저자는 제임스 포 세 모든 videography 및 비디오 처리; 그의 뛰어난 작품에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 디지털된 가축 이미지;의 세대에 그의 뛰어난 작품에 대 한 마이클 마티 릴리 아는 발터에 대 한 그녀의 RNA 추출 및 Bioanalyzer 실행; 미치 파머와 도움이 검토 및 림프 노드 이미지;에 대 한 피드백에 대 한 칼 리 Kanipe 동물 보호 그리고 그들의 노력 및 축산 지원의 모든 국립 동물 질병 센터와 차례의 준비에서 수의 직원 들.

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다. 모든 연구는 농업의 미국 학과, 농업 연구 서비스에서 교내 자금 투자입니다. 특정 제품에 대 한 모든 참조 실험의 재현성을 위해 제공 되 고 연방 정부에 의해이 제품의 모든 지지를 대표 하지 않는다.

마우스, 쥐, 또는 사후 인간의 샘플 transcriptomic 연구와 관련 된 프로토콜의 대부분에 의하여 초점 있다. 그러나, 가축과 야생 동물에 대 한 조사는 인간의 보건에 모두에 적용 가능한 동물 용 의약품, 동물 매개 질병에 관한 질병에 면역 반응의 특성에 대 한 기회의 넓은 범위를 제공합니다. 이 프로토콜은 큰 동물, 가축, 들소, 염소, 양 등에서 높은 무결성 조직에서 RNA 추출에 대 한 주요 고려 사항에 대 한 개요를 제공합니다. 샘플 컬렉션에 대 한 조건 및 동물의 크기는 복구 마우스 림프 노드 복구에 대 한 보다 긴 사후 처리 시간으로 더 광범위 한 프로세스를 확인 합니다. 마찬가지로, 이러한 림프절의 대형 샘플을 대표 림프 노드 내에서 면역/병리학 변화 뿐만 아니라 다른 동물에서 병렬 샘플을 복구 하는 프로토콜을 필요로 합니다. 림프 노드의 단면에 따라 대표 프로필 뿐만 아니라 그대로 RNA의 복구에 대 한 샘플 컬렉션이이 프로토콜에 대 한 제안을 제공 합니다.
표준화 된 샘플링 전략 및 프로토콜의 중요성의 데모로 서, 여기에 제시 된으로 우리 가축 림프절의 transcriptomes 특징 PubMed 중앙 데이터베이스에서 25 종이 조사. 한 종이 큰 림프 노드 섹션의 처리를 한 번에 표시, 하나 특정 레이저 캡처 서 방법, 하나는 "견본" 림프 노드에서 수집 된 언급 고만 하나의 종이46 표시 그 림프절의 조각을 수집 (10 m m3 크기에서) 피 질과 수 질 지역 포함. 다른 논문 지적 작은 샘플 (일반적으로 30-100 mg) RNA 분석에 대 한 처리 했다, 그러나의 84%는 이러한 조직 조각 모음에 대 한 샘플링 전략을 언급 하지 않았다. 로 RNA 시퀀싱은 여전히 상대적으로 비싼, 림프 노드 당 여러 섹션의 분석은 생물 복제 샘플은 일반적으로 통계 분석에 대 한 우선 순위를 때문에 특히 대부분의 경우, 재정적으로 가능한 것 같다. Sagittally sectioned 림프절의 걸쳐 샘플을 수집 하 여 면역 세포의 종류에 풍부한 림프 노드 지구에서 RNA는 모든 샘플에서 캡처됩니다. 이 프로토콜 수 있습니다, 따라서, 림프 노드 transcriptomics에 대 한 문서화 및 재현성 샘플링 전략에 대 한 참조 역할을 합니다.
조직에서 RNA의 준비, 절차 상의 의사 결정에 대 한 여러 주요 단계가 있습니다. 첫째, 플래시 동결 조직 샘플 (및 후속 냉 온도 연 삭)의 사용 방법 론 적 문학 보존 솔루션 대 의 사용 측면에서 혼합입니다. 특히 큰 동물 necropsies 경우이 프로토콜 통합 보존 솔루션의 사용에 여러 잠재적인 절차 이점이 있습니다. 첫째, 조직 샘플을 액체 질소에 튜브를 즉시 전송 하지 않고도 보존 솔루션에 검 시 동안 저장할 수 있습니다. 둘째, 보존 솔루션 사용 샘플 또는 짧게 부분적으로 녹아서 균질 하기 전에 하는 경우에 특히 RNA 추출 위한 샘플 처리 하기 전에 추가 보호를 제공 됩니다. 그림 6A 에 결과이 보호 효과 림프절 조직에 확장을 나타냅니다. 반면, 플래시 동결 샘플 페 놀을 포함 하는 버퍼에 균질의 순간까지 냉동된 상태에서 유지 되어야 합니다. 마지막으로, 여기서 액체 질소는 쉽게 사용할 수, 큰 동물의 필드 차례의 샘플 수 수에 저장 보존 솔루션 실험실에 반환 될 수 있습니다 때까지.
여기에 제시 된 절차의 분자 분 대의 추가 이점은 초기 조직 처리, 살 균 제에서 샘플에 대 한 균질의에 어로 졸 생성 과정 역할 중 페 놀의 존재를 포함 감염 동물, 그리고 샘플에서 잔여 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 제거 하려면 스핀 열 절차의 사용. 대표 결과 입증 절차260/A280 와260/A230 비율 평가 높은-품질 RNA 생성 젤 전기 이동 법, 그리고 린 점수, 그리고 코스에 도전 하는 시간에 얼굴에 강력 가축 및 야생 동물 샘플링. 시는 페 놀 기반 약 (예를 들어, TRIzol), 그리고 실리 카 열 정화에 균질 조직 보존 (예를 들어, RNALater에), 쌍은 성공적으로 이용 되어 프로필에 양 진 식 패턴을 문학에 abomasal 임 파선 감염 위장 nematodes46 와 가축 림프절에는 herpesvirus47, 린 점수 8 보다 큰 및 모든 샘플에 걸쳐 7 보다 큰 각각 감염.
다운스트림 분석에 대 한 용납할 수 없는 린 점수 결과 RNA의 경우는 RNA 처리에 대 한 표준, 다음 변수를 평가 합니다: 총 처리 시간 게시물-부검, 조직, 처리 시간 지연의 상태 후, RNA 추출 및 RNA 처리 후 추출 하는 동안 기술 해 동. 총 처리 시간 사후 조직 발견 죽은 동물을 안락사에 반대 하는 동물에서 발견 한 경우 특히 평가 한다. 위에서 설명한 대로 RNA 림프절, 상대적으로 안정 하지만 처리에서 긴 지연 저하, 특히 불안정 한 녹취 록에 대 한 발생할 수 있습니다. 샘플은 서로 다른 양의 시간에 대 한 필드에 남아 있는 시체 사이 비교 하는 경우 혼란 시간 변수는 있을 수 있습니다. 조직의 조건 pathologic 변경 관련 감염 된 조직의 무결성의 저하는 RNA 안정성을 줄일 수 있기 때문에 평가 한다. 예를 들어 낮은 RNA 품질 세라의 placentome에서 관찰 되었습니다-감염 된 동물-낙태 (Boggiatto 그 외 여러분, 제출). 이 프로토콜에서 설명 된 대로 처리 시간/지연 후 재개 보존 솔루션의 사용에 의해 완화 됩니다. 조직 조각의 두께 적절 하 고 신속한 조직 ( 테이블의 자료에 언급 된 방부 제를 사용 하 여 < 5 m m 두께)으로 방부 제 솔루션의 침투를 허용 하도록 충분히 낮은 수 있습니다. RNA 추출 하는 동안 버퍼 RNase 무료 고 장갑 및 기타 연락처 오염된 항목 (RNases 피부에는) 피해 야 한다. 림프절 조직의 연 삭, 잠재적인 RNases의 가장 큰 원천, 조직에 있을 것입니다 하지만 절차의 모든 단계에서 오염 물질의 도입을 줄이기 위해 도움이 됩니다. 프로토콜에 설명 된 대로 RNA 게시물 추출, 처리, 약 RNA 수 샘플링 튜브로 냉동 고-80 ° C에서 저장 하기 전에 동결-해 동 품질 및 수량 분석을 위한 샘플을 필요에.
RNA 샘플의 저하에서 유래 뿐만 아니라 절차에 있는 수확량을 낮은, 림프절 조직 단계 4.3 프로토콜에서의 비효율적인 균질 때문일 수 있습니다. 비록 큰 파일럿 실행에서 효과적으로 해리 대부분 림프절 조직 이빨 회전자-stator dissociator 여기에 설명 된 RNA 보존 솔루션에서 외피 조직 (증가 딱딱한)의 질감을 변경할 수 있습니다 note. 페 놀 기반 시 약에 균질 이어야 한다 단계 4.3.1에서에서 설명 했 듯이, 분리 완료 되는 경우 반복. 박격포와 유 봉 연 삭,이 사양으로 균질 화기에 액세스 하지 않고 실험실에 대 한 또 다른 대안 이다 지상 샘플 페 놀 기반 시 약에의 한 물의 resuspension 다음. 그러나, 일회용 튜브에 균질 박격포와 유 봉, 더 가능 하 고 짧은 워크플로 여러 샘플 처리에 대 한 샘플 손실 연 삭 때의 부재를 포함 하 여 냉동된 조직을 분쇄 하는 데 여러 잠재적인 이점을 선물합니다 정리, 그리고 잠재적인 접촉 감염 된 동물에서 직물의 경우 전원 샘플.
아브라함 외. 48 28S와 18S 리보솜 RNAs의 낮은 복구와 마지막 RNA 제품에 큰 5S RNA 피크 (차례로, 림프 노드 처리에 대 한 수는 tiss의 불완전 한 분리로 인해 세포의 불완전 한 세포의 징조 수 있습니다 설명 ue)입니다. 그림 6B 소 선 림프 노드를 결합 조직에 매우 높은 효과적으로 균질 하지 않았다의 조각에서 생성 된 RNA 프로 파일의 예를 제공 합니다. RNA 수익률 계산 해야 하 고 샘플 분석 비슷한 복구 조직의 밀리 그램 당 가져온 RNA 시퀀싱에 의해 직접 비교를 위한 샘플 같은 균질을 사용 하 여 일괄 처리에서 처리 확인을 위해 집합에 걸쳐 모니터링 모든 샘플에 대 한 전략입니다. Note 쐐기 샘플링 접근도 피하는 광범위 한 결합 조직의 지역에 독점적으로 하는 샘플의 컬렉션에서 에이즈.

림프절의 transcriptome의 RNA 시퀀싱 분석 병원 체의 다양 한 동물의 면역 반응을 하 기회를 제공 한다. 이 방법론은 생쥐에서 광범위 하 게 이용 되어, 하는 동안 분석은 최근 큰 포유류1,2로 확대 되었습니다. 가축 또는 큰 동물 림프 노드 호스트 감염 뿐만 아니라 백신 또는 유전 자화 율 연구에 그들의 사용을 위해 그리고 인간 연구에 대 한 모델 시스템으로 서 뿐만 아니라 신약 개발에 대 한 대상의 식별에 대 한 응답 특성을 사용할 수 있습니다. 동물 매개 질병에. 예를 들어 brucellosis (동물 매개 세균성 질병 그 영향은 절반 백만 사람들이 전 세계 매년), 경우에 크게 증가 비용, 연구 양에서 또는 염소는 더 인간 감염 및 인간 백신 관련 실험실 동물 모델 보다 개발입니다. 마우스 감염 모델 정리 reticuloendothelial 시스템 감염 하지만 하지는 특징적인 임상 증상3.
실험실 동물 연구에 비해 큰 동물 실험에서 조직의 반드시 수확 과정 포함는 안락사의 보존에 대 한 잠재적인 도전을 선물 한다 조직 컬렉션 사이 긴 지연 높은-품질 한 RNA 그대로 RNA 생물학 관련 transcriptomic 데이터의 생성을 위해 필수적 이다. 조직 샘플에서 높은-품질 RNA의 생성은 특히 큰 동물 병원 체 연구에 대 한 중요 한 실시 제약 시설에서. 이러한 연구는 본질적으로 더 그들은 뿐만 아니라 시설 승인 및 고도로 훈련 직원 필요 하지만 상당한 금융 비용을 작업에 따라 수백 수천 달러의 수만에서 배열할 수 있다 수행를 수행 하기 어렵다. 이러한 유형의 연구는 또한 크로스-징계 협업 및 그들의 복잡성을 추가 하는 그들의 완성에 대 한 크로스-징계 지식을 포함 한다. 따라서,에 대 한 교육, 개발, 샘플 수집 및 보존에 대 한 효율적인된 시스템을 준수 하는 이득을 제공 한다 중요 한 조직의 다운스트림 분자 연구에 대 한 감염 된 동물에서.
큰 림프 노드의 컬렉션 murine 림프절의 유사한 샘플링에 비해 조직 컬렉션에 대 한 추가적인 도전을 선물 한다. 샘플 절단에 대 한 준비 관련 내부 구조를 포함 한 림프절의 해부학에 대 한 기본적인 이해를 필요로 합니다. 림프 노드의 구조는 림프 lobules sinuses 림프로 가득 둘러싸인 구성 됩니다. 이러한 구조는 거친, 섬유질 캡슐 포함. 4 림프 lobule "기본 해 부와 기능적인 단위 림프 노드의" 이며 낭, 깊은 외피 단위 및 골 수 코드와 sinuses4 (그림 1A)로 구성 됩니다. B와 T 세포는 각각 낭과 깊은 외피 단위에 가정. 이러한 구조 3D 비 계를 제공 하 고 있는 림프 톨 항 원 또는 항 원 제시 세포 사이 상호 작용 촉진.
조잡 한, 낭과 깊은 대뇌 피 질의 단위 확인할 수 있습니다 잘라 표면에 그들은 빽으로 채널을 포함 하 고 보다 더 섬세 한 망상 채널의 구성 되어 나타나고 라이터는 sinuses 표시 (그림 1B). 규칙에 따라 병리학 표면 피 질 (낭), paracortex (깊은 외피 단위)와 골 수 (골 수 코드와 sinuses) 림프절의 영역을 참조 하십시오. 모든 3 개의 영역의 적절 한 시험 간주 되었습니다 최고로 림프절5에 대 한 일상적인 병 적인 시험 지침에 연습. 참고 일관성, 크기, 및 단일 동물 내 에서도 림프절의 색상에 상당한 변이가 있다. 동물 나이, 그들의 림프절 크기 감소와 젊은 동물의 그들 보다는 더 확고 한 되, 일반적으로 그들의 결합 조직 및 림프 정상의 감소에서 증가로 인해6,7을 구조 하는 경향이 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg"> 그림 1. 림프절의 해부학. (A)이 만화 이미지 표시, 림프절의 해부학 키 구조를 묘사. (B)이 여전히이 이미지 횡단면으로 잘라 소 림프 노드를 보여 줍니다. 육안으로 볼 수 있습니다 관련 구조/레이어 강조 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
실험적인 질문에 따라 다른 림프절 수집 및 분석에 대 한 관심이 될 것입니다. 주변 림프절은 피하 조직에 깊이 있는. 가축, 주변 또는 표면 림프절 임상 및 실험 연습에서 자주 사용 한다 포함 귀 밑, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural)와 표면 사 타 구니 (supramammary 여성, 남성에서 음 낭에서) ( 그림 2)입니다. 표 1주요 표면 림프절의 속성 가축 시스템8에 설명 된 대로 설명 되어 있습니다. 아래 소의 세균성 전염병에 대 한 몇 가지 잠재적인 림프 노드 컬렉션 계획 조사에 대 한 시작 지점으로 제공 됩니다.
세라 abortus/세라 melitensis: 표준을 B. abortus위한 necropsies-가축 및 B. melitensis감염-감염 된 염소 국립 동물 질병 센터에서 supramammary, prescapular, 및 선 림프절 조직 복구 모두 호스트 RNA 식 프로 파일링에 대 한 RNA 준비를 위한 세균성 열거형에 대 한 분쇄. B. abortus 정기적으로 실험적으로 감염 된 가축9. 에 이러한 림프절의 각 재기 될 수 있다 B. melitensis에 이러한 림프 노드 형식 각각에 있는 박테리아의 존재를 검출 될 수 있다-우리의 연구 (Boggiatto 그 외 여러분, 미 출판)에서 RNA 기반 방법론을 사용 하 여 감염 된 후 적어도 9 개월까지 염소를 감염. 살 모 넬 라 sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), 그리고 mesenteric 림프절 살 모 넬 라 보급10,,1112 에 대 한 가축 시체를 프로 파일링 하는 동안 유용 하 게 되었습니다, transcriptomic 연구에 대 한 잠재적인 관심의 것입니다. E. 콜라이 O157:H7: (중간 소장 원심 소장 위치에서) Mesenteric 림프절 박테리아 감염 된 송아지 (에 감염 된 성인 가축)13의 가끔 회복의 사이트 수 있습니다. 렙 (Leptospira sp.): 박테리아의 만성 지 속성 유선14배출 림프절에서 관찰 되었습니다. 진 균 bovis : 가축, 박테리아 종 아리15의 mediastinal 및 tracheobronchial 림프절에서 복구 된 후 실험 감염 되었습니다. 또한, 림프절 RNA 돼지 재생산과 호흡 증후군 바이러스2등 큰 동물 호스트 응답을 검사 하 이용 되어 있다. 그림 2 는 가축 시체에서 이러한 주요 림프절의 하위 집합의 위치를 보여 줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg"> 그림 2: 선택 된 림프 노드 위치를 묘사 하는 만화 보스 토 러 스 . 번호가 매겨진된 림프절은 주석 처리 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 문서와 관련 된 비디오, 선물이 큰 동물 감염의 transcriptomic 연구에 관련 된 분자 생물학에 대 한 유익 하도록 설계 된 RNA 연구에 대 한 큰 동물 림프절의 격리에 대 한 프로토콜. 먼저, 우리 제공 격리 절차의 개요, 림프절에 대 한 예제로 소과 들소 조직에서 샘플링을 사용 하 여. 와 결합 하 여이 데모 비디오에 표시 된 대로, RNA 격리에 대 한 재현 조직 샘플링에 대 한 워크플로우가 이다. 다음, 우리는 감염 된 림프절, 안전, 일관성, 그리고 RNA 품질에 초점을 맞춘의 처리에 대 한 중요 한 고려 사항을 설명합니다.
산성화 페 놀 guanidine isothiocyanate 시와 조직에서 RNA의 준비 Chomczynski 및 Sacchi16,17, 실리 카 기반 스핀 열의 존재에 대해 정화의 원래 방법에 따라 Vogelstein 길18의 원래의 작품에 따라 chaotropic 대리인. 우리는 또한 transcriptomics에 대 한 대체 방법으로 보존 하는 가축 림프절에서 RNA의 복구에 대 한 가능성을 검사 합니다. 마지막으로, 우리는 안락사와 들소에서 복구 된 RNA 프로 파일에 샘플링 사이의 시간 증가의 효과 묘사 하는 대표적인 실험을 포함 하 여 큰 동물 necropsies에서 RNA 품질에 시간 변수의 영향을 탐구 하 고 소 림프 노드입니다. 이 문서 뿐만 아니라 분자 생물학 하지만 transcriptomic 연구를 개시 하는 또한 하 수의 연구자에 유용할 것 이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1239px;" width="1240">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">AM7020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:167px;">Daigger Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EF7281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps, rat tooth</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-460-117</td>
			<td>Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mm punch biopsy needles</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9949469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sharps container (small and transportable for necropsy)</td>
			<td style="width:167px;">Stericycle</td>
			<td style="width:119px;">8900SA</td>
			<td>1 qt. size shown here</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutting boards or disposable trays</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-002-24A</td>
			<td>Available in a variety of sizes, depends on user preference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal protective equipment</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12183018A</td>
			<td>Designed for up to 100 mg tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Ethanol (200 proof for molecular biology)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose (General, for gel electrophoresis)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">1X TBE</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP24301</td>
			<td>Can also make from scratch in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S4117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">114391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Xylene cyanol&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols)</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:787px;">FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">AM1975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Plastic spreader (L-shaped spreader)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-665-231</td>
			<td>Only needed for sterility testing for samples from infected animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Necropsy knives</td>
			<td style="width:167px;">Livestock Concepts</td>
			<td style="width:119px;">WI-0009209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species

큰 동물 (가축과 야생 동물) 동물 매개 병원 체, 세라, 진 균 bovis, 살 모 넬 라, 대장균, 등의 중요 한 공기 통으로 봉사 하 고 pathogenesis의 연구에 대 한 유용 및 자연 호스트에서 박테리아의 확산입니다. 호스트 면역 반응에서 림프절의 핵심 기능으로, 림프절 조직 역할을 다운스트림 transcriptomic 분석에 대 한 RNA의 감염의 과정을 통해 세포에 유전자 발현의 시간적 변화를 평가 합니다. 이 문서는 림프 노드 컬렉션, 조직 샘플링 및 다운스트림 RNA 아메리카 들소 (비 손 비 손에서에서 제공 하는 추가 예제와 함께 모델로, 가축 (보스 토 러 스)를 사용 하 여 가축, 처리 과정의 개요를 선물 한다 ). 프로토콜 시체의 위치, 식별 및 여러 주요 사이트에서 림프절의 제거에 대 한 정보를 포함합니다. 또한, 생 검 샘플링 방법론 여러 동물에서 샘플링의 일관성에 대 한 수 있도록 제공 됩니다. 샘플 보존에 대 한 몇 가지 고려 사항, RNA 시퀀싱 및 RT-PCR 같은 다운스트림 방법론에 대 한 적합 한 RNA의 생성을 포함 하 여 설명 합니다. 큰 동물 대 마우스 시간 과정 연구에 내재 된 긴 지연으로 인해 들소와 소 림프절 조직에서 대표적인 결과의 검토의 맥락에서이 조직 유형에 저하의 시간 과정을 설명 하기 위해 제공 됩니다. 다른 조직에서 RNA 저하에 이전 방법론 작동 합니다. 전반적으로,이 프로토콜은 유용 두 수의 연구에 큰 동물 샘플 transcriptome 프로젝트를 시작 하 고 분자 생물학 조직 샘플링 vivo에서 그리고 생체 외에서 처리 기법을 학습에 관심이 있을 것입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species at JoVE.

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비

이 프로토콜은 림프절 조직 식별 하 고 가축과 야생 동물, 샘플링 방법에서 림프절의 절단 단계를 포함 하 여 큰 동물에서의 프로 파일링 transcriptomic RNA의 격리에 대 한 절차의 개요를 제공 사후 수집 보존 및 RNA 분석 처리에 대 한 여러 동물, 그리고 고려 사항 플러스 대표 결과 걸쳐 일관성을 제공 합니다.

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.0K 조회수.  U.S. Department of Agriculture. 이 프로토콜은 림프절 조직 식별 하 고 가축과 야생 동물, 샘플링 방법에서 림프절의 절단 단계를 포함 하 여 큰 동물에서의 프로 파일링 transcriptomic RNA의 격리에 대 한 절차의 개요를 제공 사후 수집 보존 및 RNA 분석 처리에 대 한 여러 동물, 그리고 고려 사항 플러스 대표 결과 걸쳐 일관성을 제공 합니다.

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Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

연구

면역학 및 감염병학

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

위드 필드와 공촛점 현미경과 Murine 림프절의 조각에서 T 세포의 생체내 이미징 전

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine 외면적인 림프절 외과

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

에 의해 제작 상피 손상의 분석<em&gt; Entamoeba 아메바</em&gt; 감염

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...