著者はすべてのビデオ撮影とビデオ処理; 彼の素晴らしい仕事のためジェームズ ・ フォッシーを感謝したいです。デジタル化された牛のイメージの生成の彼の素晴らしい仕事のためのマイケル ・ マルティRNA の抽出と彼女の助けのリリア ヴァルターとバイオアナライザーの実行;ミッチ パーマーと彼らの役に立つレビューとリンパ節の画像上のフィードバックのカーリー Kanipe動物の世話とすべての彼らのハードワークと畜産の支援のための国立動物病センターで魚のための準備の獣医のスタッフ。

著者はある利益相反を開示します。すべての研究は、米国農務省農業研究サービスから学内資金資金を供給します。特定の製品に対するすべての参照は実験的再現性を目的として提供され、連邦政府によってこれらの製品の裏書を表さない。

トランスクリプトーム研究と関連プロトコルの大部分はマウス、ラット、または事後ひと試料に焦点を当てます。しかし、家畜や野生動物の調査は人間の公衆衛生獣医・人獣共通感染症については必要に応じて、両方の病気に免疫応答の評価の機会の広い範囲を提供します。このプロトコルは、牛、バイソン、ヤギ、羊などの大型動物から組織から整合性の高い RNA 抽出の重要な考慮事項の概要を提供します。サンプル コレクションのための条件と同様、動物のサイズに、回復マウス リンパ節復旧のためのより長い事後処理時間とのより詳細なプロセスです。同様に、これらのリンパ節の大きさは、リンパ節内で免疫学的・病理学的変化を代表するサンプルと同様に、さまざまな動物から並列の例の回復プロトコルを必要とします。このプロトコルではサンプルのコレクションのための提案は、リンパ節の区分に基づいて代表的なプロファイルはそのまま RNA 同様の回復を提供します。
標準化されたサンプリング方法とプロトコルの重要性の例としてここに示された家畜リンパ節のトランスクリプトームを特徴とする PubMed 中央データベースから 25 の論文を調査しました。1 つの論文に一度に大きなリンパ節のセクションの処理が示されている、1 つは特定のレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション法を説明した、「代表的なサンプル」はリンパ節が採取した言及と示される 1 つだけ紙46リンパ節の作品収集 (10 mm3サイズ) であることと、皮質と髄質の領域が含まれています。その他の論文は、小さなサンプル (通常 30-100 mg) が RNA 解析処理された指摘、論文の 84% はこれらのティッシュの部分のコレクションのためのサンプリング戦略を言及しなかった。として RNA シーケンスはまだ比較的高価、リンパ節ごとの複数のセクションの解析がレプリケート試料の統計解析の優先は通常、特に以来ほとんどの場合、財政的に実行可能である可能性が高い。矢断面化されたリンパ節のウェッジでサンプルを収集することにより、免疫細胞の種類の豊富なリンパ節領域からの RNA はすべてのサンプルでキャプチャされます。このプロトコルは、リンパ節トランスクリプトミクスの文書化され、再現可能なサンプリング方法の参照として使用できる、したがって、します。
組織からの RNA の準備、手続き型の意思決定に対して複数のキーのステップがあります。まず、方法論的文学保全ソリューション対の使用の面で混合はフラッシュ凍結組織サンプル (およびそれに続く低温研削) の使用。大型動物の魚の場合は特にこのプロトコルに組み込まれて、保存液の使用に複数の潜在的な手続き型の利点があります。まず、組織サンプルは、すぐにチューブを液体窒素に転送することがなく保存液で剖検時に格納できます。第二に、保存液の使用は、特にサンプル部分的または簡潔に均質化する前に解凍の場合 RNA 抽出のサンプル処理の前に追加の保護を提供します。図 6Aの結果は、リンパ節組織まで、この予防効果を示します。対照的に、フラッシュ凍結サンプルは、フェノールを含むバッファーの均質化の瞬間まで凍結状態で維持されなければなりません。最後に、液体窒素が容易に利用できない、大型の動物のフィールド腑分のサンプルに格納できる保存液までラボに復帰することができます。
ここに示す手順の分子の付加的な利点として消毒剤からのサンプルの均質化のエアロゾル生成過程初期の組織の処理中にフェノールを含んでください。感染動物や残留フェノールおよびイソチオ シアン酸グアニジンをサンプルから削除するスピン列プロシージャの使用。代表的な結果を示す手順260/A280と260/A230比により評価した質の高い RNA を生成しますし、ゲルの電気泳動および鈴スコアは時間コースに挑戦の面堅牢家畜と野生動物のサンプリング。フェノール系試薬 (例えばTRIzol)、および石英カラム精製で均質化 (例えばRNALater で)、組織保全のペアリングに羊の遺伝子発現パターンをプロファイルする文学で正常に利用されています。第四胃リンパ節消化管内線虫相46と牛リンパ節に感染感染ヘルペス ウイルス47、鈴スコア 8 以上とすべてのサンプルの間で 7 を超えるとそれぞれ。
RNA プロセシングのための標準は、次の変数を評価する下流解析のための容認できない凛スコアと結果 RNA の場合: 総処理時間の死体解剖、組織、処理待ち時間の条件後に解凍、RNA の抽出および RNA の処理ポスト抽出技術。合計処理時間事後動物動物の安楽死ではなく、死んでから回復した組織の場合は特に評価します。前述のように、RNA はリンパ節に比較的安定したが、処理に長時間の遅延が特に不安定な成績の低下につながる可能性が。交絡変数は時間の異なる量のフィールドに残っている死体のサンプルを比較する場合存在かもしれない。感染に伴う病理学的変化のための組織の整合性の劣化が RNA の安定性を低下させるため、組織の状態を評価されなければなりません。たとえば、下の RNA の品質は、ブルセラの placentome で観察されている-動物後中絶 (Boggiattoら、提出) を感染しています。処理遅延時間/解凍後は、このプロトコルで説明されているように保全ソリューションの使用によって軽減されます。ティッシュ部分の厚さが組織 (< 5 mm 厚材の表に記載されている防腐剤を使用して) に防腐剤のソリューションの迅速・適確な浸透を許可するように十分に低くできます。RNA 抽出時にバッファーは、RNase フリーする必要があります、手袋、他と接触 (RNases が皮膚に存在) 汚染された項目を避ける必要があります。リンパ節組織の研削用組織自体に潜在的な RNases の最大の源になりますが、手順のすべての段階での汚染物質の導入を減らすために有益です。プロトコルに記載されているとおりに RNA のポスト抽出を処理するには、因数 RNA を質と量の分析用試料を凍結融解する必要性を除去するために凍結し-80 ° C で保存する前にチューブにサンプリングします。
RNA サンプルの分解に起因以外の手順で利回りの低い、プロトコルの手順 4.3 でリンパ節組織の非効率的な均質化が原因であることができます。ほとんどリンパ節組織で大規模なパイロットの実行で効果的に解離歯ロータ ステータ分解ここで説明が RNA 保全ソリューションでインキュベーション組織 (増加硬さ) のテクスチャを変更することに注意してください。4.3.1 の手順で述べたように、フェノール ベースの試薬で均質化する必要があります繰り返すかどうか、解離は完了しません。モルタルと乳棒研削、これらの仕様を持つホモジナイザーにアクセスすることがなく研究所の別の代替は、フェノール ベースの試薬の粉砕の巻き上がりが続きます。ただし、使い捨てチューブの均質化、乳鉢と乳棒、複数のサンプルを処理するためのより実行可能な短いワークフローで、サンプル損失研削時の不在などで凍結するティッシュの研削仕上の複数の潜在的な利点、ないのクリーンアップ、および感染している動物からのティッシュの場合の動力を与えられたサンプルと潜在的な接触のないです。
アヴラハムら48は、28 s、18 s リボソーム Rna の回復が低いとペアになって、最終の RNA 製品の大規模な 5 s RNA のピークが (順番に、リンパ節の処理のため、tiss の不完全な解離に起因することができます細胞の不完全な換散のサインにあることを示すue)。図 6 bは、結合組織は非常に高かった、効果的に均一したないウシの耳下腺リンパ節の部分から生成される RNA プロファイルの例を提供します。RNA 利回りを計算し、分析組織の mg 当たり同じような回復が得られるし、RNA 配列による直接の比較のためのサンプルが同じの均質化を使用して、バッチで処理されることを確認するための一連のサンプル間で監視する必要があります。すべてのサンプルのための戦略。ウェッジ サンプリング アプローチが広範な結合組織の領域のみであるサンプルのコレクションを回避する上でもエイズに注意してください。

リンパ節のトランスクリプトームの RNA シーケンス解析は、様々 な病原体に動物の免疫応答を特徴付けるため機会を提供します。この方法は、マウスで広く利用されている、しながら解析最近大きい哺乳類1,2に拡大しています。ワクチンや遺伝的感受性の研究での使用、医薬品開発、人間の研究のモデル系としてもターゲットの同定だけでなく、感染する宿主反応を特徴付ける家畜・大型動物リンパ節を使用できます。人獣共通感染症。たとえば、ブルセラ症 (人畜共通細菌性疾患、影響 50万の人々 世界中毎年)、場合にもかかわらず大幅コスト、羊の研究の増加やヤギ、ヒトへの感染とワクチンに関連します。動物実験よりも開発。マウス感染モデル要約細網内皮のシステム感染がないの特徴的な臨床症状3.
実験動物学と比較して大規模な動物実験、必ずしも収穫組織のプロセスは、安楽死と保全の課題と潜在的な組織のコレクションとの間の遅延が長くなります高品質の RNA。そのまま RNA は生物学的に関連するトランスクリプトーム データの生成に不可欠です。組織サンプルからの高品質の RNA の生成は特に大きな動物病原体研究の重要で実施封じ込め設備。このような研究は施設を承認、高度訓練を受けた技術者を必要とするだけでなく、また、これは、作業に応じて、数百数千ドルの数十から範囲することができます重要な金融費用を運ぶように本質的により困難です。この種の研究は、分野横断的なコラボレーションと、完了すると、その複雑さに追加するための横断的知識もあります。したがって、トレーニングの開発とサンプル収集・保存のための合理化されたシステムへの付着大きなメリットをもたらします組織の下流の分子研究のため感染している動物から。
大きなリンパ節のコレクションは、マウスのリンパ節のようなサンプリングと比較して組織コレクションの追加課題を提示します。サンプルの切除のための準備は、関連する内部構造を含むリンパ節の解剖学の基本的な理解を必要とします。リンパ節の構造は、満ちているリンパ洞に囲まれたリンパ性小葉で構成されます。これらの構造は、堅い、繊維状のカプセルに含まれています。4リンパ性小葉は、「基本的な解剖学的および機能的な単位リンパ節」包、皮質深部ユニットと髄コードと副鼻腔4 (図 1 a) で構成されます。B および T リンパ球は、それぞれ卵胞と皮質深部の単位に家します。これらの構造は、3 D 足場を提供し、リンパ球と抗原抗原提示細胞の相互作用を容易にします。
肉眼的に, 卵胞と皮質深部単位上識別できること切断面と高密度細網の網目を含む副鼻腔はより繊細な細網網目から成るし、ライターが表示よりも暗く見えます (図 1 b)。慣例では、病理学者は浅野 (包), (皮質深部単位) 皮質髄質 (髄コードや副鼻腔) とリンパ節の領域を参照してください。すべての 3 つの地域の適切な検査はルーチン検査、病理組織学的リンパ節5指針の実践として最高と判断がされています。一貫性、サイズ、および 1 つの動物の中でも、リンパ節の色でかなり変動があることに注意してください。動物の年齢、サイズが小さくなり、若い動物のものより硬くなり、通常構造の結合組織と正常リンパ球の減少の増加のための6,7がちで、リンパ節。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg"> 図 1.リンパ節の解剖学。(A) この漫画のイメージは、キー構造を描いたリンパ節の構造を示します。(B) この画像は、断面カット牛リンパ節を示しています。関連する構造/レイヤーは肉眼に目に見えるが強調表示されます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
実験的質問によって収集および分析のための興味の別のリンパ節になります。末梢のリンパ節は、皮下の組織に深くあります。牛は臨床的および実験的練習でよく使用されます周辺機器または表在性のリンパ節、耳下腺、顎下腺、咽頭、prescapular、prefemoral (precrural) と浅鼠径 (女性、男性の陰嚢に supramammary) (図 2)。テーブル 1、キーの表在リンパ節のプロパティ牛のシステム8に示すとおりです。以下、牛の伝染性の細菌性疾患のいくつかの潜在的なリンパ節のコレクションの計画が、調査の出発点として掲載されています。
ブルセラ abortus/ブルセラ melitensis:菌の標準 necropsies-感染牛およびB. melitensis-国立動物病センターで感染した山羊 supramammary、prescapular、耳下腺リンパ節組織を回復、研磨細菌の列挙とホスト RNA 発現プロファイリングのための RNA の準備のための両方。実験感染牛9.でこれらのリンパ節のそれぞれで菌を定期的にリカバリできます。B. melitensisでこれらのリンパ節の種類ごとの細菌の存在を検出できる-私たちの研究 (Boggiattoら、未発表) から RNA ベースの方法を使用して、少なくとも 9 ヶ月後感染までヤギを感染しています。サルモネラsp: prescapular、subiliac (prefemoral)、腸間膜リンパ節は、プロファイリングのサルモネラの有病率10、11,12の家畜の死骸の中に有用されていると、トランスクリプトーム研究の潜在的な利益のでしょう。エシェリヒア属大腸菌 o157: h7: (中間の小腸と遠位側小腸場所) で腸間膜のリンパ節が細菌感染牛 (ただし感染の成牛ではなく)13の時折回復のサイトをすることができます。レプトスピラ症 (レプトスピラ sp.): 乳腺14リンパ節で細菌の慢性持続性が観察されています。ウシ結核菌: 細菌は牛、子牛15縦隔や気管気管支リンパ節から回復した後実験感染をされています。さらに、リンパ節の RNA はウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス2のように大きな動物宿主反応を調べるため利用されています。図 2は、牛の体のこれらの主要なリンパ節のサブセットの場所を示しています。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg"> 図 2:漫画で描いた内の選択したリンパ節の場所オオツノウシ. リンパ節の番号が付きます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
本稿および関連のビデオ、大型動物感染症のトランスクリプトーム研究に関与する分子生物学者のために有益であること、RNA 研究の大きな動物リンパ節の隔離のためのプロトコルを提案する.まず、我々 はリンパ節の例として牛、バイソンの組織からのサンプリングを使用して分離のプロシージャの概要を示します。ビデオに表示されるのこのデモでは、ペアになって、RNA の隔離のための再現可能な組織採取のワークフローです。次に、我々 は安全性、一貫性、および RNA の品質重視で、感染したリンパ節の処理のための重要な考慮事項をについて説明します。
酸性フェノール グアニジン イソチオ シアン酸性試薬による組織からの RNA の準備は、元 Chomczynski とサッキ16,17の存在下でのシリカ系スピン列浄化法に基づいてください。カオトロ Vogelstein、ガレスピーの18の原作に基づきます。トランスクリプトミクスの代替方式と保存牛リンパ節からのリカバリーの可能性も検討します。最後に、私たちは安楽死とバイソンから回復された RNA プロファイルのサンプリング時間の増加の影響を描いた代表的な実験を含む大規模な動物の魚で RNA の品質の時間変数の影響を探索し、牛のリンパ節。この記事は分子生物トランスクリプトーム研究を開始また、獣医学の研究にだけ役に立つでしょう。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1239px;" width="1240">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">AM7020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:167px;">Daigger Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EF7281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps, rat tooth</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-460-117</td>
			<td>Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mm punch biopsy needles</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9949469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sharps container (small and transportable for necropsy)</td>
			<td style="width:167px;">Stericycle</td>
			<td style="width:119px;">8900SA</td>
			<td>1 qt. size shown here</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutting boards or disposable trays</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-002-24A</td>
			<td>Available in a variety of sizes, depends on user preference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal protective equipment</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12183018A</td>
			<td>Designed for up to 100 mg tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Ethanol (200 proof for molecular biology)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose (General, for gel electrophoresis)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">1X TBE</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP24301</td>
			<td>Can also make from scratch in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S4117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">114391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Xylene cyanol&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols)</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:787px;">FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">AM1975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Plastic spreader (L-shaped spreader)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-665-231</td>
			<td>Only needed for sterility testing for samples from infected animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Necropsy knives</td>
			<td style="width:167px;">Livestock Concepts</td>
			<td style="width:119px;">WI-0009209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species

大動物 (家畜と野生動物の両方)ブルセラ、ウシ結核菌、サルモネラ菌、大腸菌を含む、人獣共通感染病原体の重要な貯水池として、機序の解明に便利です/または自然宿主の細菌の広がり。宿主の免疫応答におけるリンパ節のキー機能により、リンパ節組織は感染の過程で細胞における遺伝子発現の変化を評価するために下流のトランスクリプトーム解析のための RNA の潜在的なソースとして機能します。本稿ではリンパ節のコレクション、組織サンプリング、および下流の RNA、家畜処理モデルとしてウシ (Bos のトーラス) を用いた (バイソン バイソンのバイソンから提供されるその他の例のプロセスの概要).プロトコルには体内場所、識別、および複数の主要サイトからリンパ節の除去に関する情報が含まれます。また、生検の方法論が表示によりサンプリングの一貫性を保つのため、複数の動物の間でされます。RNA シーケンスと RT-PCR のような下流の手法に適した RNA の生成を含む、サンプル保存に関するいくつかの考慮事項を説明します。大動物対マウス時間コース研究に固有の長時間の遅延によりバイソンおよび牛リンパ節組織からの代表的な結果を表示してのレビューのコンテキストでこの組織型の劣化の経過を記述するには他の組織の RNA の分解の前の方法論的仕事。全体的に、このプロトコルは両方獣医研究者の大きな動物試料のトランスクリプトーム プロジェクトを開始し、分子生物学者組織サンプリング体内及び体外処理テクニックを学習に興味があるに役に立つでしょう。

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Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

このプロトコルは、大型動物の同定と家畜、野生動物、アプローチをサンプリングからリンパ節の切除の手順を含むリンパ節組織のトランスクリプトームのプロファイルの RNA の隔離のための手順の概要を提供します回収後保存と RNA 解析の処理のため、複数の動物と考慮事項プラス代表の結果に一貫性を提供します。

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

collection-processing-lymph-nodes-from-large-animals-for-rna-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.0K ビュー.  U.S. Department of Agriculture. このプロトコルは、大型動物の同定と家畜、野生動物、アプローチをサンプリングからリンパ節の切除の手順を含むリンパ節組織のトランスクリプトームのプロファイルの RNA の隔離のための手順の概要を提供します回収後保存と RNA 解析の処理のため、複数の動物と考慮事項プラス代表の結果に一貫性を提供します。

ビデオ: Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

鼠径リンパ節の生体顕微鏡

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

免疫・感染学

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

フローサイトメトリーによる肺および肺リンパ節の分析とマウスの非外科的気管内注入

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

広視野と共焦点顕微鏡によるマウスリンパ節スライスにおけるT細胞のex vivoでのイメージング

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

マウスの表在性リンパ節手術

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

プロデュース上皮損傷の解析<em&gt;赤痢アメーバ</em&gt;感染症

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

ネズミリンパ節間質細胞の単離

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

細胞内染色およびフローサイトメトリーは、高血圧のモデルにおけるマウス大動脈、腎臓及びリンパ節内のリンパ球サブセットを識別するために、

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...