저자 에릭 Fonteyn 우수한 기술 지원에 대해 감사 하 고 싶습니다. 이 일 구 루벤에 의해 지원 되었습니다 (no를 부여 합니다. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, no를 부여. G.485.08)와 Fondation Dormeur 파두츠.

1입니다. 세포 배양의 유지 보수
참고: 1과 2에 설명 된 모든 단계는 층 류 캐비닛에 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.
<ol><li>37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터 T75 문화 플라스 크에 세포 성장. 참고:이 분석 결과에서 Jurkat 세포 (즉, 인간의 leukemic T 림프 구 세포 endogenously CXCR417익스프레스)는 사용 됩니다. 세포 표면에 CXCR4 표현의 cytometry에 의하여 세포 배양을 통해 평가 되어야 한다. 그러나 교류 cytometry 절차 및 셀 표면에 수용 체 식 수준 아니다,,이 프로토콜의 범위 내에서 하지만 되었습니다 확인 시 약의 설명 설명 이전17.</li>
	<li>하자 Jurkat 세포 성장에 80-85%에 도달할 때까지 confluency. 소설 플라스 크에 세포를 뿌리고, 하기 전에 실내 온도 (RT)를 도달 하는 모든 시 약을 하실 수 있습니다.</li>
	<li>소설 T75 문화 플라스 크를 신선한 완전 한 성장 매체 (RPMI-1640 매체, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2mm 글루타민) 20 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>소설 T75 문화 플라스 크를 (세포 현 탁 액 25 mL를 포함 하는) 원래 T75 플라스 크에서 Jurkat 세포 현 탁 액 5 mL를 추가 합니다. 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.</li>
</ol>2. 경쟁 분석 결과 바인딩 CXCL12, 분석 결과 버퍼 및 Jurkat 세포의 준비.
<ol><li>동결 건조 된 시 약 (어둠 속에서-80 ° C에 저장) 초순 0.01% (볼륨/볼륨) 폴 20의 보충에 용 해 하 여 CXCL12AF647 (20 µ g/mL, 참조 테이블의 재료 및 시 약)의 재고 솔루션을 준비 합니다. 단일 저장소-80 ° c, 빛 으로부터 보호이 재고 솔루션에서 aliquots를 사용 합니다.</li>
	<li>200 mL 행 크의 균형 소금물 (HBSS, 10 배, 페 놀 레드과 나트륨 중 탄산염, 최종 농도 x 1 없이) 40 mL HEPES (1 M, 20mm 최종 농도)를 추가 하 여 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 추가 초순 2 L. 추가 4 g (0.2% 무게/볼륨) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 최종 볼륨을 가져오고 자기 통해 BSA를 분해 하는 감동. 마지막으로, pH 7.4 (NaOH을 사용 하 여이 대 한)를 조정 하 고 참조 테이블의 재료 및 시 약0.2 µ m 숨 구멍을 통해 솔루션 필터 진공 매니폴드를 사용 하 여. 참고:이 분석 결과 버퍼 프로토콜의 모든 추가 단계에 사용 됩니다.</li>
	<li>수와 세포의 생존 능력을 계산 합니다. 이 위해, 세포 현 탁 액의 샘플 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 희석. 참고: 우리 정기적으로 사용 하 여 자동된 세포 생존 능력 분석 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 다양 한 농도에서 세포 정지 계산의 능력. 셀 계산에 대 한 세포 현 탁 액 1.5 ml PBS (다른 희석, 예를 들어, 1.9 ml PBS, 0.1 mL 있습니다 가능) 0.5 mL를 희석. Trypan blue 염료 제외 방법에 근거 하는이 메서드의 사용 되었습니다26위에서 설명한. 다른 여러 장치 계산 셀 번호와 동일 하 게 작동 하는 생존에 대 한 상업적으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>5 분에 대 한 400 x g에서 원심 (사용 하는 원심 분리기의 종류에 대 한 재료 및 시 약의 표 참조)에 의해 살 균 50 mL 튜브에 셀 (즉, ~ 24 x 106 셀 하나의 완전 한 96 잘 접시와 분석 결과 실행)의 원하는 번호를 수집 실시간</li>
	<li>부드럽게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 붓는 다. 신선한 분석 결과 버퍼를 추가 (예: 20 mL)와 부드럽게 위아래로 pipetting으로 셀 resuspend.</li>
	<li>실시간에서 5 분에 대 한 400 x g에서 다시 셀을 원심</li>
	<li>상쾌한 떨어져 다시와 5 x 106 셀/mL의 조밀도를 신선한 분석 결과 버퍼에서 셀 펠 릿 resuspend.</li>
</ol>3. 경쟁 의무적인 분석 실험
참고: 실제 경쟁 바인딩 분석 결과 RT에서 수행 되 고 비 살 균 조건 하에서 수행할 수 있습니다.
<ol><li>조사 분석 결과 버퍼에서 화합물을 희석 (2.2 참조) 원하는 농도를. 자세한 화합물의 특성에 대 한 초기 심사 (예를 들어, 10 µ M 최종 농도)에 대 한 화합물의 농도 고정된 하거나, 또는 농도의 직렬 희석 시리즈 준비 중 (예를 들어, 1/3, 1/4 또는 1 / 5 희석 시리즈 1 µ M, 최종 농도에서 시작). 복합 솔루션 궁극적으로 2 x 분석 결과;에 희석 될 다는 것을 명심합니다 따라서, 집중된 솔루션 x 2를 준비 합니다.</li>
	<li>바닥판 라운드 분명 96-잘으로 복합 솔루션 (2 배 농축) 100 µ L를 분배 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 밖으로 (예를 들어, 그림 1C) 미리 정의 된 실험 배치에 따르면. 참고:이 단계에서 부정과 긍정적인 제어 샘플 분석 결과에 포함 됩니다. 부정적인 컨트롤 샘플분석 결과 버퍼의 100 µ L 96 잘 접시의 우물에 화합물 대신 추가 됩니다. 긍정적인 컨트롤 샘플에 대 한 분석 결과 버퍼는이 단계에 추가 됩니다. 또한 여러 가지 화합물의 희석 시리즈 테스트는 일반적인 실험 레이아웃에 대 한 그림 1C 참조.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 50 µ L 추가 (2.7; 참조 106 셀 x 0.25) 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시에 시 약 저수지에서. 어둠 속에서 RT에서 15 분 동안 접시를 품 어.</li>
	<li>붙일 레이블된 CXCL12의 50 µ L 추가 (CXCL12AF647 분석 결과 버퍼, 집중 하는 4 x 25 ng/mL의 최종 농도에즉, 100 ng/mL) 96 잘 접시의 우물에 비슷한 시 저수지에서. 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어. 주: 부정적인 컨트롤 샘플에 대 한 추가 분석 결과 버퍼 대신 합니다. 따라서, 부정적인 컨트롤 샘플에서 검출 하는 형광 신호 autofluorescent 배경 신호 (그림 1A)에 대응 됩니다. 긍정적인 통제 견본CXCL12AF647의 50 µ L/잘 추가 합니다. 긍정적인 통제 견본 최대한 형광 신호 감지, 이후 아무 잠재적인 억제 화합물과 사전 외피에 의해 포함 되었다 (그림 1A)를 얻을 것입니다.</li>
	<li>접시를 뒤집어 여 실시간 제거 수송과 세포에서 상쾌한에 5 분에 대 한 400 x g에서 96 잘 접시를 원심. 조직에 접시를 건조.</li>
	<li>멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 우물을 시 저수지에서 신선한 분석 결과 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다. 바로 진행 합니다.</li>
	<li>접시를 뒤집어 여 실시간 제거는 상쾌한에 x 400g에 5 분 동안 다시 접시를 원심 하 고 조직에 다시 그것을 건조.</li>
	<li>부드럽게 1% paraformaldehyde PBS에 용 해의 200 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend. 이 단계는 셀 해결 됩니다.</li>
	<li>Cytometry 여 형광의 정량화와 즉시 프로토콜을 계속 합니다.</li>
</ol>4. cytometry에 의해 샘플의 분석
CXCL12AF647 얼룩이 고 집착된 셀 cytometry 사용 하 여 분석할 준비가 됩니다. 교류 cytometers의 여러 종류를 사용할 수 있습니다, 하지만 그들은 정확한 레이저 (즉, 빨간색 레이저, 여기 범위 ~ 630 nm) 여기와 fluorophore 탐지에 대 한 적합 한 필터 장착 해야 (방출 필터 ~ 660 nm). 그들은 96 잘 접시 형태로 샘플을 처리할 수 있이 필요가 있다. 적당 한 흐름 cytometry 장치의 예는 테이블의 재료 및 시 약에부여 됩니다.
<ol><li>장치를 시작 하 고 해당 소프트웨어를 열고 ( 테이블의 재료 및 시 약참조).</li>
	<li>점 오 점 형식으로 시각을 다음 세포 매개 변수 선택: 산포 (FSC), 측면 살포 (SSC) 및 fluorophore (CXCL12AF647) 검색 채널 전달. 참고: FSC 매개 변수를 사용 하는 세포는 차별 그들의 크기에 따라 감지 된 빛 흡수 셀의 직경에 비례 이기 때문. SSC 매개 변수를 90 ° 각도로 산란 측정 셀의 세분성에 대 한 정보를 제공 합니다.</li>
	<li>FSC 그리고 SSC 매개 변수를 기반으로 정의 된 동질적인 셀 인구의 게이팅을 수행 하려면 하나의 샘플 (예를 들어, 부정적인 컨트롤 샘플)을 선택 합니다.<ol>
<li>교류 cytometer에 집착 셀 ~ 100 µ L의 자동 주입이 부정적인 컨트롤 샘플에서 선택 합니다. 옵션 "혼합" 주입 하기 전에 선택한 1.5 µ L/s의 샘플 유량을 사용 합니다.</li>
		<li>"취득 데이터."를 선택 하 여이 샘플을 실행 이 샘플에 대 한 FSC 그리고 SSC 매개 변수는 화면에 표시 됩니다.</li>
		<li>소프트웨어의 제어 도구를 선택 합니다. 미리 FSC 그리고 SSC 점 오 점 시각에 따라 달라 집니다, 게이팅 하 여 균일 하 고 가능한 세포 인구를 정의 합니다. 이렇게 하려면 homogenously 분산된 단일 셀 (이 하 "행사")이 두 차원에 따라 포함 (를 사용 하 여 소프트웨어의 제어 도구) 다각형을 만듭니다. 참고: 제어 절차는 추가 분석을 위해 사용 될 것 이다 균질이 고 실행 가능한 세포 인구를 정의 하는 것을 목표로. 게이팅 가능한 세포의 대다수 FSC 그리고 SSC 매개 변수에 따라 동종 세포 인구를 형성할 것 이다 가정에 의존 합니다. 이 단계를 수행 하 여 세포질 파편, 죽은 세포, 및 셀 집계 수 주로에서 제외 추가 분석. 제어 프로세스의 그림은 그림 1B에서 제공 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20000 "" (즉, 단일 셀) 당 이벤트 샘플 분석을 선택 합니다. 참고:이 각 샘플에 대 한 미리 정의 된 게이트 내에 있는 20000 셀 결국 분석 될 것 이다 의미 합니다. 각 샘플에 대 한 데이터 수집 이벤트의이 수 분석 될 때까지 계속 됩니다.</li>
	<li>실행 (선택 "레코드 데이터")를 시작 합니다. 교류 cytometry 장치 각 샘플에 대 한 평균 형광 강도 (MFI)을 기록 하 여 지금 모든 샘플 하나 하나를 분석 합니다. 이 MFI 의미 형광 신호에 해당 하는 미리 정의 된 게이트 내에 있는 20000 셀에 해당 합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
각 샘플에 대 한 얻은 MFI를 사용 하 여 모든 추가 계산을 수행 하. 교류 cytometry 데이터의 분석 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 여러 상용 소프트웨어 패키지에서 수행할 수 있습니다.
<ol><li>복합 사전 인큐베이션 결과로 형광 바인딩 신호의 비율 억제를 결정 하려면 다음 수식을 적용. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq1.jpg"> 장소: MFI특급 (= 화합물 취급) 실험의 MFI = 샘플 MFIPC 긍정적인 통제의 MFI를 = MFINC 부정적인 컨트롤의 MFI를 =</li>
	<li>(즉, 50%에 의해 형광 바인딩 신호를 줄일 수 있는 화합물의 농도) 화합물의 IC50 값을 확인 하려면 다음 수식을 적용: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq2.jpg"> 장소: 로그conc.2 = 50% 미만에서 발생 하는 화합물의 농도의 로그 PC와 NC의 MFI 값의 차이의 저해 로그conc.1 = 50% 이상에서 발생 하는 화합물의 농도의 로그 PC와 NC의 MFI 값의 차이의 저해 참고: 또는, 높은 활성 화합물의 경우 규모의 여러 로그를 다루는 복용량 응답 곡선 생성할 수 있습니다 화합물의 각 시험된 농도에 해당 MFI에 기반. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 비선형 회귀 곡선 맞춤을 적용 하 여 (참조 테이블의 재료 및 시 약), IC50 값 다음 생성 된 커브에서 연 역 될 수 있습니다. 이 분석 방법의 예는 그림 3에 표시 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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J., Kellam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+small-molecule+fluorescent-conjugate+toolbox+for+Class+A+GPCRs.">The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs.</a> Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).</li><li>Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-+and+bioluminescence-based+approaches+to+study+GPCR+ligand+binding.">Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding.</a> Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

바인딩 분석 (즉, 채도 바인딩 및 바인딩 운동 실험)의 다른 유형에 비해, 경쟁 의무적인 분석 실험은 심사 목적에 가장 적합. 실제로, 그들은 레이블이 지정 된 수용 체 ligand의 고정 된 금액의 바인딩을 방해 하는 그들의 기능을 채 점 하 여 레이블이 없는 화합물, 예를 들어 작은 분자의 큰 배치의 평가 허용. 레이블이 리간드 보다 다른 수용 체 사이트에 바인딩되는 화합물 분석 결과에 들 키 지 유지 수 있습니다. 비록 경쟁 바인딩 실험 설명 여기에 초점을 맞추고 CXCR4 chemokine 수용 체에 특히, 그것은 아마 뿐만 아니라 다른 GPCRs에 대 한 경쟁 의무적인 분석 실험의 디자인에 대 한 청사진으로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, CXC chemokine 수용 체 7 (CXCR7)은 CXCL12, 높은 선호도29,와 바인딩 CXCL1230의 능력에 대 한 대체 수용 체로 묘사 되었다. 따라서, 동일한 레이블이 chemokine (CXCL12AF647)로 사용 설명된 CXCR4 경쟁 바인딩 분석 결과 CXCR7 바인딩 실험을 설정 하려면 사용할 수 있습니다. CXCR4 및 CXCR7 일반적인 리간드로 CXCL12를 공유 하므로 셀룰러 모델 두 수용 체 중 하나만 표현 된다 세포 표면에 특정 수용 체 바인딩을 평가 하기 위해 사용 해야 것입니다. 우리의 이전 작품 Jurkat 세포 생 표현의 CXCR717를 표시 하지 않습니다 설명 했다. 따라서, CXCR4에 대 한 여기에서 설명 하는 분석 결과에서 CXCR7에 대 한 바인딩 방해는 배제.
경쟁 바인딩 분석 결과의 몇 가지 주요 기능 주 작동 근 CXCR4을 방해 작은 분자를 식별 하는 도구를 심사, 빠른 초기로 사용할 수 있습니다. 분석 결과 주요 이점 중 하나는 관심의 수용 체를 표현 하는 전체, 살아있는 세포의 사용 이다. 이 노동 집약적인 세포 막 준비에 대 한 필요성을 생략합니다. 또한, 배경 (자동) 형광 Jurkat 세포 발견 낮은 수준의 도움이 됩니다. 붙일 레이블 조사의 정의 된 금액의 추가 따라 얻은 큰 신호 창 함께 그것은 유리한 신호 대 배경 비에 기여 한다. 이 레이블 없는 화합물에 의해 잠재적인 바인딩 금지의 탐지를 촉진 한다. 이 바인딩 분석 결과 다른 CXCR4 표현 세포와 함께 수행 하는 경우에 항상 평가 이러한 매개 변수 (배경 형광, 신호 창) 선행 그들은 셀 라인 셀 라인에서 다를 수 있습니다 좋습니다. 사실 그 Jurkat 세포는 endogenously 오랜 기간 동안 일관 된 수준 CXCR4를 표현 하기가 편리한 휴대 전화 모델. 수용 체 식의 동일한 일관 된 수준의 안정적 transfected 세포 클론으로 얻을 수 있습니다. 반면, 우리가 권장 하지 않습니다 뚜렷이 transfected 세포를 사용 하 여 형광 강도, 간의 일관성 분석 결과에서 갈수록 적은 반응 셀의 훨씬 광범위 한 배포에이 지 가능성이 결과 실험 때문에. 이후 아무 CXCR4 부정적인 Jurkat 세포가 존재 하며, 이러한 세포에 수용 체 바인딩의 특이성 확고 특정 수용 체 길 항 제 (AMD3100 및 AMD11070)를 가진 사전 외피에 의해 시연 했다. 이 길 항이 근 레이블이 ligand 구조적으로 다르다. 경쟁자로는 ligand의 레이블이 variant를 사용할 때 레이블 및 레이블 없는 ligand 일반적인 바인딩 사이트 잠재적으로 세포 표면에 존재 하는 바인딩 경쟁 또한 수도 있기 때문에 이것이 중요 합니다.
세포 호스트를 제외 하 고 여기서 설명 하는 분석 결과의 다른 여러 측면 다른 GPCRs. 대상 GPCRs 붙일 레이블된 프로브에 대 한 대 안으로 개발 된 유사한 분석 결과 작성을 시작 하기 전에 고려 될 필요가 방사성 프로브, 하지만 현재만 GPCRs의 제한 된 수에 사용할 수 있으며 상대적으로 비싸다. 또한, 수정 fluorophores와 자연 수용 체 ligands의 매우 작은 ligands (예를 들어, 아민) 또는 작은 펩 티 드31, 의 경우 특히 레이블이 없는 부모 분자에 비해 바인딩 속성 변경 수 있습니다. 32. 예를 들어, 작은 ligands 경우 링커는 일반적으로 필요한 사이트31바인딩 수용 체의 orthosteric에 대 한 액세스를 허용 하도록 fluorophore는 pharmacophore 구분. 또한, 복잡 한 수용 체-형광 프로브의 안정성 고려 될 필요가 있다. 우리의 경험에서 (즉, 두 연속 96 잘 접시를 실행 하는 데 필요한 시간), 90-120 분 후 긍정적인 제어 웰 스에 대 한 평균 형광 강도 일반적으로 ~ 5% 감소에 모든 긍정적인 통제 우물의 평균에 비해는 5와 10% 사이 가끔 outliers와 플레이트.
또한, 레이블이 ligand의 본질적인 활동은 중요 합니다. 반면 수용 체 길 항 근 수용 체에 아무런 본질적인 활동을 표시, 레이블된 agonists 가능성이 수용 체 활성화 유도 및 결과, 수용 체 국제화. 이 타협의 ligand 수용 체 상호 작용33가역 자연. 가능한을 최소화 하기 위해 수용 체 국제화, (레이블된 주 작동 근) 경우 레이블이 ligand와 보육 문제 시간에 제한 될 필요가 하 고 실내 온도에 또는 낮은 우선적으로 수행 됩니다. 절차 상 온에서 수행 됩니다 사실은 분석 결과 또한 편리 하 고 더 노력 플레이트 형식에서 심사와 호환 합니다. 마지막으로, 샘플 (예를 들어, 250000 96 잘 접시의 당) 당 세포의 충분 한 수에서에서 사용 해야 분석 결과 궁극적으로 (20000 셀, "단일 이벤트," 전체 세포 인구 게이팅 기반; 참조 셀의 충분 한 수를 유지 하 그림 1) 대 한 교류 cytometry 분석. 적은 세포를 사용 하 여 일관 되 게 밖으로 읽기의 신뢰성을 손상 시킬 수 있는 분석된 셀의이 수에 도달 더 어려워질 것 이다. (잘) 당 견본 당 더 적은 세포를 사용 하 여 또한, cytometry에 의해 샘플을 분석 하는 데 필요한 시간 간격을 증가 시킬 것입니다 하 고 따라서 전체 96 잘 접시를 분석 하는 전체 시간을 증가 시킨다. 이 늘어난된 처리량 타협. 분석 결과의 미래 소형화 따라서 차례 수도 있습니다 상기 이유로 인해 사소한 작업을 하지.
함께 찍은, 경쟁 바인딩 분석 결과 주로 실험실에서 도구로 사용 심사 CXCR4 바인딩하 레이블이 CXCL12의 고정 된 금액와 경쟁할 수 있는 작은 분자를 식별 하는 세부 사항에서 설명 하고있다. 이러한 바인딩 연구는 관심의 수용 체 바인딩 수 화합물을 식별 하는 상대적으로 신속 하 고 간단한 방법. 용량을 바인딩 화합물의 식별은 이미 그 자체가 귀중 한, 비록이 유형의 분석 결과 확인 된 화합물의 활동에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. 따라서, 그것은 남아 추가 유효성을 검사 하 고 다른 약리와 기능적인 수용 체 분석 실험에 있는 그들의 잠재적인 agonistic 또는 대립 활동을 특성화 하는 데 필요한. 관심, CXCR4 수용 체 길 항 제 바인딩 분석 결과 (즉, 바인딩 금지에 대 한 낮은 IC50 값을 생성 하는)에 증가 한 활동을 보여 주는 상대적으로 수행 하는 표시 되었습니다 경우 더 나은 다른 기능 CXCR4 관련 분석 뿐만17실험.

G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)는 세포 표면 단백질 (예를 들면, 펩 티 드, 단백질 호르몬, 아민) extracellular ligands에 의해 활성화 될 수 있는, 많은 생리 적 그리고 발달을 조절 함으로써 처리1. 한 길 항 제는 GPCR 바인딩 주머니 차지 하 고, 수용 체 단백질에 유도 구조적 변화 Gα의 구성 된 세포내 수용 체 관련 된 heterotrimeric G 단백질의 바인딩을 촉진-GDP와 Gβγ 소 단위. Gα 소 단위 결과 G 단백질 소 단위 (Gα-GTP와 Gβγ)를 차례로 추가 시작 하류의 분리에 GDP에 대 한 GTP의 후속 교환 신호 경로2,3. Gα-GTP 분해 된다 때 다시 협회 Gα의 GDP와 Gβγ 소 단위 변환 G 단백질 다시는 휴식 상태3,4. G 단백질의 다른 종류 (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), 존재는 Gα 소 단위5시퀀스 유사성에 따라 분류 한다. 모두 이러한 G 단백질 수용 체 활성화에 생물학 응답 기초 정의 된 세포내 신호 통로 유도. 수용 체 활성화 후 GPCR kinases (GRKs) 함으로써 β-arrestins와의 상호 작용을 촉진 하는 GPCRs의 세포내 꼬리 phosphorylate. 이 프로세스는 G 단백질 신호, 수용 체 탈 감 작과 국제화6의 종료에 리드. Β-arrestins는7을 신호 하는 G 단백질의 독립적인 폭포 트리거 신호 다 분자 복합물의 부분 있습니다.
GPCRs는 치료 적 개입에 대 한 가장 유효한 분자 표적 사이 많은의 병 인에 기여 하 고 규제 완화 GPCR 중재 신호, 예를 들면 수용 체 유전자 또는 수용 체 overexpression에 이득의 기능 돌연변이 때문으로 인간의 질병8. 따라서, GPCRs 제약 산업8,,910조사 약물 목표의 가장 중요 한 클래스 중 하나를 나타냅니다. 임상 관련 GPCR의 주목할 만한 보기는 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4) CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11유일한 자연 리간드에 의해 활성화 될 수 있는 이다. 때문에 인간 면역 결핍 바이러스 1에 대 한 주요 공동 수용 체로 서의 설립된 역할 (HIV-1) 항목 및 클러스터 차별화 4의 (CD4) 긍정적인 T 세포12, CXCR4 항 바이러스 약물 대상으로 조사에 처음에 감염. 더 골에서 CXCL12 CXCR4 상호 작용 조절 유지 그리고 줄기와 뿌리의 유도 세포13. 또한, 암 생물학 (예: 종양 세포 생존, 전이, 종양 관련 신생)14 의 여러 측면에 몇 가지 다른 인간의 질병 (예를 들어, 염증 성 질환)15, CXCR4의 개입을 주어진 약물 발견에 대 한 유망 대상으로 상당한 관심을 발생합니다. AMD3100, 특히 표적으로 CXCR4, 작은 분자 항 HIV 약물 후보16 처음 밝혀졌다 이며 여전히 가장 강력한 CXCR4 길 항 근 날짜17에 설명 중 하나. 그러나 개발으로는 항 바이러스 약물은,,18를 중단. 현재이 분자 다 발성 림프 종 환자18의 치료 중 줄기 세포 동원 에이전트로 사용 됩니다. 다른 여러 가지 화학적으로 관련이 없는 작은 분자와 다양 한 효능 가진 CXCR4 기능을 억제 하는 생물 의약품 설명된19되었습니다.
수용 체 바인딩 메서드는 관심의 GPCR와 직접 상호 작용 하는 화합물 (예를 들어, 작은 분자)의 id를 허용 하는 약리학에 귀중 한 도구입니다. 바인딩 연구를 수행 하기 위해서는 세포내 신호 속성 또는 특정된 GPCR의 기능에 관한 사전 지식에 대 한 필요가 있다. 이 이점을로 간주 될 수 있습니다, 하지만 그것은 화합물 바인딩 설명 될 수 있는 수용 체에 대 한 그들의 잠재적인 agonistic 또는 대립 활동을 평가 하 여 특징 추가 될 필요가 의미. 이 활동은 GPCR 연구에 관련 된 약리학 또는 생물학 분석 실험을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 그들의 작업 프로필에 의존, 수용 체 바인딩 분자 수 있습니다 다음 잠재적으로 진화 될 전 임상 및 임상 연구에 조사에 대 한 소설 리드 화합물. 예를 들어 종양 세포20, 비 침 투 적인 vivo에서 이미징 radiolabeling 여 치료 또는 진단 도구를 생성 하는 건설 기계 또는 잠재력으로 특히 높은 선호도와 수용 체에 묶는 분자도 사용할 수 있습니다. 치료제21의 대상 배달 차량. CXCR4, 경우 종양 세포의 이미징 vivo에서 이미 입증 되었습니다 레이블이 CXCR4 타겟팅 분자 인간 암 xenografts20,22,23의 시각화를 허용 하는 어떤 점에서 마우스 모델을 사용 하 여 .
이 보고서에서 우리는 작은 분자와 방해 하는 직접 길 항 제 (CXCL12) 바인딩 CXCR4 biologics의 식별을 가능 하 게 경쟁 바인딩 분석 결과 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과의 기본 원리는 붙일 레이블된 ligand의 고정 된 금액 간의 경쟁 (CXCL12AF647, 참조 테이블의 재료 및 시 약)과 화합물 바인딩 수용 체 단백질17, 에 대 한 레이블 없음 24. 레이블이 ligand CXCR4 표현 하는 단일 셀에 바인딩된에서 특정 형광 신호 다음 cytometry에 의해 분석 됩니다. 이 형광 신호 레이블 없는 작은 분자 CXCL12AF647 와 CXCR4 간의 상호 작용을 방해 하는 경우에 줄어들 것입니다. 분석 결과 endogenously 익스프레스 CXCR4 조작 아닌 살아있는 세포를 사용 하 여 (즉, Jurkat 세포). 따라서, 아무 세포 막 준비는 필요 하 게 분석 결과 편리, 신속 하 고 늘어난된 처리량과 호환. 붙일 레이블된 ligand 사용 되므로 방사능은 피 한다.
분석 결과에서 CXCL12AF647 바인딩을 방해 하는 작은 분자 화합물 (즉, 바인딩 사이트는 자연에 의해 점령 orthosteric 수용 체 바인딩 사이트와 상호 작용을 확률이 CXCL12 CXCR4 위한 자연 길 항 제 이므로 주 작동 근)입니다. 그들은 CXCL12의 바인딩을 좌우 하지 않는다 것 세 orthosteric 바인딩 사이트에서 고유 수용 체 바인딩 사이트와 상호 작용 하는 분자 들 키 지 않고, 남아 있습니다. 예를 들어, 긍정적이 고 부정적인 allosteric 변조기, 분자 allosteric 바인딩 사이트25에 행동을 타겟팅 하는 GPCR의 중요 하 고 신흥 카테고리 것입니다 잠재적으로 하지 주워이 분석 결과 함께. 또한, 수용 체 길 항 제 또는 촉진제로는 화합물이 바인딩 분석 기능으로 식별 여부를 파생 수 없습니다. 추가적인 약리 또는 기능 수용 체 관련 분석 실험에서 확인 된 화합물의 조사 따라서 하셔야 합니다. 이 분석 실험의 (조합) 포함 될 수 있습니다 두 번째 메신저 (예를 들어, 캘리포니아2 +, 순환 아데노신 monophosphate (캠프)), phenotypic의 검출에 대 한 분석 실험 세포 형광 또는 발광 기반 또는 생물학 분석 실험 및 β-arrestin GPCR 연구의 특정 신호 속성에 따라 어떤 선택 채용 분석 실험 따라서, 주로 여기에 설명 된 경쟁 바인딩 분석 결과 초기 심사 분석 결과 수용 체 바인딩 힘으로 화합물의 깊이 특성을 사용 하도록 다른 세포 기반 분석으로 보완 하는 역할을 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1217">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td style="width:304px;">Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSDIVA Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray System Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:247px;">Graphpad</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">FlowJo</td>
			<td style="width:247px;">FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Vi-CELL</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sigma 3-18 KS</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">AMD3100</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A5602-5mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Maraviroc</td>
			<td style="width:247px;">Pfizer</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">h-SDF1a (AF647)</td>
			<td style="width:247px;">ALMAC</td>
			<td style="width:281px;">CAF-11-B-01</td>
			<td>fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">15630-056</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Jurkat cells</td>
			<td style="width:247px;">ATCC</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagent reservoir PP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">BR703411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid flow filter: 0.2 &#181;m aPES</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:281px;">611U96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Falcon tubes, 50ml</td>
			<td style="width:247px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:281px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:247px;">Corning</td>
			<td style="width:281px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4

G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)의 약리 타겟팅으로 많은 질병의 진행에 기여 장애 GPCR 중재 신호 인간의 건강에 매우 중요입니다. 수용 체의 ligand 쌍 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4) 암 및 염증 성 질환의 치료에 대 한 잠재적인 대상으로 예를 들어 중요 한 임상 관심을 제기 하고있다. 특히 CXCR4 대상 및 수용 체의 기능을 억제 하는 치료 항 체로 서 작은 분자 약리학 유용한 도구 간주 됩니다 따라서. 여기, 흐름 cytometry 기반 셀룰러 분석 결과 CXCL12 바인딩을 CXCR4, 파기 화합물 (예를 들어, 작은 분자) 수 있도록 설명 되어 있습니다. 기본적으로, 분석 결과 붙일 레이블된 CXCL12, CXCR4, 자연 chemokine 주 작동 근의 고정 된 금액 및 레이블이 없는 화합물 사이의 바인딩 수용 체에 대 한 경쟁에 의존 합니다. 따라서, 방사성 레이블이 프로브를 사용 하 여 바람직하지이 분석 결과에 피 한다. 또한, 살아있는 세포 수용 체 (CXCR4) 세포 막 준비 대신의 원본으로 사용 됩니다. 처리량을 증가 플레이트 형식으로 분석 결과의 쉬운 적응 수 있습니다. 이 분석 결과 CXCR4 대상 화합물을 식별 하 귀중 한 제네릭 약물 발견 분석 결과 되도록 표시 되었습니다. 프로토콜 가능성이 적용할 수 있습니다 다른 GPCRs에 적어도 붙일 레이블된 ligands 사용할 수 있습니다 또는 생성 될 수 있습니다. 이러한 GPCRs의 활성화 유도 된 세포내 신호 통로 관한 사전 지식이 필요 하지 않습니다.

바인딩 분석 결과의 일반적인 워크플로 그림 1A에 제공 됩니다. 다른 샘플 형식 (즉, 부정적인 컨트롤, 긍정적인 제어 및 실험 샘플) 표준 실험에 대 한 얻은 흐름 cytometry 데이터 유형의 그림은 묘사 그림 1B을 가능한 접시 레이아웃을 수행 하 96 잘 접시 형태로 분석 결과 그림 1C에서 주어진 다. Endogenously 익스프레스 chemokine 수용 체 CXCR4 Jurkat 세포의 외피 (즉, 이 분석 결과에 대 한 관심의 GPCR), 붙일 레이블된 CXCL12 양의 증가 함께 (즉, CXCL12AF647)으로 발생 증가 형광 (그림 2), ligand 바인딩 CXCR4의 증가 수준을 반영의 수준. CXCL12AF647 바인딩 수용 체 특이성을 보여 잘 설립 하 고 수용 체 특정 CXCR4 적 (작은 분자 AMD3100) 사용 되었다. Jurkat 세포 0.064 ng/mL에서 1000 ng/mL, 25 ng/mL CXCL12AF647 (즉, 레이블이 지정 된 chemokine의 고정 된 금액의 최종 농도 부 화 뒤에 이르는 AMD3100의 1/5 희석 시리즈와 함께 미리 incubated 먼저 했다 일상적으로 사용 분석 결과에). 다음, Jurkat 세포 프로토콜에 설명 된 대로 처리 추가 되었습니다. 미리 incubated Jurkat 세포 CXCL12AF647 의 고정 된 금액의 추가 후 형광 신호 (평균 형광 강도, MFI) 모든 샘플에 대 한 흐름 cytometry 분석에 의해 얻은 했다. 이 형광 신호 수 거의 수 완전히 저해 만일 Jurkat 세포 AMD3100의 높은 농도와 사전 처리 (1000 ng/mL). 이 조건 하에서 형광의 저해 수준 이었다만 약간 Jurkat 세포에 대 한 autofluorescence의 수준에 해당 하는 배경 수준 이상. 결론적으로, 일반적인 수용 체 바인딩 ( 의 최소 잔여 수준 (때 부정적인 제어에 비해) 큰 형광 신호 창 생성 25 ng/mL (최종 농도) CXCL12AF647 바인딩 분석 결과에서 적용 그림 3A).
이 바인딩 분석 결과 주로 단일 고정된 농도에 레이블이 없는 화합물의 패널에 ligand 바인딩을 방해 화합물에 대 한 화면 또는 활성 화합물의 복용량-의존 효과 연구 사용 되었습니다. 후자의 경우, 목표 IC50 값 (즉, 50% 하 여 바인딩 신호를 억제 하는 화합물의 농도), 반영 하는 화합물의 바인딩 힘을 얻을 것입니다. 그림 3 CXCL12 CXCR4에 바인딩을 방해 작은 분자의 흐름 cytometry 데이터 바인딩 분석 결과이 얻은 사용 하 여 조건 (IC50) 억제 효능을 확인 하는 방법을 설명 합니다. AMD3100에 의해 CXCL12AF647 바인딩의 복용량 의존 금지에 따라, IC50 값 비 선형 회귀 분석을 적용 하 여 여기 결정 했다. 이 예제에서는 AMD3100에 대 한 계산 된 IC50 값 18.12 ng/mL에 해당합니다. 캠페인 상영, 무작위로 선택 된 화합물의 대부분은 것으로 예상 하지 CXCR4 CXCL12AF647 의 바인딩을 억제 하기 때문에+ Jurkat 세포, 비활성의 예 화합물이이 연구에도 포함 되었다. 여기, 5 (CCR5)27CC chemokine 수용 체에 대 한 특정 적 역할에 의해 강력한 안티 hiv-1 활동 전시, 작은 분자 maraviroc 바인딩 분석 결과에서 시험 되었다. 최대 형광 바인딩 신호 없음 억제 (100 ng/mL; 테스트 중 가장 높은 농도 에서도 maravoric과 Jurkat 세포 배양 후 검색 되었습니다. 그림 3B)입니다. 같은 실험에서 AMD11070, AMD3100, 하지만 향상 된 pharmacokinetic 속성28, 관련 하는 다른 작은 분자의 직렬 희석 시리즈는 포함 했다. Maraviroc, 달리는 1/5 희석 AMD11070에서 명확 하 게 100 ng/mL 0.0064에서 배열 계열과 복용량 독립적으로 저해 CXCL12AF647 바인딩 (그림 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57271/57271fig1.jpg"> 그림 1: 워크플로 및 가져온 데이터의 유형에의 일러스트 레이 션의 개요. (A). 프로토콜의 주요 단계는 부정적이 고 긍정적인 컨트롤 예제 및 샘플 화합물 취급 도식화. 샘플 복합 사전 외피와 붙일 레이블된 chemokine (CXCL12AF647)의 추가 없이 결정 배경 (자동) 형광 (부정적인 제어 샘플) 포함 되어 있습니다. 복합 사전 부 화, 없이 그러나 CXCL12AF647 의 고정 된 금액의 추가 샘플 분석 결과 (긍정적인 제어 샘플)에서 최대한 바인딩 신호를 결정 하는 데 사용 됩니다. 화합물 처리 샘플에 셀은 CXCL12AF647의 고정 된 금액의 추가 하기 전에 화합물과 인 큐베이 팅 사전. (B). 평균 형광 바인딩 신호 Jurkat 세포의 흐름 cytometry 분석에 의해 결정 됩니다. 모든 이벤트 (즉, Jurkat 세포) 분석된 (왼쪽된 패널)에서 셀의 문이 부분 모집단에서 형광 신호 추가 분석 (중간 패널)을 위해 사용 됩니다. 작은 분자 (예, AMD3100)에 포함 된 셀의 사전 인큐베이션 붙일 레이블된 수용 체 ligand 바인딩을 억제 하 고이 최대 바인딩 신호 (오른쪽 패널, 히스토그램 표시에 표시)를 감소 시킬 것 이다. (C). 96 잘 접시 형태로 경쟁 바인딩 분석을 수행할 때 가능한 접시 레이아웃. 이 경우에, 6 개의 다른 화합물 (일일 1-6) 1/5 직렬 희석 시리즈 (중복)에서 1, 000에서 배열 테스트는 0.32에 아래로 nM nM. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57271/57271fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57271/57271fig2.jpg"> 그림 2: CXCL12AF647 Jurkat 세포의 바인딩. Jurkat 세포 화합물과 사전 외피의 부재에서 CXCL12AF647, 양의 증가 함께 알을 품을 했다. 말은 형광 강도 (MFI, 표현된에서 임의의 빛 단위) ± SD 표시 됩니다 (n = 2). 다음 방정식 1 사이트 총 바인딩 모델을 사용 하 여 비선형 회귀를 사용 하 여 커브 피팅 수행
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq3.jpg">
와 B최대 (최대 특정 바인딩) = 18,345; Kd = 92.8 ng/mL; NS (일반적인 바인딩의 기울기) = 2.139; 그리고 배경 332.6 =. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57271/57271fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57271/57271fig3.jpg"> 그림 3: 저해 활성 및 비활성 화합물에 의해 CXCL12AF647 의 바인딩의. (A) 복용량-의존 미리 25 ng/mL CXCL12AF647의 추가 하기 전에 AMD3100의 농도 증가 함께 세포를 배양 하 여 CXCL12AF647 바인딩의 억제. 참고 최대한 의미 형광 강도 (MFI, 표현된에서 임의의 빛 단위) 저해 Jurkat 세포에 대 한 얻은 배경 (자동) 형광 위에 아직도 약간은 (± SD 의미 (n = 3)). 에 따라 가변 슬로프 (4 개의 매개 변수)와 비-선형 회귀를 사용 하 여 커브 피팅 수행
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq4.jpg">
여기 HillSlope 1.313 이며 계산된 IC50 은 18.12 ng/mL. (B). 복용량-의존 효과 AMD11070 maraviroc CXCR4 CXCL12AF647 바인딩에+ Jurkat 세포 (MFI ± SD (n = 3)). AMD11070 응답에 대 한 피팅 곡선 1.458의 HillSlope 와 0.9052 ng/mL의 계산된 IC50 값 마찬가지로 수행 되었다. Maraviroc 응답 없음 피팅이 화합물의 활동의 부족 주어진 수행 되었다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57271/57271fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

한 흐름 cytometry 기반 셀룰러 바인딩 분석 결과 설명 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)에 붙일 레이블된 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)의 바인딩을 억제 하는 화합물을 식별 하는 검사 도구로 주로 사용 되는.

CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K 조회수.  KU Leuven. 한 흐름 cytometry 기반 셀룰러 바인딩 분석 결과 설명 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)에 붙일 레이블된 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)의 바인딩을 억제 하는 화합물을 식별 하는 검사 도구로 주로 사용 되는.

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Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

연구

생물학

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

의 흐름 세포 계측법 기반 정화<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

생산<em&gt; Xenopus의 tropicalis</em&gt; 달걀은 미세 소관 관련 RNA를 식별하기 위해 추출

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...