Yazar James Fosse mükemmel çalışmaları tüm videografisi ve video işleme için teşekkür etmek istiyorum; Michael Marti sayısallaştırılmış sığır görüntüleri nesil mükemmel çalışmaları için; Lilia Walther RNA çıkarma konusunda ona yardım için ve Bioanalyzer çalışır; Mitch Palmer ve yararlı bir daha gözden geçirme ve geribildirim lenf nodu görüntülerde Carly Kanipe; ve hayvan bakımı ve veteriner kadroyla ulusal hayvan hastalığı Merkezi için tüm-in onların sert iş ve hayvancılık ile ilgili yardım ve Nekropsi için hazırlık.

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var. Tüm araştırma ABD Tarım Bakanlığı, Tarımsal Araştırma Servisi üzerinden intramural fonları ile finanse edilmektedir. Belirli bir ürünün tüm başvuruları deneysel tekrarlanabilirlik amacıyla sağlanmaktadır ve bu ürünlerin herhangi bir ciro federal hükümet tarafından temsil etmemektedir.

Transcriptomic çalışmaları ve ilgili protokolleri çoğunluğu fare, sıçan veya öldükten sonra insan örnekleri üzerinde odaklanın. Ancak, Hayvancılık ve yaban hayatının araştırmalarda çok çeşitli insan halk sağlığı için hastalık, hem veteriner ilaçları ve hayvansal hastalıklar açısından uygulanabilir olarak bağışıklık yanıtı karakterizasyonu için fırsatlar sağlar. Bu iletişim kuralı bir taslağını dokuları yüksek bütünlük RNA çıkarılması için kritik noktalar sığır, Bizon, keçi ve koyun gibi büyük hayvanlar üzerinden sağlanan. Hayvanlar gibi örnek koleksiyon için koşullarını boyutunu iyileşme fare lenf nodu kurtarma için daha uzun öldükten sonra işlem süresi ile daha geniş bir süreç. Benzer şekilde, bu lenf nodlarının büyük boy paralel örnekleri lenf nodu içinde immünolojik/patolojik değişiklikler temsilcisi örnekleri yanı sıra farklı hayvan kurtarmak protokolleri gerektirir. Lenf nodu kesit göre temsilcisi profiller gelince de sağlam RNA kurtarılması için örnek koleksiyonunda bu iletişim kuralı için öneriler sağlar.
Bir standart örnekleme strateji ve iletişim kuralı öneminin gücümüzü, burada anlatılan gibi biz transcriptomes hayvancılık lenf nodlarının karakterize PubMed Merkezi veritabanı 25 gazetelerden incelenmiştir. Bir kağıt belirtilen işleme büyük lenf nodu bölümünün aynı anda, bir özel lazer yakalama mikrodiseksiyon yöntemleri ele, kimse söz "temsil edici bir örnek" lenf düğümü toplanmıştır ve belirtilen tek bir kağıt46 lenf nodu parçası (10 mm3 boyutunda) toplanan korteks ve medulla bölgeleri dahil. Küçük örnekleri (genellikle 30-100 mg) RNA analizi için işlenmiş olan diğer kağıtlar kaydetti iken, %84 gazetelerin bu doku parçaları topluluğu için bir örnekleme strateji söz etmedi. Olarak RNA-sıralama hala nispeten pahalı, lenf düğüm başına birden çok bölüm özellikle biyolojik Çoğalt örnekleri genellikle istatistiksel analiz için öncelik bu yana çoğu durumda, mali açıdan uygun olması olası analizidir. Bir örnek bir kama sagittally kesitli bir lenf nodu arasında toplayarak, RNA bağışıklık hücreleri farklı türde zengin lenf nodu bölgelerden tüm örnekleri ele geçirildi. Bu nedenle, bu iletişim kuralı için bir belgelenen ve tekrarlanabilir örnekleme strateji lenf nodu transcriptomics için bir başvuru olarak görebilir.
Dokulara gelen RNA hazırlanmasında, yordam karar için birden çok anahtar adımlar vardır. İlk olarak, metodolojik edebiyat flaş donmuş doku örnekleri (ve sonraki soğuk sıcaklık taşlama) kullanımı kullanımı koruma çözümleri vs. açısından karıştırılır. Özellikle büyük hayvan Nekropsi durumunda, birden çok olası yordam faydası vardır bir koruma çözümü kullanmak için bu protokol için dahil olarak. İlk olarak, doku örnekleri hemen tüpler için sıvı azot aktarım gerek kalmadan koruma çözümde Nekropsi sırasında saklanır. İkinci olarak, Eğer özellikle örnek kısmen veya kısa bir süre önce homojenizasyon Tammy'nin koruma çözümü kullanımı örnek işleme RNA çıkarılması için önce ilave koruma sağlar. Sonuçlar Şekil 6A ' Bu koruyucu etkisi lenf dokusu ile genişletir gösterir. Buna ek olarak, flaş donmuş örnekleri donmuş durumda homojenizasyon fenol içeren arabellekte ana kadar sürdürülmelidir. Laboratuara döndürülebilir kadar son olarak, alan Nekropsi için sıvı azot hazır olmadığı, büyük hayvanların korunması çözümde örnekleri depolanabilir.
Homojenizasyon örnekleri için aerosol oluşturma işlemi sırasında bir dezenfektan olarak hizmet veren ilk doku işleme sırasında fenol varlığı burada sunulan yordamı moleküler bileşenleri ek avantajları şunlardır hayvanlar ve artık fenol ve guanidin isothiocyanate örnekten kaldırmak için spin sütun yordam kullanımını bulaşmış. Temsilcisi sonuçları yordamı bir260/A280 ve260/A230 oranları tarafından değerlendirildi gibi yüksek kaliteli RNA oluşturur, Jel Elektroforez ve RIN puanları ve saat ders zorluklar karşısında sağlam olduğunu göstermektedir Hayvancılık ve yaban hayatı örnekleme. (Örneğin, RNALater olarak), doku korunması homojenizasyon fenol tabanlı reaktifler (Örneğin, TRIzol) ve silis sütun arıtma eşleştirme başarıyla profil gen ifade desenleri ovine için edebiyatında kullanılmıştır abomasal lenf bezleri sığır lenf düğümleri ve gastrointestinal nematodlar46 ile enfekte bir herpesvirus47, RIN puanları daha büyük 8 ve 7 tüm örnekleri arasında daha büyük ile sırasıyla bulaşmış.
Aşağı akım analizi için kabul edilemez RIN puanları ile elde edilen bir RNA durumunda RNA işlenmesi için standart, aşağıdaki değişkenleri tespit edilebilir: toplam işlem zaman post-mortem, durumu, dokular, işlem saat/gecikme sonrası çözülme sırasında RNA çıkarma ve RNA işleme sonrası ayıklama tekniği. Zaman öldükten sonra işleme toplam özellikle doku euthanized hayvanların aksine ölü bulundu hayvanlar kurtarıldı durumunda tespit edilebilir. Yukarıda açıklandığı gibi RNA lenf düğümleri nispeten sabit, ama uzun gecikmeler işlemedeki bozulması, özellikle kararsız transkript için neden olabilir. Bir karıştırıcı zaman değişken örnekleri arasında alanında farklı tutarlarının kalmıştır leşleri karşılaştırılır, mevcut olabilir. Enfeksiyonu ile ilişkili patolojik değişiklikler nedeniyle doku bütünlüğünün bozulması RNA istikrar azaltabilir çünkü dokuları durumu değerlendirildi. Örneğin, alt RNA kalite brusellaplacentome içinde gözlenmiştir-enfekte hayvan sonrası kürtaj (gönderilmiş Boggiatto vd.,). İşleme süresi/gecikme sonrası tezcan koruma çözümleri, kullanımı ile bu protokol için açıklandığı gibi hafifletilmiş. Doku parçaları kalınlığı koruyucu çözüm doğru ve hızlı penetrasyon (koruyucu Malzemeler tablobelirtilen kullanarak < 5 mm kalınlık) doku haline izin vermek için düşük olduğunu emin olun. RNA ayıklama sırasında arabellekleri RNase free olmalı ve kontamine maddelerin (RNases cilt üzerinde bulunur) eldiven ve diğer ile temas kaçınılmalıdır. Lenf dokusunun taşlama için potansiyel RNases en büyük kaynağı doku içinde olacak, ama kirletici giriş yordamı her aşamasında azaltmak faydalıdır. RNA sonrası ayıklama kuralında tanımlandığı gibi işlemek için aliquot RNA tüpler içine önce dondurma ve-80 ° c, depolama donma-çözülme örnekleri analiz kalite ve miktar gereğini ortadan kaldırmak için örnekler.
Düşük verimleri yordamda, RNA örnekleri bozulma sonucu ek olarak, verimsiz bir homojenizasyon protokol 4.3 adımda lenf dokusunun nedeniyle olabilir. Her ne kadar çoğu lenf nodu dokularda etkili büyük pilot ishal ayrışmış dişli rotor-stator dissociator burada anlatılan bir RNA koruma çözümünde kuluçka (artış sertliği), doku doku değiştirebileceğinizi unutmayın. 4.3.1. adımda belirtildiği gibi fenol-esaslı reaktif homojenizasyon olmalıdır ayrılma eksik olup olmadığını tekrarladı. Harç havaneli zımpara, fenol-esaslı reaktif zemin örnekte resuspension ve ardından başka bir erişim olmadan laboratuarlar için bu özelliklere sahip bir homogenizer alternatiftir. Ancak, bir homojenizasyon tek kullanımlık tüpler bir harç ve havaneli birden çok örnekleri, işlenmesi için daha uygun ve daha kısa iş akışı örnek kaybı taşlama olmayışı da dahil olmak üzere, donmuş doku bileme üzerinde birden çok potansiyel avantajları sunar , hiçbir temizleme ve enfekte hayvan dokulardan durumunda güç örnekleri ile potansiyel teması.
Avraham vd. 48 tarif büyük 5S RNA zirveye 28S ve 18S ribozomal RNA'ların, düşük bir kurtarma ile eşleştirilmiş son RNA üründeki bir eksik lizis (hangi sırayla, lenf nodu işlenmek üzere tiss eksik bir ayrılma nedeniyle olabilir hücre belirtisi olabilir UE). Şekil 6B sığır parotid lenf nodu bağ dokusu içinde çok yüksek ve etkili bir şekilde homojenize değil bir parçası oluşturulan bir RNA profil örneği sağlar. RNA verimleri hesaplanır ve bir küme doğrulamak benzer iyileşme mg-doku alınır ve örnekleri RNA-sıralama tarafından doğrudan karşılaştırma için aynı homojenizasyon kullanarak toplu iş iş işlemde işlenip analiz örnekleri arasında izlenen Tüm örnekleri için strateji. Kama örnekleme yaklaşım aynı zamanda sadece geniş bağ dokusu bir bölgedir bir örnek topluluğu kaçınarak yardımcı unutmayın.

Transcriptome lenf nodlarının analizini RNA-sıralama patojenler çeşitli hayvanların bağışıklık yanıtı karakterize etmek için fırsat sunuyor. Bu yöntemi yaygın olarak fareler kullanılmıştır iken, analizleri daha büyük memeliler1,2son zamanlarda genişleyen. Hayvancılık/büyük hayvan lenf düğümleri bir enfeksiyon, sadece aşı veya genetik yatkınlık çalışmaları onların kullanım için ve hedefleri için ilaç geliştirme, aynı zamanda insan çalışmaları için model sistemleri olarak tanımlanması için ana bilgisayar yanıt karakterize için kullanılabilir Hayvansal hastalıklar. Örneğin, brusella (etkileri dünya çapında her yıl yarım milyon kişi bir Hayvansal bakteriyel hastalığı) olması durumunda, artmasına rağmen önemli ölçüde maliyeti, çalışmalarda koyun veya keçi insan enfeksiyonu ve insan aşı daha alakalı vardır gelişme laboratuvar hayvan modellere kıyasla. Retiküloendotelyal sistem enfeksiyonu ama değil karakteristik klinik belirtiler3. fare enfeksiyon modelleri özetlemek
Laboratuvar hayvan çalışmaları ile karşılaştırıldığında büyük hayvan deneyleri içinde işlemi mutlaka hasat doku ötenazi korunması için potansiyel bir meydan okuma sunuyor doku koleksiyonu arasında daha uzun bir gecikme oluşur. yüksek kaliteli RNA. Sağlam RNA biyolojik ilgili transcriptomic veri üretimi için önemlidir. Yüksek kaliteli RNA doku örneklerinden nesil koruma tesislerinde özellikle kritik büyük hayvan patojen araştırmalar yapılır. Bu tür çalışmalar sadece onaylı imkanları ve yüksek eğitimli personel gerektirir ama hangi iş bağlı olarak, on binlerce dolar yüzlerce arasında olabilir önemli finansal maliyetler de taşımak gerçekleştirmek doğal olarak daha zordur. Bu tür çalışmalar da bir disiplinler arası işbirliği ve onların karmaşıklık ekleyerek onların tamamlanması için disiplinler arası bilgi içerir. Bu nedenle, üzerinde eğitim, geliştirilmesi ve bağlılık bir aerodinamik sistemi örnek toplanması ve korunması için önemli yararları sağlar dokulara aşağı akım Moleküler çalışmalar için enfekte hayvan--dan.
Daha büyük lenf düğümleri topluluğu için fare lenf nodlarının örnekleme benzer karşılaştırıldığında doku koleksiyonu için ek sorunlar sunar. Örnek eksizyon için hazırlık ilgili iç yapılarını da içeren lenf nodu anatomisi temel bir anlayış gerektirir. Bir lenf nodu yapısını lenfoid lobules lenf ile dolu sinüsler çevrili oluşmaktadır. Bu yapılar içinde sert, fibröz kapsül içine alınır. 4 bir lenfoid kulak "temel anatomik ve fonksiyonel lenf nodu" birimidir ve köklerinin, derin kortikal bir birim ve medüller kordlar ve sinüsler4 (resim 1A) oluşur. B ve T lenfositler ev köklerinin ve derin kortikal birimleri, sırasıyla. Bu yapıların bir 3D iskele sağlamak ve lenfositler ve antijen veya antijen sunan hücreler arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak.
Onlar daha yoğun bir retiküler meshwork içeren ve daha hassas bir retiküler meshwork oluşmaktadır ve hafif görünür sinüsler daha koyu görünmesini fena halde, köklerinin ve derin kortikal birimler kesilmiş yüzeyine belirlenebilir (Şekil 1B). Geleneksel olarak, patologlar lenf düğümleri olarak yüzeysel korteks (folikül), paracortex (derin kortikal adet) ve medulla (medüller kordlar ve sinüsler) bölgelerinde bakın. Uygun bir inceleme, tüm üç bölgeler olarak en iyi uygulama rutin patolojik muayene yönergeler lenf düğümleri5için kabul edilmiştir. Tutarlılık, boyutu ve rengi tek bir hayvan içinde bile lenf nodlarının önemli farklılıklar olduğunu unutmayın. Hayvan yaşlandıkça, onların lenf düğümleri boyutu küçülür ve bu genç hayvanlar daha sıkı hale, genellikle kendi bağ dokusu ve lenfoid normal bir azalma artış nedeniyle6,7yapısı için eğiliminde olacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg"> Şekil 1. Lenf nodu anatomisi. (A) Bu çizgi film görüntü anahtar yapıları betimleyen lenf nodu anatomisi gösterir. (B) bu hala görüntü kesit içinde kesilmiş sığır bir lenf nodu gösterir. Çıplak gözle görülebilir ilgili yapılar/katmanları vurgulanır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Deneysel soru bağlı olarak farklı lenf düğümleri toplama ve analiz için ilgi olacaktır. Periferik lenf düğümleri derin subkutan dokuda bulunan bunlar. Sığır, periferik veya yüzeysel lenf düğümleri genellikle klinik ve deneysel uygulamada kullanılan parotid, çene, retropharyngeal, prescapular, prefemoral dahil (precrural) ve yüzeysel kasık (supramammary içinde dişi, erkeklerde testis) () Şekil 2). Tablo 1' de, anahtar yüzeysel lenf düğümleri, özelliklerini sığır sistem8' de açıklandığı gibi özetlenmiştir. Aşağıda, bazı potansiyel lenf nodu toplama planları sığır bulaşıcı bakteriyel hastalıklar için soruşturma için bir başlangıç noktası olarak sunulmuştur.
Brusella abortus/brusella melitensis: Standart necropsies B. abortusiçin-enfekte sığır ve B. melitensis-virüslü keçi ulusal hayvan hastalığı Merkezi kurtarmak supramammary, prescapular ve parotid lenf nodu doku , hem ana bilgisayar RNA ifade profil oluşturma için RNA hazırlık ve bakteriyel numaralandırma için dövmek icin. B. abortus düzenli olarak her deneysel olarak enfekte sığır9. bu lenf düğümlerinin elde edilebilir Bu lenf nodu türlerinin her biri bakteri varlığı içinde B. melitensistespit edilebilir-enfekte keçi kadar düşük çalışmalarımız (yayınlanmamış Boggiatto vd.,) RNA tabanlı yöntemlerini kullanarak en az dokuz ay sonrası enfeksiyon. Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemoral), ve mezenterik lenf düğümleri-si olmak be yararlı sığır karkas Salmonella yaygınlık10,11,12 profilleme sırasında ve transcriptomic çalışmalar için potansiyel ilgi olacak. E. coli O157: H7: mezenterik lenf düğümleri (at orta ince bağırsak ve distal ince bağırsak mekanlar) bakteriler enfekte buzağı (ancak değil enfekte yetişkin sığır)13ara sıra bir kurtarma siteleri olabilir. Leptospirosis (Leptospira sp.): bakterilerin kronik bir sebat meme bezi14drenaj lenf düğümleri gözlenmiştir. Mycobacterium bovis : Sığır, bakteri trakeobronşiyal ve mediastinal lenf düğümleri kurtarılan sonrası deneysel enfeksiyondan buzağı15olmuştur. Ayrıca, lenf nodu RNA virüsleri, domuz üreme ve solunum Sendromu virüs2gibi büyük hayvan ana bilgisayar yanıt incelemek için kullanılmıştır. Şekil 2 bir alt sığır vücuttaki bu büyük lenf düğümlerinin konumunu gösteriyor.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg"> Resim 2: Çizgi film seçilen lenf nodu yerlerde tasvir Bos Toros . Numaralandırılmış lenf düğümleri açıklamalı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bu kağıt ve ilişkili video, biz büyük hayvan lenf düğümleri moleküler biyologlar büyük hayvan enfeksiyonları transcriptomic çalışmalarda yer için bilgilendirici olacak şekilde RNA etütler yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. İlk olarak, biz genel bir bilgi yalıtım yordamı lenf düğümleri için örnekleme sığır ve bizon dokulara gelen örnek olarak kullanarak sağlar. Bu gösteri ile videoda gösterildiği eşleştirilmiş, RNA izolasyonu için tekrarlanabilir doku örnekleme için iş akışı olduğunu. Ardından, güvenlik, tutarlılık ve RNA kalite odaklı bir virüslü bir lenf düğümünün işlenmesi için önemli hususlar açıklanmaktadır.
RNA hazırlanması ile bir acidified fenol-guanidin isothiocyanate reaktif dokusundan Chomczynski ve Sacchi16,17, silis tabanlı spin sütunlar varlığı üzerinde bir arıtma ile orijinal yöntemine dayalı chaotropic ajanlar Vogelstein ve Gillespie18özgün çalışmasına dayanmaktadır. Biz de sığır lenf bezleri alternatif yöntemler tarafından korunmuş transcriptomics için RNA'ın kurtarma için potansiyel incelemek. Son olarak, biz ötenazi ve örnekleme bizon kurtarılan RNA profilden üzerinde arasında bir artış etkisini gösteren temsili bir deney dahil olmak üzere büyük hayvan Nekropsi RNA kalitesinde zaman değişken etkisini keşfedebilirsiniz ve sığır lenf bezleri. Bu makalede sadece moleküler biyologlar ama da için veteriner araştırmacılar transcriptomic çalışmalar başlıyor işe.

<table><tbody><tr><td>RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpels</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps, rat tooth</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td>Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference</td></tr><tr><td>3 mm punch biopsy needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9949469</td><td></td></tr><tr><td>Sharps container (small and transportable for necropsy)</td><td>Stericycle</td><td>8900SA</td><td>1 qt. size shown here</td></tr><tr><td>Cutting boards or disposable trays</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Available in a variety of sizes, depends on user preference</td></tr><tr><td>Personal protective equipment</td><td></td><td></td><td>Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)</td></tr><tr><td>Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>12183018A</td><td>Designed for up to 100 mg tissue</td></tr><tr><td>100% Ethanol (200 proof for molecular biology)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (General, for gel electrophoresis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>1X TBE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24301</td><td>Can also make from scratch in the laboratory</td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>EMD Millipore</td><td>S4117</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer)</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols)</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spreader (L-shaped spreader)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-231</td><td>Only needed for sterility testing for samples from infected animals</td></tr><tr><td>Necropsy knives</td><td>Livestock Concepts</td><td>WI-0009209</td><td></td></tr></tbody></table>

collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species

Büyük hayvanlar (hayvancılık ve yaban hayatının) Hayvansal patojenler, brusella, Mycobacterium bovis, Salmonellave E. coli, dahil olmak üzere önemli rezervuar hizmet ve Patogenez çalışma için yararlıdır ve/veya doğal ana bakteri yayılmasını. Lenf düğümleri konak immün yanıt anahtar işlevi ile gen ekspresyonu hücrelerdeki zamansal değişimler enfeksiyon boyunca değerlendirmek için aşağı akım transcriptomic analizleri, RNA'ın potansiyel bir kaynak olarak lenf nodu doku hizmet. Bu makale işlemi lenf nodu koleksiyonu, doku örnekleme ve aşağı akım RNA ve Hayvancılık, işleme sığır (Bos Toros) Amerikan bizonu (bizon bizon sağlanan ek örnekler ile bir model olarak kullanarak genel bir bakış sunar ). Protokol vücutta konumunu, kimlik ve lenf nodlarının birden çok anahtar site kaldırma hakkında bilgi içerir. Ayrıca, bir biyopsi örnekleme yöntem örnekleme bir tutarlılık için birden çok hayvanlar arasında sağlayan sunulur. RNA RNA-sıralama ve RT-PCR gibi aşağı akım yöntemleri için uygun üretimi dahil olmak üzere örnek korunması için birkaç önemli noktalar ele alınmaktadır. Büyük hayvan vs fare saat ders çalışmalarında doğal uzun gecikmeler nedeniyle bozulması bağlamında incelenmesi, bu doku türü zaman tabii açıklamak için bizon ve sığır lenf nodu doku temsilcisi sonuçları sunulmuştur RNA bozulması diğer dokularda önceki metodolojik çalışma. Genel olarak, bu iletişim kuralı transcriptome projeler büyük hayvan örnekleri üzerinde başlayan her iki veteriner araştırmacılar ve moleküler biyologlar vivo içinde doku örnekleme ve vitro işleme teknikleri öğrenmeye ilgi için faydalı olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species at JoVE.

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Bu iletişim kuralı kimliği ve lenf düğümlerinden hayvancılık ve yaban hayatının yaklaşımlar örnekleme, eksizyon adımlar dahil olmak üzere büyük hayvanlar dokulardan lenf nodu transcriptomic profilleme için RNA izolasyonu için yordamlar genel bakış sağlar sonrası koleksiyonu saklama ve işleme için RNA analizi için birden fazla hayvan ve dikkat edilmesi gereken noktalar artı temsilcisi sonuçları arasında tutarlılığı sağlamak için.

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

collection-processing-lymph-nodes-from-large-animals-for-rna-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.7K Görüntüleme.  U.S. Department of Agriculture. Bu iletişim kuralı kimliği ve lenf düğümlerinden hayvancılık ve yaban hayatının yaklaşımlar örnekleme, eksizyon adımlar dahil olmak üzere büyük hayvanlar dokulardan lenf nodu transcriptomic profilleme için RNA izolasyonu için yordamlar genel bakış sağlar sonrası koleksiyonu saklama ve işleme için RNA analizi için birden fazla hayvan ve dikkat edilmesi gereken noktalar artı temsilcisi sonuçları arasında tutarlılığı sağlamak için.

Video: Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and Western Blot, since it mostly contains lipids. RNA isolation from adipose tissue samples is also challenging as extra steps are required to avoid these lipids. Here, we present a procedure to collect three anatomically different white adipose tissues from mice, to process these samples and perform RNA isolation. We further describe the synthesis of cDNA and gene expression experiments using real-time PCR. The hereby described protocol allows the reduction of contamination from the animal's hair and blood on fat pads as well as cross-contamination between different fat pads during tissue collection. It has also been optimized to ensure adequate quantity and quality of the RNA extracted. This protocol can be widely applied to any mouse model where adipose tissue samples are required for routine experiments such as real-time PCR but is not intended for isolation from primary adipocytes cell culture.

The purpose of this paper is to present a step-by-step procedure to collect different white adipose tissues from mice, process the fat samples and extract RNA.

Fare yağ dokusu toplama ve işleme RNA analizi için

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Biyokimya

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Genetik

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent pathways. Until recently, thermogenic adipocytes were considered a homogeneous population. However, recent studies have indicated that there are multiple subtypes or subpopulations that are distinct in developmental origin, substrate use, and transcriptome. Despite advances in single-cell genomics, unbiased decomposition of adipose tissues into cellular subtypes has been challenging because of the fragile nature of lipid-filled adipocytes. The protocol presented was developed to circumvent these obstacles by effective isolation of single nuclei from adipose tissue for downstream applications, including RNA sequencing. Cellular heterogeneity can then be analyzed by RNA sequencing and bioinformatic analyses.

This publication describes a protocol for the isolation of nuclei from mature adipocytes, purification by fluorescence-activated sorting, and single-cell level transcriptomics.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine cancer models are extremely limited in their diversity and suffer from poor translation to the clinic. To serve as a more physiological preclinical model for immunotherapy studies, this protocol has been developed to evaluate the treatment of human tumors in a mouse reconstituted with a human immune system. This unique protocol demonstrates the development of human immune system (HIS, &#34;humanized&#34;) mice, followed by implantation of a human tumor, either a cell-line derived xenograft (CDX) or a patient derived xenograft (PDX). HIS mice are generated by injecting CD34+ human hematopoietic stem cells isolated from umbilical cord blood into neonatal BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2R&#947;C-/- NODSIRP&#945;) highly immunodeficient mice that are also capable of accepting a xenogeneic tumor. The importance of the kinetics and characteristics of the human immune system development and tumor implantation is emphasized. Finally, an in-depth evaluation of the tumor microenvironment using flow cytometry is described. In numerous studies using this protocol, it was found that the tumor microenvironment of individual tumors is recapitulated in HIS-PDX mice; &#34;hot&#34; tumors exhibit large immune infiltration while &#34;cold&#34; tumors do not. This model serves as a testing ground for combination immunotherapies for a wide range of human tumors and represents an important tool in the quest for personalized medicine.

This protocol outlines the generation of human immune system (HIS) mice for immuno-oncology studies. Instructions and considerations in the use of this model for testing human immunotherapeutics on human tumors implanted in this model are presented with an emphasis on characterizing the response of the human immune system to the tumor.

İnsan Tümörleri Taşıyan İnsanlaştırılmış Bir Fare Modelinde Kanser İmmünoterapötiklerinin Test Edilmesi

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine ...

Kanser Araştırmaları

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Kodlama ve RNA sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade.

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Nörobilim

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into sympathetic and parasympathetic branches. Normally, there is a balance between these two branches to maintain homeostasis. However, cardiac disease states such as myocardial infarction, heart failure, and hypertension can induce the remodeling of cells involved in cardiac innervation, which is associated with an adverse clinical outcome.
Although there are vast amounts of data for the histological structure and function of the cardiac autonomic nervous system, its molecular biological architecture in health and disease is still enigmatic in many aspects. Novel technologies such as single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) hold promise for the genetic characterization of tissues at single-cell resolution. However, the relatively large size of neurons may impede the standardized use of these techniques. Here, this protocol exploits droplet-based single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq), a method to characterize the biological architecture of cardiac sympathetic neurons in health and disease. A stepwise approach is demonstrated to perform snRNA-seq of the bilateral superior cervical (SCG) and stellate ganglia (StG) dissected from adult mice.
This method enables long-term sample preservation, maintaining an adequate RNA quality when samples from multiple individuals/experiments cannot be collected all at once within a short period of time. Barcoding the nuclei with hashtag oligos (HTOs) enables demultiplexing and the trace-back of distinct ganglionic samples post sequencing. Subsequent analyses revealed successful nuclei capture of neuronal, satellite glial, and endothelial cells of the sympathetic ganglia, as validated by snRNA-seq. In summary, this protocol provides a stepwise approach for snRNA-seq of sympathetic extrinsic cardiac ganglia, a method that has the potential for broader application in studies of the innervation of other organs and tissues.

This protocol describes the detailed, low-input sample preparation for single-nucleus sequencing, including the dissection of mouse superior cervical and stellate ganglia, cell dissociation, cryopreservation, nucleus isolation, and hashtag barcoding.

Düşük Girişli Çekirdek İzolasyonu ve Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Fare Sempatik Ganglia'nın Barkodlu Antikorları ile Çoklama

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into ...

Tıp

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

-Omics Analizleri ve Birincil Hücre Kültürü için Yarasaların Doku Toplama

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Biyoloji

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and depth of this technology and extending it to the level of cells within the tissue is needed. Although the use of single nuclear and single cell RNA sequencing has become widespread, the expression signatures of cells obtained from tissue dissociation do not maintain spatial context. Laser microdissection (LMD) based on specific fluorescent markers would allow the isolation of specific structures and cell groups of interest with known localization, thereby enabling the acquisition of spatially-anchored transcriptomic signatures in kidney tissue. We have optimized an LMD methodology, guided by a rapid fluorescence-based stain, to isolate five distinct compartments within the human kidney and conduct subsequent RNA sequencing from valuable human kidney tissue specimens. We also present quality control parameters to enable the assessment of adequacy of the collected specimens. The workflow outlined in this manuscript shows the feasibility of this approach to isolate sub-segmental transcriptomic signatures with high confidence. The methodological approach presented here may also be applied to other tissue types with substitution of relevant antibody markers.

We describe a protocol for laser microdissection of sub-segments of the human kidney, including the glomerulus, proximal tubule, thick ascending limb, collecting duct and interstitium. The RNA is then isolated from the obtained compartments and RNA sequencing is carried out to determine changes in the transcriptomic signature within each sub-segment.

İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...