Yazar James Fosse mükemmel çalışmaları tüm videografisi ve video işleme için teşekkür etmek istiyorum; Michael Marti sayısallaştırılmış sığır görüntüleri nesil mükemmel çalışmaları için; Lilia Walther RNA çıkarma konusunda ona yardım için ve Bioanalyzer çalışır; Mitch Palmer ve yararlı bir daha gözden geçirme ve geribildirim lenf nodu görüntülerde Carly Kanipe; ve hayvan bakımı ve veteriner kadroyla ulusal hayvan hastalığı Merkezi için tüm-in onların sert iş ve hayvancılık ile ilgili yardım ve Nekropsi için hazırlık.

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var. Tüm araştırma ABD Tarım Bakanlığı, Tarımsal Araştırma Servisi üzerinden intramural fonları ile finanse edilmektedir. Belirli bir ürünün tüm başvuruları deneysel tekrarlanabilirlik amacıyla sağlanmaktadır ve bu ürünlerin herhangi bir ciro federal hükümet tarafından temsil etmemektedir.

Transcriptomic çalışmaları ve ilgili protokolleri çoğunluğu fare, sıçan veya öldükten sonra insan örnekleri üzerinde odaklanın. Ancak, Hayvancılık ve yaban hayatının araştırmalarda çok çeşitli insan halk sağlığı için hastalık, hem veteriner ilaçları ve hayvansal hastalıklar açısından uygulanabilir olarak bağışıklık yanıtı karakterizasyonu için fırsatlar sağlar. Bu iletişim kuralı bir taslağını dokuları yüksek bütünlük RNA çıkarılması için kritik noktalar sığır, Bizon, keçi ve koyun gibi büyük hayvanlar üzerinden sağlanan. Hayvanlar gibi örnek koleksiyon için koşullarını boyutunu iyileşme fare lenf nodu kurtarma için daha uzun öldükten sonra işlem süresi ile daha geniş bir süreç. Benzer şekilde, bu lenf nodlarının büyük boy paralel örnekleri lenf nodu içinde immünolojik/patolojik değişiklikler temsilcisi örnekleri yanı sıra farklı hayvan kurtarmak protokolleri gerektirir. Lenf nodu kesit göre temsilcisi profiller gelince de sağlam RNA kurtarılması için örnek koleksiyonunda bu iletişim kuralı için öneriler sağlar.
Bir standart örnekleme strateji ve iletişim kuralı öneminin gücümüzü, burada anlatılan gibi biz transcriptomes hayvancılık lenf nodlarının karakterize PubMed Merkezi veritabanı 25 gazetelerden incelenmiştir. Bir kağıt belirtilen işleme büyük lenf nodu bölümünün aynı anda, bir özel lazer yakalama mikrodiseksiyon yöntemleri ele, kimse söz "temsil edici bir örnek" lenf düğümü toplanmıştır ve belirtilen tek bir kağıt46 lenf nodu parçası (10 mm3 boyutunda) toplanan korteks ve medulla bölgeleri dahil. Küçük örnekleri (genellikle 30-100 mg) RNA analizi için işlenmiş olan diğer kağıtlar kaydetti iken, %84 gazetelerin bu doku parçaları topluluğu için bir örnekleme strateji söz etmedi. Olarak RNA-sıralama hala nispeten pahalı, lenf düğüm başına birden çok bölüm özellikle biyolojik Çoğalt örnekleri genellikle istatistiksel analiz için öncelik bu yana çoğu durumda, mali açıdan uygun olması olası analizidir. Bir örnek bir kama sagittally kesitli bir lenf nodu arasında toplayarak, RNA bağışıklık hücreleri farklı türde zengin lenf nodu bölgelerden tüm örnekleri ele geçirildi. Bu nedenle, bu iletişim kuralı için bir belgelenen ve tekrarlanabilir örnekleme strateji lenf nodu transcriptomics için bir başvuru olarak görebilir.
Dokulara gelen RNA hazırlanmasında, yordam karar için birden çok anahtar adımlar vardır. İlk olarak, metodolojik edebiyat flaş donmuş doku örnekleri (ve sonraki soğuk sıcaklık taşlama) kullanımı kullanımı koruma çözümleri vs. açısından karıştırılır. Özellikle büyük hayvan Nekropsi durumunda, birden çok olası yordam faydası vardır bir koruma çözümü kullanmak için bu protokol için dahil olarak. İlk olarak, doku örnekleri hemen tüpler için sıvı azot aktarım gerek kalmadan koruma çözümde Nekropsi sırasında saklanır. İkinci olarak, Eğer özellikle örnek kısmen veya kısa bir süre önce homojenizasyon Tammy'nin koruma çözümü kullanımı örnek işleme RNA çıkarılması için önce ilave koruma sağlar. Sonuçlar Şekil 6A ' Bu koruyucu etkisi lenf dokusu ile genişletir gösterir. Buna ek olarak, flaş donmuş örnekleri donmuş durumda homojenizasyon fenol içeren arabellekte ana kadar sürdürülmelidir. Laboratuara döndürülebilir kadar son olarak, alan Nekropsi için sıvı azot hazır olmadığı, büyük hayvanların korunması çözümde örnekleri depolanabilir.
Homojenizasyon örnekleri için aerosol oluşturma işlemi sırasında bir dezenfektan olarak hizmet veren ilk doku işleme sırasında fenol varlığı burada sunulan yordamı moleküler bileşenleri ek avantajları şunlardır hayvanlar ve artık fenol ve guanidin isothiocyanate örnekten kaldırmak için spin sütun yordam kullanımını bulaşmış. Temsilcisi sonuçları yordamı bir260/A280 ve260/A230 oranları tarafından değerlendirildi gibi yüksek kaliteli RNA oluşturur, Jel Elektroforez ve RIN puanları ve saat ders zorluklar karşısında sağlam olduğunu göstermektedir Hayvancılık ve yaban hayatı örnekleme. (Örneğin, RNALater olarak), doku korunması homojenizasyon fenol tabanlı reaktifler (Örneğin, TRIzol) ve silis sütun arıtma eşleştirme başarıyla profil gen ifade desenleri ovine için edebiyatında kullanılmıştır abomasal lenf bezleri sığır lenf düğümleri ve gastrointestinal nematodlar46 ile enfekte bir herpesvirus47, RIN puanları daha büyük 8 ve 7 tüm örnekleri arasında daha büyük ile sırasıyla bulaşmış.
Aşağı akım analizi için kabul edilemez RIN puanları ile elde edilen bir RNA durumunda RNA işlenmesi için standart, aşağıdaki değişkenleri tespit edilebilir: toplam işlem zaman post-mortem, durumu, dokular, işlem saat/gecikme sonrası çözülme sırasında RNA çıkarma ve RNA işleme sonrası ayıklama tekniği. Zaman öldükten sonra işleme toplam özellikle doku euthanized hayvanların aksine ölü bulundu hayvanlar kurtarıldı durumunda tespit edilebilir. Yukarıda açıklandığı gibi RNA lenf düğümleri nispeten sabit, ama uzun gecikmeler işlemedeki bozulması, özellikle kararsız transkript için neden olabilir. Bir karıştırıcı zaman değişken örnekleri arasında alanında farklı tutarlarının kalmıştır leşleri karşılaştırılır, mevcut olabilir. Enfeksiyonu ile ilişkili patolojik değişiklikler nedeniyle doku bütünlüğünün bozulması RNA istikrar azaltabilir çünkü dokuları durumu değerlendirildi. Örneğin, alt RNA kalite brusellaplacentome içinde gözlenmiştir-enfekte hayvan sonrası kürtaj (gönderilmiş Boggiatto vd.,). İşleme süresi/gecikme sonrası tezcan koruma çözümleri, kullanımı ile bu protokol için açıklandığı gibi hafifletilmiş. Doku parçaları kalınlığı koruyucu çözüm doğru ve hızlı penetrasyon (koruyucu Malzemeler tablobelirtilen kullanarak < 5 mm kalınlık) doku haline izin vermek için düşük olduğunu emin olun. RNA ayıklama sırasında arabellekleri RNase free olmalı ve kontamine maddelerin (RNases cilt üzerinde bulunur) eldiven ve diğer ile temas kaçınılmalıdır. Lenf dokusunun taşlama için potansiyel RNases en büyük kaynağı doku içinde olacak, ama kirletici giriş yordamı her aşamasında azaltmak faydalıdır. RNA sonrası ayıklama kuralında tanımlandığı gibi işlemek için aliquot RNA tüpler içine önce dondurma ve-80 ° c, depolama donma-çözülme örnekleri analiz kalite ve miktar gereğini ortadan kaldırmak için örnekler.
Düşük verimleri yordamda, RNA örnekleri bozulma sonucu ek olarak, verimsiz bir homojenizasyon protokol 4.3 adımda lenf dokusunun nedeniyle olabilir. Her ne kadar çoğu lenf nodu dokularda etkili büyük pilot ishal ayrışmış dişli rotor-stator dissociator burada anlatılan bir RNA koruma çözümünde kuluçka (artış sertliği), doku doku değiştirebileceğinizi unutmayın. 4.3.1. adımda belirtildiği gibi fenol-esaslı reaktif homojenizasyon olmalıdır ayrılma eksik olup olmadığını tekrarladı. Harç havaneli zımpara, fenol-esaslı reaktif zemin örnekte resuspension ve ardından başka bir erişim olmadan laboratuarlar için bu özelliklere sahip bir homogenizer alternatiftir. Ancak, bir homojenizasyon tek kullanımlık tüpler bir harç ve havaneli birden çok örnekleri, işlenmesi için daha uygun ve daha kısa iş akışı örnek kaybı taşlama olmayışı da dahil olmak üzere, donmuş doku bileme üzerinde birden çok potansiyel avantajları sunar , hiçbir temizleme ve enfekte hayvan dokulardan durumunda güç örnekleri ile potansiyel teması.
Avraham vd. 48 tarif büyük 5S RNA zirveye 28S ve 18S ribozomal RNA'ların, düşük bir kurtarma ile eşleştirilmiş son RNA üründeki bir eksik lizis (hangi sırayla, lenf nodu işlenmek üzere tiss eksik bir ayrılma nedeniyle olabilir hücre belirtisi olabilir UE). Şekil 6B sığır parotid lenf nodu bağ dokusu içinde çok yüksek ve etkili bir şekilde homojenize değil bir parçası oluşturulan bir RNA profil örneği sağlar. RNA verimleri hesaplanır ve bir küme doğrulamak benzer iyileşme mg-doku alınır ve örnekleri RNA-sıralama tarafından doğrudan karşılaştırma için aynı homojenizasyon kullanarak toplu iş iş işlemde işlenip analiz örnekleri arasında izlenen Tüm örnekleri için strateji. Kama örnekleme yaklaşım aynı zamanda sadece geniş bağ dokusu bir bölgedir bir örnek topluluğu kaçınarak yardımcı unutmayın.

Transcriptome lenf nodlarının analizini RNA-sıralama patojenler çeşitli hayvanların bağışıklık yanıtı karakterize etmek için fırsat sunuyor. Bu yöntemi yaygın olarak fareler kullanılmıştır iken, analizleri daha büyük memeliler1,2son zamanlarda genişleyen. Hayvancılık/büyük hayvan lenf düğümleri bir enfeksiyon, sadece aşı veya genetik yatkınlık çalışmaları onların kullanım için ve hedefleri için ilaç geliştirme, aynı zamanda insan çalışmaları için model sistemleri olarak tanımlanması için ana bilgisayar yanıt karakterize için kullanılabilir Hayvansal hastalıklar. Örneğin, brusella (etkileri dünya çapında her yıl yarım milyon kişi bir Hayvansal bakteriyel hastalığı) olması durumunda, artmasına rağmen önemli ölçüde maliyeti, çalışmalarda koyun veya keçi insan enfeksiyonu ve insan aşı daha alakalı vardır gelişme laboratuvar hayvan modellere kıyasla. Retiküloendotelyal sistem enfeksiyonu ama değil karakteristik klinik belirtiler3. fare enfeksiyon modelleri özetlemek
Laboratuvar hayvan çalışmaları ile karşılaştırıldığında büyük hayvan deneyleri içinde işlemi mutlaka hasat doku ötenazi korunması için potansiyel bir meydan okuma sunuyor doku koleksiyonu arasında daha uzun bir gecikme oluşur. yüksek kaliteli RNA. Sağlam RNA biyolojik ilgili transcriptomic veri üretimi için önemlidir. Yüksek kaliteli RNA doku örneklerinden nesil koruma tesislerinde özellikle kritik büyük hayvan patojen araştırmalar yapılır. Bu tür çalışmalar sadece onaylı imkanları ve yüksek eğitimli personel gerektirir ama hangi iş bağlı olarak, on binlerce dolar yüzlerce arasında olabilir önemli finansal maliyetler de taşımak gerçekleştirmek doğal olarak daha zordur. Bu tür çalışmalar da bir disiplinler arası işbirliği ve onların karmaşıklık ekleyerek onların tamamlanması için disiplinler arası bilgi içerir. Bu nedenle, üzerinde eğitim, geliştirilmesi ve bağlılık bir aerodinamik sistemi örnek toplanması ve korunması için önemli yararları sağlar dokulara aşağı akım Moleküler çalışmalar için enfekte hayvan--dan.
Daha büyük lenf düğümleri topluluğu için fare lenf nodlarının örnekleme benzer karşılaştırıldığında doku koleksiyonu için ek sorunlar sunar. Örnek eksizyon için hazırlık ilgili iç yapılarını da içeren lenf nodu anatomisi temel bir anlayış gerektirir. Bir lenf nodu yapısını lenfoid lobules lenf ile dolu sinüsler çevrili oluşmaktadır. Bu yapılar içinde sert, fibröz kapsül içine alınır. 4 bir lenfoid kulak "temel anatomik ve fonksiyonel lenf nodu" birimidir ve köklerinin, derin kortikal bir birim ve medüller kordlar ve sinüsler4 (resim 1A) oluşur. B ve T lenfositler ev köklerinin ve derin kortikal birimleri, sırasıyla. Bu yapıların bir 3D iskele sağlamak ve lenfositler ve antijen veya antijen sunan hücreler arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak.
Onlar daha yoğun bir retiküler meshwork içeren ve daha hassas bir retiküler meshwork oluşmaktadır ve hafif görünür sinüsler daha koyu görünmesini fena halde, köklerinin ve derin kortikal birimler kesilmiş yüzeyine belirlenebilir (Şekil 1B). Geleneksel olarak, patologlar lenf düğümleri olarak yüzeysel korteks (folikül), paracortex (derin kortikal adet) ve medulla (medüller kordlar ve sinüsler) bölgelerinde bakın. Uygun bir inceleme, tüm üç bölgeler olarak en iyi uygulama rutin patolojik muayene yönergeler lenf düğümleri5için kabul edilmiştir. Tutarlılık, boyutu ve rengi tek bir hayvan içinde bile lenf nodlarının önemli farklılıklar olduğunu unutmayın. Hayvan yaşlandıkça, onların lenf düğümleri boyutu küçülür ve bu genç hayvanlar daha sıkı hale, genellikle kendi bağ dokusu ve lenfoid normal bir azalma artış nedeniyle6,7yapısı için eğiliminde olacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg"> Şekil 1. Lenf nodu anatomisi. (A) Bu çizgi film görüntü anahtar yapıları betimleyen lenf nodu anatomisi gösterir. (B) bu hala görüntü kesit içinde kesilmiş sığır bir lenf nodu gösterir. Çıplak gözle görülebilir ilgili yapılar/katmanları vurgulanır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Deneysel soru bağlı olarak farklı lenf düğümleri toplama ve analiz için ilgi olacaktır. Periferik lenf düğümleri derin subkutan dokuda bulunan bunlar. Sığır, periferik veya yüzeysel lenf düğümleri genellikle klinik ve deneysel uygulamada kullanılan parotid, çene, retropharyngeal, prescapular, prefemoral dahil (precrural) ve yüzeysel kasık (supramammary içinde dişi, erkeklerde testis) () Şekil 2). Tablo 1' de, anahtar yüzeysel lenf düğümleri, özelliklerini sığır sistem8' de açıklandığı gibi özetlenmiştir. Aşağıda, bazı potansiyel lenf nodu toplama planları sığır bulaşıcı bakteriyel hastalıklar için soruşturma için bir başlangıç noktası olarak sunulmuştur.
Brusella abortus/brusella melitensis: Standart necropsies B. abortusiçin-enfekte sığır ve B. melitensis-virüslü keçi ulusal hayvan hastalığı Merkezi kurtarmak supramammary, prescapular ve parotid lenf nodu doku , hem ana bilgisayar RNA ifade profil oluşturma için RNA hazırlık ve bakteriyel numaralandırma için dövmek icin. B. abortus düzenli olarak her deneysel olarak enfekte sığır9. bu lenf düğümlerinin elde edilebilir Bu lenf nodu türlerinin her biri bakteri varlığı içinde B. melitensistespit edilebilir-enfekte keçi kadar düşük çalışmalarımız (yayınlanmamış Boggiatto vd.,) RNA tabanlı yöntemlerini kullanarak en az dokuz ay sonrası enfeksiyon. Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemoral), ve mezenterik lenf düğümleri-si olmak be yararlı sığır karkas Salmonella yaygınlık10,11,12 profilleme sırasında ve transcriptomic çalışmalar için potansiyel ilgi olacak. E. coli O157: H7: mezenterik lenf düğümleri (at orta ince bağırsak ve distal ince bağırsak mekanlar) bakteriler enfekte buzağı (ancak değil enfekte yetişkin sığır)13ara sıra bir kurtarma siteleri olabilir. Leptospirosis (Leptospira sp.): bakterilerin kronik bir sebat meme bezi14drenaj lenf düğümleri gözlenmiştir. Mycobacterium bovis : Sığır, bakteri trakeobronşiyal ve mediastinal lenf düğümleri kurtarılan sonrası deneysel enfeksiyondan buzağı15olmuştur. Ayrıca, lenf nodu RNA virüsleri, domuz üreme ve solunum Sendromu virüs2gibi büyük hayvan ana bilgisayar yanıt incelemek için kullanılmıştır. Şekil 2 bir alt sığır vücuttaki bu büyük lenf düğümlerinin konumunu gösteriyor.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg"> Resim 2: Çizgi film seçilen lenf nodu yerlerde tasvir Bos Toros . Numaralandırılmış lenf düğümleri açıklamalı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bu kağıt ve ilişkili video, biz büyük hayvan lenf düğümleri moleküler biyologlar büyük hayvan enfeksiyonları transcriptomic çalışmalarda yer için bilgilendirici olacak şekilde RNA etütler yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. İlk olarak, biz genel bir bilgi yalıtım yordamı lenf düğümleri için örnekleme sığır ve bizon dokulara gelen örnek olarak kullanarak sağlar. Bu gösteri ile videoda gösterildiği eşleştirilmiş, RNA izolasyonu için tekrarlanabilir doku örnekleme için iş akışı olduğunu. Ardından, güvenlik, tutarlılık ve RNA kalite odaklı bir virüslü bir lenf düğümünün işlenmesi için önemli hususlar açıklanmaktadır.
RNA hazırlanması ile bir acidified fenol-guanidin isothiocyanate reaktif dokusundan Chomczynski ve Sacchi16,17, silis tabanlı spin sütunlar varlığı üzerinde bir arıtma ile orijinal yöntemine dayalı chaotropic ajanlar Vogelstein ve Gillespie18özgün çalışmasına dayanmaktadır. Biz de sığır lenf bezleri alternatif yöntemler tarafından korunmuş transcriptomics için RNA'ın kurtarma için potansiyel incelemek. Son olarak, biz ötenazi ve örnekleme bizon kurtarılan RNA profilden üzerinde arasında bir artış etkisini gösteren temsili bir deney dahil olmak üzere büyük hayvan Nekropsi RNA kalitesinde zaman değişken etkisini keşfedebilirsiniz ve sığır lenf bezleri. Bu makalede sadece moleküler biyologlar ama da için veteriner araştırmacılar transcriptomic çalışmalar başlıyor işe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1239px;" width="1240">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">AM7020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:167px;">Daigger Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EF7281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps, rat tooth</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-460-117</td>
			<td>Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mm punch biopsy needles</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9949469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sharps container (small and transportable for necropsy)</td>
			<td style="width:167px;">Stericycle</td>
			<td style="width:119px;">8900SA</td>
			<td>1 qt. size shown here</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutting boards or disposable trays</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-002-24A</td>
			<td>Available in a variety of sizes, depends on user preference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal protective equipment</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12183018A</td>
			<td>Designed for up to 100 mg tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Ethanol (200 proof for molecular biology)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose (General, for gel electrophoresis)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">1X TBE</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP24301</td>
			<td>Can also make from scratch in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S4117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">114391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Xylene cyanol&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols)</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:787px;">FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">AM1975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Plastic spreader (L-shaped spreader)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-665-231</td>
			<td>Only needed for sterility testing for samples from infected animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Necropsy knives</td>
			<td style="width:167px;">Livestock Concepts</td>
			<td style="width:119px;">WI-0009209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species

Büyük hayvanlar (hayvancılık ve yaban hayatının) Hayvansal patojenler, brusella, Mycobacterium bovis, Salmonellave E. coli, dahil olmak üzere önemli rezervuar hizmet ve Patogenez çalışma için yararlıdır ve/veya doğal ana bakteri yayılmasını. Lenf düğümleri konak immün yanıt anahtar işlevi ile gen ekspresyonu hücrelerdeki zamansal değişimler enfeksiyon boyunca değerlendirmek için aşağı akım transcriptomic analizleri, RNA'ın potansiyel bir kaynak olarak lenf nodu doku hizmet. Bu makale işlemi lenf nodu koleksiyonu, doku örnekleme ve aşağı akım RNA ve Hayvancılık, işleme sığır (Bos Toros) Amerikan bizonu (bizon bizon sağlanan ek örnekler ile bir model olarak kullanarak genel bir bakış sunar ). Protokol vücutta konumunu, kimlik ve lenf nodlarının birden çok anahtar site kaldırma hakkında bilgi içerir. Ayrıca, bir biyopsi örnekleme yöntem örnekleme bir tutarlılık için birden çok hayvanlar arasında sağlayan sunulur. RNA RNA-sıralama ve RT-PCR gibi aşağı akım yöntemleri için uygun üretimi dahil olmak üzere örnek korunması için birkaç önemli noktalar ele alınmaktadır. Büyük hayvan vs fare saat ders çalışmalarında doğal uzun gecikmeler nedeniyle bozulması bağlamında incelenmesi, bu doku türü zaman tabii açıklamak için bizon ve sığır lenf nodu doku temsilcisi sonuçları sunulmuştur RNA bozulması diğer dokularda önceki metodolojik çalışma. Genel olarak, bu iletişim kuralı transcriptome projeler büyük hayvan örnekleri üzerinde başlayan her iki veteriner araştırmacılar ve moleküler biyologlar vivo içinde doku örnekleme ve vitro işleme teknikleri öğrenmeye ilgi için faydalı olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species at JoVE.

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Bu iletişim kuralı kimliği ve lenf düğümlerinden hayvancılık ve yaban hayatının yaklaşımlar örnekleme, eksizyon adımlar dahil olmak üzere büyük hayvanlar dokulardan lenf nodu transcriptomic profilleme için RNA izolasyonu için yordamlar genel bakış sağlar sonrası koleksiyonu saklama ve işleme için RNA analizi için birden fazla hayvan ve dikkat edilmesi gereken noktalar artı temsilcisi sonuçları arasında tutarlılığı sağlamak için.

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

collection-processing-lymph-nodes-from-large-animals-for-rna-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.0K Görüntüleme.  U.S. Department of Agriculture. Bu iletişim kuralı kimliği ve lenf düğümlerinden hayvancılık ve yaban hayatının yaklaşımlar örnekleme, eksizyon adımlar dahil olmak üzere büyük hayvanlar dokulardan lenf nodu transcriptomic profilleme için RNA izolasyonu için yordamlar genel bakış sağlar sonrası koleksiyonu saklama ve işleme için RNA analizi için birden fazla hayvan ve dikkat edilmesi gereken noktalar artı temsilcisi sonuçları arasında tutarlılığı sağlamak için.

Video: Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Kasık lenf düğüm intravital Mikroskopi

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Mürin Yüzeysel lenf nodu Cerrahisi

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Yapımcı Epitel Hasar Analizi<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Enfeksiyon

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...