Yazarlar Eric Fonteyn mükemmel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser KU Leuven tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (iki, hayır vermek. G.485.08) ve Fondation Dormeur Vaduz.

1. hücre kültürü bakımından
Not: 1 ve 2 altında açıklanan tüm adımları laminar akışı kabine steril koşullarda yapılmaktadır.
<ol><li>T75 kültür şişeler 37 ° C ve % 5 CO2 oksijen kuluçka hücrelerinde büyür. Not: Bu tahlil Jurkat hücreler (Yani, endogenously CXCR417hızlı insan lösemik T lenfosit hücreleri) kullanılır. CXCR4 ifade hücre yüzeyinde Akış Sitometresi aracılığıyla hücre kültürü çalışmalarının boyunca değerlendirilmelidir. Akış Sitometresi yordam ve reaktifler reseptör ifade seviyeleri hücre yüzeyinde, ancak, bu protokol kapsamında değildir ancak olmuştur belirlemek için bir açıklama daha önce17açıklanan.</li>
	<li>Jurkat hücreleri % 80-85 ulaşana kadar süspansiyon confluency büyümesine izin. Roman bir şişesi hücrelere passaging önce oda sıcaklığında (RT) ulaşmak tüm reaktifler izin.</li>
	<li>20 mL taze tam büyüme orta (RPMI-1640 orta, % 10 fetal sığır serum (FBS), 2 mM glutamin) bir roman T75 kültür şişesi için ekleyin.</li>
	<li>Jurkat hücre süspansiyon 5 mL (hücre süspansiyon 25 mL içeren) özgün T75 balonun roman T75 kültür şişesi ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2 oksijen kuluçka kuluçkaya.</li>
</ol>2. CXCL12, tahlil arabellek ve Jurkat hücreleri için hazırlanması tahlil bağlama rekabet.
<ol><li>CXCL12AF647 (20 µg/mL; bkz: malzemeler tablo ve Kimyasalları) stok çözeltisi (-80 ° C'de, karanlıkta saklanan) lyophilized reaktif % 0,01 ile (birim/birim) Polysorbate 20 takıma ultrasaf su çözülerek hazırlayın. Tek Kişilik Kullanım aliquots ışıktan korunan-80 ° C'de hisse senedi bu çözümden saklayın.</li>
	<li>Tahlil arabellek 40 mL HEPES (1 M, 20 mM son konsantrasyonu) ekleyerek 200 mL Hank'in dengeli tuz solüsyonu (HBSS, 10 x, fenol red ve sodyum bikarbonat, 1 x son toplama olmadan) için hazır olun. 2 L. eklemek 4 g (%0,2 ağırlık/hacim) sığır serum albumin (BSA) son bir hacim elde edilir ve BSA manyetik yoluyla dağıtılması ultrasaf su Ekle karıştırma. Son olarak, pH 7,4 (kullanmak NaOH bunun için) için ayarlamak ve solution'ı (bakınız tablo malzemeleri ve Kimyasalları) 0.2 µm gözenekleri filtre manifold vakum kullanarak. Not: Bu tahlil arabellek tüm adımlarını daha fazla iletişim kuralı kullanılır.</li>
	<li>Sayısı sayısı ve hücrelerin canlılık. Bunun için hücre süspansiyon örneğini alın ve fosfat tamponlu tuz (PBS) oranında seyreltin. Not: Rutin bir otomatik hücre canlılığı analizörü kullanın (bkz. tablo malzemeleri ve Kimyasalları) hücre süspansiyonlar değişik konsantrasyonlarda sayma yeteneğine sahip. Hücre sayımı için hücre süspansiyon 1,5 ml ( Örneğin, 0.1 mL 1,9 ml PBS, diğer dilutions da mümkündür) PBS 0.5 mL seyreltik. Trypan mavi boya dışlama yöntemi üzerinde dayanır, bu yöntemin kullanılması oldu daha önce açıklanan26. Birkaç diğer cihazlar cep telefonu numarasını ve eşit derecede iyi çalışması gerekir canlılığı sayım için ticari olarak kullanılabilir.</li>
	<li>(Yani, ~ 24 x 106 hücre tahlil bir tam 96-şey plaka ile çalıştırmak için) hücreleri için istediğiniz sayıyı bir steril 50 mL tüp içinde 400 x g 5 min için de Santrifüjü tarafından (bkz. tablo malzeme ve reaktifler santrifüj türü için kullanılan) toplamak RT.</li>
	<li>Yavaşça süpernatant hücre Pelet bozmadan dökün. Taze tahlil arabellek ekleyin (Örneğin, 20 mL) ve hücrelerin yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend.</li>
	<li>Hücreleri yeniden vasıl 400 x g RT., 5 min için santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant tekrar dökün ve hücre Pelet 5 x 106 hücre/mL yoğunluğu elde etmek için taze tahlil arabellekte resuspend.</li>
</ol>3. yarışma bağlama tahlil
Not: Gerçek rekabet bağlama tahlil RT gerçekleştirilir ve non-steril koşullarda yapılabilir.
<ol><li>Soruşturma tahlil tampon altında bileşikler seyreltik (istenen konsantrasyonu elde etmek için 2.2 bkz:). Daha fazla bileşikleri karakterizasyonu için ya bileşik başlangıç tarama (Örneğin, 10 µM son konsantrasyonu) için sabit bir konsantrasyon veya alternatif olarak, konsantrasyonları bir seri seyreltme dizi hazırlamak (Örneğin, 1/3, 1/4 veya 1 / 5 seyreltme serisi) 1 µM, nihai toplama başlangıç. Bileşik çözüm sonuçta 2 x assay olarak seyreltilmiş olacak unutmayın; Bu nedenle, bir 2 x konsantre çözüm hazır olun.</li>
	<li>Bir kuyuya temiz 96-yuvarlak alt plaka bileşik çözüm (2 x konsantre) 100 µL dağıtmak (bkz: malzemeler tablo ve reaktifler) göre bir önceden tanımlanmış deneysel paralamak (Örneğin, şekil 1 c). Not: Bu aşamada, negatif ve pozitif kontrol örnekleri assay olarak eklenmiştir. Negatif kontrol örnektahlil arabelleği 100 µL 96-şey plaka wells için bileşik yerine eklenir. Pozitif kontrol örnekiçin tahlil arabellek de bu adımı sırasında eklenir. Ayrıca şekil 1 c çeşitli bileşenler seyreltme dizi test tipik bir deneysel düzen için bkz.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 50 µL ekleyin (2,7; bkz: 0,25 x 106 hücreler) bir çok kanallı pipet kullanarak 96-şey plaka içine bir reaktif rezervuar. RT, 15 dk karanlıkta plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Fluorescently etiketli CXCL12 50 µL ekleyin (Yani, 100 ng/mL CXCL12AF647 tahlil arabellek, 4 x konsantre, 25 ng/mL nihai toplama) benzer bir reaktif rezervuar 96-şey plaka kuyu. RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya. Not: negatif kontrol örnekleriiçin bunun yerine tahlil arabellek ekleyin. Bu nedenle, floresan sinyali algılandı negatif kontrol örnekleri autofluorescent arka plan sinyal (şekil 1A) karşılık gelir. Pozitif kontrol örnekleriiçin 50 µL/iyi CXCL12AF647ekleyin. Pozitif kontrol örnekleri yok olası inhibisyon bileşikler ile ön kuluçka tarafından dahil bu yana algılanan maksimal Floresans sinyal (şekil 1A) ortaya çıkarır.</li>
	<li>400 x g RT. Kaldır süpernatant pelleted hücrelerden, 5 min için de 96-şey plaka plaka üzerinde saygısız santrifüj kapasitesi. Bir doku tabakta kuru.</li>
	<li>Taze tahlil arabelleği 200 µL reaktif su deposu bir çok kanallı pipet kullanarak wells ekleyin. Derhal gidin.</li>
	<li>Yine de RT. Kaldır süpernatant 400 x g, 5 min için plaka plaka üzerinde saygısız santrifüj kapasitesi ve tekrar doku üzerinde kuru.</li>
	<li>Yavaşça hücre Pelet 200 µL % 1 paraformaldehyde PBS içinde çözünmüş olarak resuspend. Bu adımı hücreleri ortadan kaldırır.</li>
	<li>Floresans miktar hemen protokolüyle Akış Sitometresi tarafından devam.</li>
</ol>4. analiz örnekleri tarafından Akış Sitometresi
CXCL12AF647 lekeli ve saplantısı hücreleri artık Akış Sitometresi kullanarak çözümlenmesi hazırız. Akış cytometers çeşitli kullanılabilir ancak uyarma ve fluorophore algılama için uygun filtreler için doğru lazer (Yani, kırmızı bir lazer, uyarma aralığı ~ 630 nm) ile donatılmış olması gerekir (emisyon filtreleri ~ 660 nm). 96-şey plaka kartvizitlere örnekleri taşıma kapasitesine sahip olmak istiyorlar. Uygun Akış Sitometresi aygıtlara örnek olarak tablo malzemeleri ve Kimyasallarıverilir.
<ol><li>Cihaz başlatın ve karşılık gelen yazılım açın (bkz. tablo malzemeleri ve Kimyasalları).</li>
	<li>Bir nokta leke biçiminde görüntülenmeyecektir için hücresel aşağıdaki parametreleri seçin: ileri dağılım (FSC), yan dağılım (SSC) ve fluorophore (CXCL12AF647) algılama kanal. Not: algılanan ışık emilimi hücrenin çapı için orantılı olduğundan FSC parametresiyle hücreleri onların boyutu temelinde ayrımcılık. 90 ° açıyla ışık saçılma ölçüm SSC parametre taneciklik hücrelerin Kılavuzu.</li>
	<li>FSC ve SSC parametrelere göre tanımlanmış homojen hücre nüfusunun geçişi gerçekleştirmek için bir örnek (Örneğin, bir negatif kontrol örnek) seçin.<ol>
<li>Otomatik enjeksiyon ~ 100 µL saplantısı hücre Akış Sitometresi bu negatif kontrol örnek seçin. Seçenek "enjeksiyon önce karıştırma" seçin ve bir örnek Debi 1.5 µL/s kullanın.</li>
		<li>Bu örnek "Edinme verileri." seçerek çalıştırın Bu örnek için FSC ve SSC parametreleri şimdi ekranda görünür.</li>
		<li>Yazılım'ın gating aracını seçin. FSC ve SSC nokta leke görselleştirme üzerinde bağlı olarak, homojen ve uygulanabilir hücre nüfus çoğunluğuna tarafından önceden tanımlayın. Bunu yapmak için homojen dağıtılmış tek hücreleri ("olaylar") bu iki boyut üzerinde alarak içerir (yazılımın gating aracını kullanarak) bir çokgen oluşturun. Not: Daha fazla çözümleme için kullanılacak bir homojen ve uygulanabilir hücre nüfusu tanımlamak için gating yordamı amaçlamaktadır. Perdeleme hücrelerin çoğunluğu FSC ve SSC parametreleri temel alınarak bir homojen hücre nüfus oluşturacak varsayımına dayanır. Bu adımı uygulayarak, hücresel enkaz, ölü hücreleri ve hücre toplamları büyük ölçüde daha fazla analiz dışı bırakılabilir. Perdeleme süreci bir çizimi şekil 1Badımında verilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20.000 "olaylar" (Yani, tek hücreleri) örnek başına analiz etmek için seçin. Not: Bu her örnek için önceden tanımlanmış kapıyı içinde kalan 20.000 hücre sonunda incelenecek anlamına gelir. Bu olay sayısı analiz edilir kadar veri toplama her örnek için devam edecektir.</li>
	<li>Çalıştır (select "kayıt verileri") başlatın. Akış Sitometresi aygıt şimdi her örnek için ortalama Floresans yoğunluğu (MFI) kaydederek tüm örneklerini tek tek analiz eder. Bu MFI içinde önceden tanımlanmış geçit düşmek 20.000 hücreleri karşılık gelen kötü floresan sinyal karşılık gelir.</li>
</ol>5. veri analizi
Her örnek için elde edilen MFI tüm diğer hesaplamaları gerçekleştirmek için kullanın. Akış Sitometresi veri analizi (bkz: malzemeler tablo ve reaktifler) çeşitli ticari yazılım paketleri tarafından gerçekleştirilebilir.
<ol><li>Floresan bağlama sinyal, bileşik ön kuluçka, bir sonucu olarak yüzde inhibisyonu belirlemek için aşağıdaki formül uygulanır: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq1.jpg"> Nerede: MFIExp MFI, deneysel (= bileşik tedavi) = örnek MFIPC olumlu denetim MFI = MFINC negatif kontrol MFI =</li>
	<li>Bir bileşik (Yani, floresan bağlama sinyal % 50 oranında azaltabilir bileşik konsantrasyonu) ŞA50 değeri belirlemek için aşağıdaki formül uygulanır: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq2.jpg"> Nerede: Günlükconc.2 içinde % 50'den az sonuçları bileşik bir konsantrasyon günlük = PC ve NC MFI değer arasındaki fark inhibisyonu Günlükconc.1 içinde % 50'den fazla sonuç bileşik bir konsantrasyon günlük = PC ve NC MFI değer arasındaki fark inhibisyonu Not: Alternatif olarak, son derece aktif bileşikler halinde büyüklükte birkaç günlükleri kapsayan bir doz-yanıt eğrisi bileşik her test konsantrasyon için karşılık gelen MFI göre oluşturulabilir. Doğrusal olmayan regresyon eğrisi uygun uygun yazılımı kullanarak uygulayarak (bkz. tablo malzemeleri ve reaktifler), ŞA50 değerleri sonra sonucuna ki oluşturulan eğrileri. Bu analiz yaklaşım örneği şekil 3' te gösterilmiştir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+A+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: A short history.</a> Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).</li><li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors.">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).</li><li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+G+protein+coupled+receptors.">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li><li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+pathways.">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li><li>Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinases:+more+than+just+kinases+and+not+only+for+GPCRs.">G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs.</a> Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-arrestins:+Multifunctional+regulators+of+G+protein-coupled+receptors.">The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Hopkins, A. L., Groom, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome.">The druggable genome.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).</li><li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors:+Novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer.">G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li><li>Chatterjee, S., Behnam Azad, ., Nimmagadda, B., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer.">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li><li>Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphocyte+chemoattractant+SDF-1+is+a+ligand+for+LESTR/fusin+and+blocks+HIV-1+entry.">The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry.</a> Nature. 382, 829-833 (1996).</li><li>Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXCR4+chemokine+receptor+blockade+using+AMD3100+for+mobilization+of+autologous+hematopoietic+progenitor+cells.">Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells.</a> Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).</li><li>Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+CXCR4/CXCL12+axis+in+oncology:+No+place+to+hide.">A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide.</a> Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).</li><li>Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization,+HIV+infection,+ischemic+diseases,+and+oncology.">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li><li>Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+T-tropic+HIV+strains+by+selective+antagonization+of+the+chemokine+receptor+CXCR4.">Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4.</a> J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).</li><li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors.">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057 (2017).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMD3100+story:+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+(Mozobil).">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li><li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4.">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li><li>Woodard, L. E., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4-based+imaging+agents.">CXCR4-based imaging agents.</a> J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).</li><li>Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+CXCR4/CXCL12+Chemokine+Axis+in+Cancer+Drug+Delivery.">Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery.</a> Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).</li><li>Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+CXCR4+receptor+expression+in+human+cancer+xenografts+with+[64Cu]AMD3100+positron+emission+tomography.">Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography.</a> Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).</li><li>De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CXCR4+expression+in+human+cancer+xenografts:+evaluation+of+monocyclam+64Cu-AMD3465.">Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465.</a> J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).</li><li>Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12/CXCR4+cellular+interaction+studies.">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li><li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery:+implications+for+drug+discovery.">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li><li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+activity+with+AMD11070,+an+orally+bioavailable+inhibitor+of+CXCR4-tropic+HIV+type+1.">Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1.</a> Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).</li><li>Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptors+with+fluorescent+ligands.">Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands.</a> Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).</li><li>Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+small-molecule+fluorescent-conjugate+toolbox+for+Class+A+GPCRs.">The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs.</a> Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).</li><li>Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-+and+bioluminescence-based+approaches+to+study+GPCR+ligand+binding.">Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding.</a> Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bağlama deneyleri (Yani, doygunluk bağlama ve Kinetik bağlama deneyler), diğer türleri için karşılaştırıldığında, rekabet bağlama deneyleri amacıyla filtreleme için en uygundur. Gerçekten de, onların yeteneklilik-e doğru sabit tutar etiketli Reseptör ligand olan bağlama ile müdahale puanlama tarafından etiketlenmemiş bileşikleri, örneğin küçük moleküller, büyük toplu işlemleri değerlendirilmesi sağlarlar. Etiketli ligand daha diğer reseptör sitelere bağlamak bileşikler tahlil undetected kalabilir. Rekabet bağlama deneme burada özellikle Kemokin reseptör CXCR4 odaklanır açıklanan rağmen bu büyük olasılıkla bir plan tasarımı Yarışması bağlama deneyleri için diğer GPCRs için de görevi görebilir. Örneğin, CXC Kemokin reseptör 7 (CXCR7) CXCL12 için bağlama CXCL12 yüksek afinite29,ile30/ yetenekli alternatif bir reseptör tanımlanmıştır. Dolayısıyla, rekabet bağlama tahlil CXCR7 bağlama deneyler ayarlamak için kullanılan açıklanan CXCR4 olarak aynı etiketli Kemokin (CXCL12AF647) kullanılır. CXCR4 ve CXCR7 CXCL12 ortak bir ligand olarak paylaştığından, belirli reseptör bağlama değerlendirmek için hücre yüzeyi, içinde tek her iki reseptörlerinin ifade edilir hücresel modelleri ile çalışmak önemli olacaktır. Önceki çalışmalarımız Jurkat hücre CXCR717endojen ifade gösterme göstermiştir. Böylece, burada açıklanan CXCR4 için tahlil CXCR7 bağlama ile girişim eledi.
Birkaç anahtar şekil-in yarışma bağlama tahlil tarama gereci küçük moleküller CXCR4 için bağlama agonist engel tanımlamak için bir hızlı, ilk olarak kullanılmak üzere izin. Bir tahlil'ın anahtar faydalar reseptör ilgi ifade bütün, canlı hücreler kullanımıdır. Bu emek yoğun hücre zarının ürünleri gereksinimini atlar. Ayrıca, arka plan (otomatik) floresan Jurkat hücrelerle tespit düşük düzeyde yararlıdır. Fluorescently etiketli sonda tanımlanmış miktarı eklenmesi elde edilen büyük sinyal pencere ile birlikte arka plan oranı olumlu bir sinyal bu katkıda bulunmaktadır. Bu tarafından etiketlenmemiş bileşikler potansiyel bağlama inhibisyon algılama kolaylaştırır. Bu bağlama tahlil diğer CXCR4 ifade hücreleri ile gerçekleştirilir diye, her zaman bu parametreler (arka plan Floresan, sinyal pencere) hücre hattına hücre satırından farklı olarak ayarlıyoruz değerlendirmek için öneririz. Jurkat hücreleri uzun sürelerle, endogenously CXCR4 tutarlı bir düzeyde ifade aslında uygun bir hücresel model yapar. Reseptör ifade aynı tutarlı düzeyde stabil transfected Hücre klonlar ile alınabilir. Buna ek olarak, biz bu olacak büyük olasılıkla neden Floresans yoğunluklarını, daha az duyarlı hücreler tahlil ve daha az tutarlılık arasında çok daha geniş bir dağıtım içine deneyler çünkü geçici transfected hücreleri kullanımı tavsiye edersiniz. Ondan beri var hayır CXCR4 negatif Jurkat hücreleri, reseptör bağlama bu hücrelere özgüllük tarafından ön kuluçka köklü belirli reseptör antagonistleri (AMD3100 ve AMD11070) ile gösterilmiştir. Bu antagonistleri etiketli ligand yapısal olarak farklıdır. Ligand etiketlenmemiş türevi rakip olarak kullanırken, etiketli ve etiketsiz ligand Ayrıca hücre yüzeyine potansiyel olarak mevcut non-spesifik bağlama sitelere bağlama için rekabet olabilir çünkü bu önemlidir.
Hücresel ev sahibi dışında burada açıklanan tahlil çeşitli yönleri için diğer GPCRs. GPCRs hedef Fluorescently etiketli probları için alternatif olarak geliştirilmiştir benzer bir tahlil oluşturmak başlamadan önce dikkate alınması gereken radyoaktif sondalar, ama şu anda sadece GPCRs sınırlı sayıda için kullanılabilir ve nispeten pahalı olmalarına. Ayrıca, doğal reseptör ligandlar fluorophores ile modifikasyonu ile karşılaştırıldığında etiketlenmemiş üst molekülü, özellikle çok küçük ligandlar (Örneğin, aminler) veya küçük peptidler31, durumunda bağlama özellikleri değiştirebilir 32. mesela küçük ligandlar durumunda bir bağlayıcı genellikle site31bağlama reseptör'ın orthosteric erişmesine izin vermek için fluorophore pharmacophore ayırmak için gereklidir. Ayrıca, karmaşık reseptör-floresan sonda kararlılığını dikkate alınması gerekir. Deneyim, 90-120 dakika sonra (Yani, iki ardışık 96-şey plaka çalıştırmak için gereken süreyi), ortalama floresan yoğunluğu olumlu denetim kuyuları için genellikle ~ 5 üzerinde tüm olumlu denetim wells ortalamasını göre % azalır plaka, 5 ile % 10 arasında zaman zaman aykırı.
Ayrıca, etiketli ligand içsel etkinlik önem taşımaktadır. Reseptör antagonistleri içsel hareket yok reseptör üzerinde görüntülemek ise reseptörü harekete geçirmek etiketli agonistler olası neden ve sonuç, reseptör içselleştirilmesi. Bu geri dönüşümlü doğa ligand-reseptör etkileşim33ödün vermez. Mümkün en aza indirmek için reseptör içselleştirilmesi, kuluçka (durumunda etiketli bir agonist) etiketli ligand ile sorunları zamanında sınırlı olması gerekiyor ve tercihen oda sıcaklığında veya daha düşük yapılmalıdır. Yordamı oda sıcaklığında gerçekleştirilir gerçek tahlil de uygun ve daha fazla tabak biçiminde çabaları eleme ile uyumlu yapar. Son olarak, hücreleri (Örneğin, 250.000 iyi bir 96-şey plaka başına) örnek başına yeterli sayıda tahlil sonuçta hücreleri (20.000 hücre, "olaylar, Bütün hücre nüfus çoğunluğuna dayalı tek"; bkz: yeterli sayıda korumak için kullanılması gerektiğini Şekil 1) Akış Sitometresi Analizi için. Daha az hücre kullanarak tutarlı bir şekilde bu da okuma güvenilirliğini tehlikeye atabilir analiz hücre sayısı ulaşmak daha zor hale. Örnek başına daha az hücre (de) kullanarak de örneğini analiz için Akış Sitometresi tarafından gereken zaman aralığını artıracak ve böylece tüm 96-şey plaka analiz genel süresi artar. Bu artan işlem hacmi ödün vermez. Yukarıda belirtilen nedenle testin gelecekteki minyatür böylece çevirmek önemsiz bir görev olmak out.
Birlikte ele alındığında, öncelikle bizim laboratuarımızda bir tarama aracı olarak sabit bir miktar olan CXCR4 bağlama için etiketli CXCL12 ile rekabet edebilecek küçük moleküller tanımlamak için kullanılan bir rekabet bağlama tahlil ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Reseptör bağlama yeteneğine sahip bileşikler tanımlamak için nispeten hızlı ve basit bir yöntem olduğu gibi bu bağlama çalışmalar ilgi vardır. Bağlama kapasitesi ile bileşiklerin kimliği zaten kendi içinde değerli olmasına rağmen bu tür bir tahlil tanımlanan bileşiklerin etkinliği hakkında bilgi sağlamaz. Bu nedenle, daha fazla doğrulamak ve diğer farmakolojik ve fonksiyonel reseptör deneyleri potansiyel onların agonistik veya antagonistik aktivitesini karakterize gerekli kalır. İlgi, bağlama tahlil (inhibisyon bağlama için düşük ŞA50 değerleri üretenYani ) artan etkinliğini gösteren reseptör antagonistleri nispeten gerçekleştirmek gösterilmiştir CXCR4 durumunda diğer fonksiyonel daha iyi CXCR4 ile ilgili de17deneyleri.

G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) hücre yüzey proteinler hücre dışı ligandlar (Örneğin, peptidler, protein hormonlar, aminler) tarafından etkinleştirilebilir, böylece birçok fizyolojik ve gelişimsel düzenleyen1işler. Ne zaman bir agonist onun GPCR bağlama cep kaplar, indüklenen konformasyonal değişim reseptör protein Gαoluşan bağlama hücre içi heterotrimeric G reseptör ilişkili proteinlerin teşvik - GSYİH ve Gβγ alt birimleri. GTP ki, buna karşılık, daha da aşağı başlatacaktır G protein alt (Gα-GTP ve Gβγ) ayrılma Gα alt birim sonuçlarında üzerinde sonraki exchange GSYİH için yolları2,3işaret. Gα-GTP hidrolize olur zaman yeniden Derneği Gα- GSYİH ve Gβγ alt birimleri gr protein geri onun istirahat devlet3,4dönüştürür. G proteinlerin farklı türleri (Gs, Gg/ç, Gq, G12/13) mevcut, hangi ile Gα alt birim5sıra benzerlik göre kategorize edilir. Tüm bu G protein reseptörü harekete geçirmek için biyolojik yanıt altında yatan tanımlı hücre içi sinyal yolları teşvik. Reseptör etkinleştirme sonraki GPCR kinaz (GRKs) GPCRs, böylece β-arrestins ile etkileşimi teşvik hücre içi kuyruğunun fazdan. Bu işlem sinyal, reseptör duyarsızlaştırma ve içselleştirilmesi6gr protein sona erdirilmesi için yol açar. Β-arrestins de çok moleküler komplekslerin tetikleyici sinyal7sinyal G protein bağımsız basamaklandırır parçasıdır.
Kuralsız GPCR aracılı, örneğin reseptör gen veya reseptör overexpression, işlev kazanç mutasyonların nedeniyle sinyal birçok nedenleri katkıda terapötik müdahale için en doğrulanmış moleküler hedefler arasında GPCRs şunlardır insan hastalıkları8. Bu nedenle, GPCRs ilaç endüstrisi8,9,10tarafından araştırıldı uyuşturucu hedeflerinden en önemli sınıflarından birini temsil eder. Bir kayda değer bir klinik GPCR CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4), bir tek doğal ligand, CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12)11tarafından etkinleştirilen örnektir. Kurulan olarak rolünü büyük bir co reseptör için insan immün yetmezlik virüsü 1 (HIV-1) nedeniyle giriş ve enfeksiyon kümedeki olumlu T-lenfositleri12, CXCR4 ilk bir antiviral ilaç hedef olarak araştırıldı farklılaşma 4 (CD4). CXCL12-CXCR4 etkileşim daha fazla kemik iliğinde tutma düzenleyen ve posta kök ve Dede13hücreleri. Ayrıca, birçok açıdan kanser biyoloji (Örneğin, tümör hücre survival, metastaz, tümör ile ilgili angiogenez)14 ve birkaç diğer insan hastalıkları (Örneğin, inflamatuar hastalıkları)15, CXCR4 onun tutulumu verilen faiz önemli ilaç keşfi için umut verici bir hedef olarak ortaya çıkar. AMD3100, özellikle CXCR4, hedefleyen bağlanabilecek küçük bir moleküldür başlangıçta bir Anti-HIV ilaç aday16 keşfedilmiştir ve hala tarihi17için açıklanan en güçlü CXCR4 antagonistleri biridir. Bir antiviral ilaç olduğu, ancak, onun gelişme18üretilmiyor. Şu anda bu molekül Multipl Miyelom ve lenfoma hastaları18tedavi sırasında bir kök hücre seferberlik ajan olarak kullanılır. Diğer çeşitli kimyasal olarak ilgisiz küçük moleküller ve CXCR4 işlevi ile değişen etki gücüne inhibe destekte açıklanan19olmuştur.
Reseptör bağlama yöntemleri, doğrudan etkileşim bileşikler (Örneğin, küçük moleküller) tanımlaması GPCR ilgi ile izin Farmakoloji değerli araçlardır. Bağlama çalışmaları gerçekleştirmek için hücre içi sinyal özellikleri veya belirli bir GPCR işlevselliğini hakkında ön bilgi için gerek yoktur. Her ne kadar bu bir avantaj olarak kabul, bu bileşikler hangi reseptör için bağlama göstermiş olabilir daha fazla potansiyel agonistik veya antagonistik faaliyetlerini değerlendirerek karakterize edilebilir gerekir anlamına gelir. Bu etkinliği GPCR altında eğitim ile ilgili farmakolojik veya biyolojik deneyleri kullanılarak değerlendirilebilir. Onların etkinlik profili üzerinde bağımlı, reseptör bağlama molekülleri sonra potansiyel olarak roman kurşun bileşikleri önceden klinik ve klinik çalışmalarda soruşturma için olmak için gelişecek. Özellikle yüksek benzeşimli bir reseptör bağlamak moleküller de tedavi veya tanı araçları, örneğin tümör hücreleri20, noninvaziv vivo içinde görüntüleme için radiolabeling tarafından oluşturmak için iskele veya potansiyel olarak hizmet verebilir Araçlar'therapeutics21hedeflenen dır. CXCR4 durumunda, in vivo görüntüleme tümör hücrelerinin zaten neyin Etiketli CXCR4 hedefleme molekülleri insan kanser xenografts20,22,23 görselleştirme izin fare modelleri kullanarak kanıtlanmıştır .
Bu raporda, biz küçük moleküller ve doğrudan agonist (CXCL12) ile CXCR4 bağlayıcı müdahale destekte sağlar bir rekabet bağlama tahlil için detaylı bir protokol tanımlamak. Sabit bir miktar olan fluorescently etiketli ligand arasındaki rekabet testin temel ilkedir (CXCL12AF647, bkz: malzemeler tablo ve reaktifler) ve etiketsiz bileşikler bağlama reseptör protein17, için 24. etiketli ligand CXCR4 ifade tek hücrelere bağlı belirli floresan sinyalden sonra Akış Sitometresi tarafından analiz edilir. Etiketlenmemiş küçük moleküller arasındaki etkileşim CXCL12AF647 ve CXCR4 bozabilir zaman bu floresan sinyal azalacaktır. Tahlil endogenously CXCR4 hızlı sigara manipüle canlı hücreler kullanır (Yani, Jurkat hücreleri). Bu nedenle, hiçbir hücre zarı hazırlık gereklidir uygun, hızlı ve artan işlem hacmi ile uyumlu tahlil yapar. Fluorescently etiketli bir ligand kullanıldığından, radyoaktivite önlenmiş olur.
CXCL12 doğal agonist CXCR4 için olduğundan, tahlil bağlamasında CXCL12AF647 müdahale küçük molekül bileşikler (bağlama sitesi doğal tarafından işgalYani, orthosteric reseptör bağlama site ile etkileşimde muhtemeldir agonist). CXCL12 bağlantısını etkilemez arazi orthosteric bağlama sitesinden farklı reseptör bağlama siteleriyle etkileşim molekülleri undetected, kalır. Örneğin, pozitif ve negatif allosteric modülatörler, allosteric bağlama siteleri25, oyunculuk molekülleri hedefleme GPCR önemli ve gelişmekte olan bir Kategorideki bu tahlil ile seçilmiş olacak potansiyel olarak değil. Buna ek olarak, bileşikleri bu bağlama tahlil işleviyle reseptör antagonistleri veya agonistler olarak tanımlanan olup olmadığını türetilemez. Soruşturma ek farmakolojik veya fonksiyonel reseptör ilgili deneyleri içinde tanımlanan bileşiklerin böylece gerekli olacaktır. Bu deneyleri (birleşimi) içerebilir hücresel floresan veya ışıldama tabanlı deneyleri ikinci haberci (örneğin, Ca2 +, siklik adenozin monofosfattır (kampı)), fenotipik tespiti için veya biyolojik deneyleri ve β-arrestin İşe Alım deneyleri, belirli sinyal özelliklerinde GPCR altında eğitim, hangi seçim bağlıdır. Bu nedenle, burada esas olarak açıklanan rekabetçi bağlama tahlil bileşikler derinlemesine bir karakterizasyonu reseptör bağlama kudret ile etkinleştirmek için diğer hücre tabanlı deneyleri ile tamamlanabilir gerekir bir başlangıç tarama yöntemi olarak hizmet vermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1217">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td style="width:304px;">Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSDIVA Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray System Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:247px;">Graphpad</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">FlowJo</td>
			<td style="width:247px;">FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Vi-CELL</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sigma 3-18 KS</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">AMD3100</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A5602-5mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Maraviroc</td>
			<td style="width:247px;">Pfizer</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">h-SDF1a (AF647)</td>
			<td style="width:247px;">ALMAC</td>
			<td style="width:281px;">CAF-11-B-01</td>
			<td>fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">15630-056</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Jurkat cells</td>
			<td style="width:247px;">ATCC</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagent reservoir PP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">BR703411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid flow filter: 0.2 &#181;m aPES</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:281px;">611U96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Falcon tubes, 50ml</td>
			<td style="width:247px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:281px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:247px;">Corning</td>
			<td style="width:281px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4

Disfonksiyonel GPCR aracılı sinyalleşme birçok hastalığın ilerleme katkıda gibi farmakolojik G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) insan sağlığı için büyük önem hedefliyor. Ligand/reseptör çifti CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12) / CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) yükseltti önemli klinik faiz, örneğin kanser ve inflamatuar hastalıkları tedavisi için potansiyel bir hedef olarak. Küçük moleküller yanı sıra özellikle CXCR4 hedef ve reseptör'ın işlevi inhibe terapötik antikorlar bu nedenle değerli farmakolojik araçlar olarak kabul edilir. Burada, CXCL12 bağlama CXCR4, iptal etmek bileşikler (Örneğin, küçük moleküller) tanımlaması sağlayan bir Akış Sitometresi tabanlı hücresel tahlil açıklanmıştır. Esasen, tahlil yarışma fluorescently etiketli CXCL12, doğal Kemokin agonist CXCR4 için sabit bir miktarda ve etiketsiz bileşikler arasında bağlama reseptör için kullanır. Bu nedenle, radioactively etiketli probları istenmeyen kullanımı bu tahlil önlenmiş olur. Ayrıca, canlı hücreler reseptör (CXCR4) hücre zarının ürünleri yerine kaynağı olarak kullanılır. Bu tahlil daha fazla işlem hacmi artar bir plaka biçimine kolay uyum sağlar. Bu Tahlil CXCR4 hedefleme bileşenleri tanımlamak için değerli jenerik ilaç keşif tahlil için gösterilmiştir. Protokol büyük olasılıkla en az fluorescently etiketli ligandlar kullanılabilir veya oluşturulabilir diğer GPCRs için adapte edilebilir. Bu GPCRs aktivasyonu indüklenen hücre içi sinyal yolları ile ilgili ön bilgi gerekli değildir.

Genel iş akışını bağlama tahlil ve şekil 1Aile sunulur. Farklı örnek türleri (Örneğin, negatif kontrol, pozitif kontrol ve deneysel örnek) standart bir deneyde elde edilen Akış Sitometresi veri türüne bir örnek şekil 1Bve olası plaka düzen içinde gerçekleştirmek için tasvir tahlil bir 96-şey plaka biçiminde şekil 1 ciçinde verilir. Kuluçka endogenously Kemokin reseptör CXCR4 hızlı Jurkat hücrelerinin (Yani, bu tahlil ilgi GPCR), fluorescently etiketli CXCL12 miktarda artan ile (Yani, CXCL12AF647) sonuçlanan içine arttı ligand bağlayıcı CXCR4 için daha yüksek düzeyde yansıtan floresan (Şekil 2) düzeyde. CXCL12AF647 bağlama reseptör özgüllük göstermek için bir iyi kurulmuş ve reseptör özgü CXCR4 antagonisti (küçük molekül AMD3100) kullanılmıştır. Jurkat hücreleri ilk 1000 ng/ml, bir kuluçka 25 ng/mL CXCL12AF647 (Yani, sabit tutar etiketli Kemokin olan son bir konsantrasyon ile ardından 0,064 ng/mL arasında değişen AMD3100 bir 1/5 seyreltme serisi ile önceden inkübe rutin olarak kullanılan tahlil). Sonra Jurkat hücreleri daha fazla iletişim kuralında tanımlandığı gibi işlendi. Sonra sabit bir miktar olan CXCL12AF647 önceden inkübe Jurkat hücrelere ilavesi floresan sinyal (ortalama floresan yoğunluğu, MFI) Akış Sitometresi Analizi için tüm örnekleri tarafından elde. Jurkat hücre AMD3100 en yüksek konsantrasyon ile önceden tedavi durumunda bu floresan sinyal neredeyse tamamen inhibe olabilir (1000 ng/mL). Bu durum altında Floresans Inhibe seviye sadece biraz olduğunu autofluorescence Jurkat hücreler için düzeyine karşılık gelen arka plan seviyesinden. Sonuç olarak, 25 ng/mL (son konsantrasyonu) CXCL12AF647 bağlama tahlil uygulamak (negatif kontrol karşılaştırıldığında) bir büyük floresan sinyal pencere non-spesifik reseptör ( bağlama en az bir kalıntı düzeyde ile oluşturulan Şekil 3A).
Bu bağlama tahlil öncelikle ligand bağlayıcı panelleri tek bir sabit konsantrasyon, etiketlenmemiş bileşiklerin engellemeden bileşikler için ekran veya aktif bileşikler doz bağımlı etkisini incelemek için kullanılmıştır. İkinci durumda, hedef bileşenleri bağlama potens yansıtan ŞA50 değerleri (Örneğin, % 50 oranında bağlayıcı sinyali engeller bileşik toplama), elde etmektir. Şekil 3 küçük moleküllerin CXCL12 CXCR4 için bağlama engellemeden Akış Sitometresi veri bu bağlama tahlil ile elde inhibitör etki gücüne (açısından IC50) belirlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. CXCL12AF647 bağlama doz bağımlı inhibisyonu tarafından AMD3100 dayanarak, ŞA50 değeri burada doğrusal olmayan regresyon analizi uygulanarak belirlendi. Bu örnekte, hesaplanan ŞA50 değeri AMD3100 için 18.12 ng/mL karşılık gelir. Kampanyalar tarama, rasgele seçilen bileşikler çoğunluğu CXCL12AF647 bağlama CXCR4 için değil inhibe bekleniyor çünkü+ Jurkat hücreleri, örnek olarak bir etkin olmayan bileşik de bu çalışmada yer. Burada, güçlü anti-HIV-1 etkinlik 5 (CCR5)27CC Kemokin reseptör için belirli bir antagonisti olarak davranarak sergiler, küçük molekül maraviroc bağlama assay olarak test edildi. Maravoric bile, en yoğun hücrelerle Jurkat ön kuluçka (100 ng/mL; test sonra no inhibisyonu maksimal floresan bağlama sinyal algılandı Şekil 3B). Aynı deneyde, AMD11070, AMD3100, ama geliştirilmiş farmakokinetik özellikleri28ile ilgili başka bir küçük molekül seri seyreltme dizi dahil edildi. Maraviroc farklı olarak, bir 1/5 seyreltme serisinden 0.0064 100 ng/mL arasında değişen açıkça AMD11070 ve doz bağımlı CXCL12AF647 bağlama (şekil 3B) inhibe.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57271/57271fig1.jpg"> Şekil 1: iş akışı ve elde edilen veri türü gösterimi bakış. (A). protokol ana adımları negatif ve pozitif kontrol örnekleri ve bileşik tedavi örnekleri için kapsamlıdır. Örnekleri fluorescently etiketli Kemokin (CXCL12AF647) eklenmesi ve bileşik ön kuluçka olmadan arka plan (otomatik) floresan (negatif kontrol örnekleri) belirlemek için dahil edilir. Örnekleri bileşik ön kuluçka olmadan, ama sabit bir miktar olan CXCL12AF647 eklenmesi ile maksimal bağlama sinyal tahlil (pozitif kontrol örnekleri) belirlemek için kullanılır. Bileşik tedavi örnekleri, hücreleri bileşik önce sabit bir miktar olan CXCL12AF647ilavesi ile önceden inkübe. (B). ortalama floresan bağlama sinyal Akış Sitometresi Analizi Jurkat hücreleri tarafından belirlenir. Tüm olayları (Yani, Jurkat hücreleri) analiz (soldaki bölmeden) hücrelere geçişli bir subpopulation sadece floresan sinyalini daha ayrıntılı bir çözümleme için (orta Masası) kullanılır. Küçük molekülleri (Örneğin, AMD3100) içeren hücrelerin ön kuluçka fluorescently etiketli Reseptör ligand bağlayıcı engeller ve bu maksimal bağlama sinyal (gösterilen bir çubuk grafik gösterimi doğru kapı aynası,) azaltır. (C). rekabetçi bağlama tahlil bir 96-şey plaka biçimde gerçekleştirirken bir olası plaka düzen. Bu durumda, altı farklı bileşikler (GBM 1 - 6) 1.000 arasında değişen bir 1/5 seri seyreltme dizisi (yinelenen) test edilir nM 0,32 aşağı nM. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57271/57271fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57271/57271fig2.jpg"> Resim 2: CXCL12AF647 Jurkat hücrelere bağlama. Jurkat hücreleri, bileşik ile ön kuluçka yokluğunda CXCL12AF647, miktarda artan ile inkübe. Ortalama Floresans yoğunluğu (MFI, olarak gösterilen rasgele ışık birimleri) ± SD gösterilir (n = 2). Doğrusal olmayan regresyon denklemi aşağıdaki bir site toplam bağlama modelini kullanarak kullanarak eğri uydurma gerçekleştirildi
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq3.jpg">
Ben fazla (maksimum belirli bağlama) ile 18,345; = Kd 92.8 ng/mL; = NS (nonspesifik bağlama yamaç) 2.139; = ve arka plan 332.6 =. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57271/57271fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57271/57271fig3.jpg"> Şekil 3: CXCL12AF647 tarafından etkin ve etkin olmayan bileşikler bağlama inhibisyonu. (A)doz bağımlı hücreleri artan konsantrasyonları AMD3100, daha önce 25 ng/mL CXCL12AF647ilavesi ile ön kuluçka tarafından CXCL12AF647 bağlama inhibisyonu. Maksimal ortalama Floresans yoğunluğu (MFI; olarak gösterilen rasgele ışık birimleri) inhibe not olduğunu hala biraz yukarıda elde Jurkat hücreler için arka plan (otomatik) floresan (yani ± SD (n = 3)). Eğri uydurma göre değişken eğimli (dört parametre) doğrusal olmayan regresyon kullanılarak gerçekleştirildi
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq4.jpg">
Burada HillSlope 1.313 ve hesaplanan IC50 18.12 ng/mL'dir. (B). doz bağımlı AMD11070 ve maraviroc üzerindeki etkisini CXCR4 bağlamaya CXCL12AF647 + Jurkat hücreleri (MFI ± SD (n = 3)). AMD11070 yanıt için uygun eğri benzer şekilde 1.458 bir HillSlope ve 0.9052 ng/mL, hesaplanan bir ŞA50 değeri ile gerçekleştirildi. Maraviroc yanıt için bu bileşik aktivite eksikliği göz önüne alındığında hiçbir montaj gerçekleştirildi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57271/57271fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Sitometresi tabanlı hücresel bağlama tahlil anlatılan ve öncelikle bir tarama aracı olarak bir fluorescently etiketli CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12) bağlama CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) inhibe bileşikler tanımlamak için kullanılan bir akış.

Fluorescently etiketli CXC Kemokin Ligand 12 CXC Kemokin reseptör 4 için bağlama bozabilir bileşikler tanımlamak için Akış Sitometresi tabanlı tahlil

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

a-flow-cytometry-based-assay-to-identify-compounds-that-disrupt

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Görüntüleme.  KU Leuven. Sitometresi tabanlı hücresel bağlama tahlil anlatılan ve öncelikle bir tarama aracı olarak bir fluorescently etiketli CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12) bağlama CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) inhibe bileşikler tanımlamak için kullanılan bir akış.

Video: A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

P2X2 Ligandla Gated Katyon Kanalları ile etkileşimde Proteinler tanımlamak için Proteomik

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Biyoloji

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Akış Sitometri tabanlı Arıtma<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigot

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Üretimi<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Yumurta Mikrotubul ilişkili RNA&#39;lar tanımak ayıklar

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...