gen ifadesinin susturulması ve hücre10bariyer özelliklerini etkileyen. Standart protokolleri EVs işlevi araştırmak için geliştirilmiştir. Burada, biz ilk tarif onların alımını alıcı hücreleri tarafından araştırmaya EVs floresan etiketlemeyi sağlayan bir protokol. Buna ek olarak, confocal mikroskop kullanarak, bu EV'ın kaderi hücre içindeki izlemek mümkündür. Çeşitli floresan boyalar EVs izlemek için kullanılabilir. Amin-reaktif boya, 5-(and-6) Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) ve Calcein-AM olmak floresan bir kez veziküller içinde. Daha parlak ve daha düzgün bir sinyal verir, çünkü biz amfifilik etiket, PKH, kullanmayı tercih eder. Bu yaklaşım EVs ve alıcı hücreler arasındaki etkileşimleri anlamak için önemli bilgiler sağlar. Bazı durumlarda EVs hücreleri yüzeye bağlamak iken, bazı veziküller hızla alınır. Alımı EVs hangi onlar yasal işlevlerini uygularlar hücrelere onların yükleri teslim.
Burada, endotel hücreleri vitro bariyer fonksiyonu bir floresan dextran hücresel monolayer aracılığıyla transfer miktarının ölçmek için bir protokol açıklayın. Daha hassas tarayıcıları gibi radiolabeled işaretleri kullanılabilir. Ancak, onlar için özel güvenlik önlemleri gerektirir. Vitro bariyer fonksiyonu gibi sıkı bağlantı bütünlüğü ölçen transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ), ölçmek için diğer deneyleri adlı biri yok. Sonunda ZO-1, sıkı kavşak protein ayirt tarafından görüntülenmesi iyi10olarak sıkı kavşak dürüst değerlendirme sağlar. EVs potansiyel düzenleyici özelliği ile birkaç yükleri içeren karmaşık ve türdeş olmayan varlıklar olduğundan, alıcı hücreye üzerindeki etkisini incelemek için belirli bir RNA overexpress yararlıdır. Bu nedenle, ayrıca faiz10miRNA ifade istikrarlı hücre satırlarını oluşturmak için amaçlayan bir iletişim kuralını tanımlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher - Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin CF594</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B isothiocyanate&#8211;Dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R9379-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon&#160;for plate 24 wells</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth&#160;Medium MV</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9620-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>K300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexadimethrine bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HLMIR0583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4366597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-mir-451a&#160;RT/750 PCR rxns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6 snRNA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4440038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

Sıtma bir yaşamı tehdit eden hastalık Plasmodium parazitler tarafından neden, P. falciparum ile en yaygın Afrika kıtasında ve en sıtma ile ilgili boyunca genel olarak varlık. Doku, vasküler disfonksiyon ve inflamatuar yanıt parazit tutma gibi birçok etkene sıtma enfekte kişilerde hastalığın evrim etkilemek. P. falciparum-virüslü kırmızı kan hücreleri (iRBCs) yayın çeşitli türde Patogenez ve hücresel iletişim parazitler ve ev sahibi arasında arabuluculuk kargo molekülleri içeren küçük hücre dışı veziküller (EVs). EVs verimli bir şekilde hangi onlar işlevlerine modüle hücreleri tarafından alınır. Burada EVs rolde parazit-ana etkileşimler adrese stratejileri tartışmak. İlk olarak, biz bir yeşil hücre bağlayıcı boya kullanarak etiketleme ve endotel hücreleri tarafından EV içselleştirilmesi izlemek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. İkinci olarak, biz geçirgenliği endotel hücre monolayer fluorescently etiketli dextran kullanarak ölçmek için basit bir yol raporu. Son olarak, biz küçük kodlamayan RNA molekülleri endotel hücre işlevindeki rolünü araştırmak nasıl göstereceğim.

Burada, konak hücreleri ile EVs etkileşimleri araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Fluorescently etiketli EVs alımını confocal mikroskobu (şekil 1) tarafından kontrol edilmektedir. EVs kuluçka zamanla alımını izlemek için optimize edilebilir ancak endotel hücreleri verimli EVs götür. Bir daha iyi yerelleştirme EVs için hücrelere, aktin phalloidin ile leke. Sonra hangi üst kısmında bir monolayer endotel hücrelerinin büyür bir filtre membran kullanın. Rodamine B isothiocyanate-dextran filtre membran üst TMMOB uygulanır ve endotel monolayer geçirgenliği floresan dextran transfer içine alt Kamara (şekil 2A) izleyerek ölçülür. Genellikle, endotel hücreleri geçirgenliği üzerine kuluçka EVs (şekil 2B) giderek artan miktarda ile etkilenir. Onlar wells, aksi takdirde boya hızlı diffüz bir monolayer oluşturacak emin olmak birkaç gün için hücreleri büyümek önemlidir. Tedavi olmadan bile, dextran yavaş yavaş hücre monolayer diffüz unutmamak gerekir.
MikroRNA anahtar bileşenleri EVs ve alıcı hücrelere transferden sonra onlar gen ifadesinin düzenlenmesi. Özellikle miRNAs rolünü araştırmak için alıcı hücreye satırında overexpress çok yararlı olur. Burada biz miRNAs endotel hücrelere transduce anlatan. İlk adım stabil transduced hücreleri (şekil 4A) seçmek için endotel hücreleri öldürür puromisindir konsantrasyonu saptayacak yeterliliğe oluşur. Son olarak, miRNAs ifade düzeyini kontrol ve qPCR (şekil 4B) tarafından doğrulandı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig1.jpg"> Şekil 1: EVs kapladığı endotel hücreleri tarafından. Arıtılmış EVs PKH67 ile yeşil ve endotel hücreleri monolayer ile 4 h için inkübe etiketli. Tedavi edilmemiş endotel hücreleri bir negatif kontrol kullanılır. Geniş ilişkisiz EVs kaldırmak için yıkadıktan sonra hücreleri aktin (kırmızı) leke phalloidin ve çekirdek (mavi) leke Höchst 33342 ile lekeli. Hücreleri tarafından confocal mikroskobu tespit edildi. Görüntüleri lazer confocal mikroskop ve 63 x 1.3 NA petrol amacı istimal alındı. Höchst 33342 405 IncrediMail nm ve 450-470 nm'de (mavi); toplanan emisyonları ile PKH67 488 IncrediMail nm, emisyon toplanan 505-530 nm (yeşil); ve Phalloidin-594 543 IncrediMail nm, 620 toplanan emisyon nm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57067/57067fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig2.jpg"> Şekil 2: endotel bariyer üzerinde EV Alım etkisi. (A)şematik rodamine etiketli dextran Difüzyon: endotel hücreleri izdiham üst kısmında bir filtre membran için yetiştirilen, floresan dextran üst odasına uygulanır ve membran ile zaman içinde dağılır. EVs etkisi geçirgenliği alt Kamara dextran Difüzyon oranı ölçerek EVs ek üst odasına sonra değerlendirilir. EVs miktarda (bir artanB) endotel hücreleri ile inkübe. Rodamine etiketli dextran zaman içinde bir trans-şey zar arasında transferini geçirgenliği ölçülerini sağlar. Endotel tabakası arasında geçirgenliği kuluçka 2 h ile 50 ve 100 µg/mL EVs sonra önemli ölçüde artar. Verileri 3 deneylerden demek (± s.e.m.) temsil eder. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57067/57067fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig3.jpg"> Şekil 3: puromisindir titrasyon. Puromisindir (10 mg/mL) hisse senedi çözüm RPMI takıma ısı inaktive % 10 (56 ° C, 30 min) fetal buzağı serum, 2 mM glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, 100 U/mL penisilin/streptomisin ile 1640 yılında seyreltilmiş. 15 µL toplam 10 mL tüp A. ortamda eklenir Sonra 7.5 mL tüp A'dan çözeltisi RPMI 2.5 ml tüp B. karıştırılır Son olarak, seyreltme 100 µL 7.5 µL/mL, 5,62 µL/mL nihai bir konsantrasyon ve benzeri vermek için hücreleri 100 µL için eklenir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57067/57067fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig4.jpg"> Şekil 4: üretimi endotel hücre miR451a overexpressing. Puromisindir endotel hücreleri üzerinde öldürme eğrisini(a)belirlenmesi. Endotel hücreleri artan dozlarda, puromisindir ile inkübe. Canlılığı 72 h sonra MTS tahlil tarafından ölçüldü. Verileri bir temsilcisi deney (± s.e.m.) ortalamasını temsil eder. (B) RNA'ların miR451a overexpressing endotel hücrelerden türetilmiş veya bir negatif kontrol hasat ve miR451a transkript tarafından gerçek zamanlı PCR sayılabilir. qPCR sonuçları U6 kahya gen kullanarak 2-Ct yöntemi tarafından normalleştirilmiş ve (± s.e.m.) demek gibi ifade (n = 3 deneyler). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57067/57067fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection at JoVE.com

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Bu çalışmada, enfekte Plasmodium falciparum eritrositler tarafından yayımlanan ekstraselüler veziküller (EVs) rolünü araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Özellikle, endotel hücreleri ile EVs etkileşimleri odaklanmak.

Sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

evaluation-of-extracellular-vesicle-function-during-malaria-infection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Görüntüleme.  University of Fribourg. Bu çalışmada, enfekte Plasmodium falciparum eritrositler tarafından yayımlanan ekstraselüler veziküller (EVs) rolünü araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Özellikle, endotel hücreleri ile EVs etkileşimleri odaklanmak.

Video: Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü<em&gt; Anofel</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Evaluation of Blood Lactate and Plasma Insulin During High-intensity Exercise by Antecubital Vein Catheterization

The measurement of metabolic and endocrinal markers during physical activity is of relevance to understanding the physiological implications of different exercise modalities. During some exercise modalities (e.g., high-intensity interval exercise), blood metabolites and hormonal levels change in short periods of time. In the present study, we describe a method to catheterize the antecubital vein, which allows the collection of several blood samples during exercise. Insulin and venous lactate concentrations were measured during high-intensity exercise by the application of the described method. The exercise consisted of three 30 s bouts of high-intensity exercise separated by 4 min of recovery. After the last recovery period, a Wingate test was performed. Blood samples from the antecubital vein were obtained before and after each 30 s bout and before and after the Wingate test. As a result, it was possible to evaluate the plasma insulin and venous blood lactate variations during the exercise.

Here we present a protocol to obtain several blood samples from the antecubital vein during high-intensity interval training. This protocol may be useful for the measurement of blood metabolites and endocrinal markers during exercise.

Kolundaki ven kateterizasyonu tarafından yoğun egzersiz sırasında kan laktat ve plazma insülin değerlendirme

The measurement of metabolic and endocrinal markers during physical activity is of relevance to understanding the physiological implications of different ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA2 + yanıtları görüntüleme

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

Kızılötesi termometre pasif sistemik anafilaksi ve gıda Anti değerlendirme sırasında kullanarak fare vücut sıcaklık ölçümü

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Yüksek Verim Ekstrasellüler Vezikül Preparatlarının Virüsten Uzaklaştırılması

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...